CN110331192A - 与阿片类物质依赖相关的th基因snp位点的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法及其应用，本发明根据TH基因SNP位点rs10770140多态性与阿片类物质依赖(OD)的相关性，设计了用于扩增TH基因多态性位点所在序列片段的特异引物，并提供了包含该引物的SNP分型检测试剂盒及分型检测方法。本发明能够对rs10770140位点进行基因分型，方法简便、快速，结果准确、明了，为OD易感性鉴定提供了一个新的途径。

Description

与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法及其 应用

技术领域

本发明属于基因检测与分析领域，涉及与阿片类物质依赖(opioids dependence，OD)易感性相关的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)基因单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)位点rs10770140的分型检测及其应用。

背景技术

药物依赖是一种以强迫觅药及对药物持续渴求为特点的慢性复发性脑疾病，对个人和社会造成严重危害。阿片类物质是从罂粟植物中提取的生物碱及衍生物，其中，吗啡是目前临床上最有效的镇痛药，临床中晚期癌症患者使用吗啡镇痛的人数每年以1300万左右的数量增长，但因其显著依赖性和耐受性，临床应用受到诸多限制，而阿片类处方药也成为非医疗性药物滥用的首要目标，最近三年美国正遭受日益严重的阿片药物滥用危机。因此，鉴别阿片类物质依赖的易感人群对于临床阿片类镇痛药合理使用具有非常重要的意义。

关于药物依赖的脑神经生物学机制目前尚不十分清楚，但有大量证据证实阿片类药物依赖存在显著的遗传因素，是基因遗传易感性与环境影响共同作用的结果。近年来，关于基因多态性在药物依赖中的作用受到越来越多的关注。基因多态性是指同一种群内个体与个体间基因核苷酸序列存在的差异性，即在一个随机婚配的生物群体中染色体同一基因位点上存在两种以上不连续的基因型，基因多态性所致编码的相应氨基酸改变可决定个体对疾病的易感性及表型差异。

阿片类物质依赖的产生与脑内多巴胺奖赏系统密切相关，而单胺能神经递质系统的相关基因对奖赏系统具有重要的调控作用，故这类基因成为研究阿片类物质依赖的重要候选基因。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是多巴胺及其他儿茶酚胺类神经递质合成的起始酶及限速酶，决定着多巴胺以及儿茶酚胺合成的速率，在哺乳类动物中枢神经系统及周围神经系统中发挥着重要作用。现阶段有关TH基因在神经系统上的研究主要集中于高血压、帕金森、躁郁症以及精神分裂症的形成机制上，而关于TH基因与药物依赖特别是阿片类物质依赖的相关研究却鲜有报道。

迄今，随着高通量、高精准度DNA研究技术的不断发展，与药物成瘾相关的分子遗传机制研究也快速发展，不断有研究报道新的候选基因；目前对TH基因内rs10770140位点的多态性的研究只见于高血压形成机制的相关报道中，而rs10770140位点与阿片类物质依赖的关系目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，包括以下步骤：

以待测个体(例如，受试人)基因组DNA为模板，PCR扩增TH基因片段，对扩增得到的片段进行测序，根据测序结果确定TH基因SNP位点rs10770140的等位基因类型或基因型。

优选的，所述基因组DNA提取自体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝脏组织、皮肤组织、肌肉组织)、毛发等生物样品。

优选的，所述TH基因片段位于人类基因组chr11.2172249-2172504，序列中第119位为SNP位点rs10770140的对应碱基位置。本发明通过dbSNP数据库与基因组比对，发现TH基因rs10770140位点两端突变较多，其引物设计难度较大。因此本发明在rs10770140位点两端选定区域，根据该区域设计了特异性核酸引物，增加了扩增产物的准确性，可更好的扩增不同受试人的SNP位点rs10770140。

优选的，通过前期的多次实验，确认了扩增效果最佳的含有兼并碱基的引物，其中，上游引物如SEQ.ID.NO.2所示，下游引物如SEQ.ID.NO.3所示。

优选的，所述PCR的反应体系包括10μM上、下游引物各1μL，以及50ng/μL模板DNA 1μL。

优选的，所述PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸1min，共45个循环；72℃延伸5min。

优选的，所述测序采用TA克隆测序法。PCR为体外扩增，碱基突变机率非常大，TA克隆后的质粒转入大肠杆菌中，利用菌体自身的修复机制可以保证克隆的单一性，利于筛选需要的序列。

优选的，所述SNP位点rs10770140的等位基因为T和C。

上述与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法在治疗疼痛的新药开发中的应用。

上述与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点rs10770140在制备用于筛查阿片类物质(例如，吗啡)依赖易感性的试剂盒以及在制备阿片类物质依赖的早期诊断试剂盒、基因治疗试剂盒中的应用。

一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的基因分型检测试剂盒，该试剂盒包括用于扩增包含TH基因SNP位点rs10770140的序列片段(例如，以上位于人类基因组chr11.2172249-2172504的片段)的引物对(例如，SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的引物)。

优选的，所述试剂盒还包括用于对扩增产物进行TA克隆测序的试剂。

优选的，提取受试人基因组DNA并通过测序获得SNP位点rs10770140的基因型，所述基因型为C/C的个体具有明显的阿片类物质依赖易感性，基因型为T/T的个体不具有阿片类物质依赖易感性。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)基因SNP位点rs10770140多态性与阿片类物质依赖的相关性，结合PCR扩增及TA克隆测序技术，提供可检测该TH基因SNP多态性位点的分型试剂盒及分型检测方法，能够对rs10770140位点进行简便、快速的基因分型，分型结果准确、明了，为OD易感性鉴定提供了一个新的途径，应用前景广泛。

附图说明

图1为不同受试者扩增产物电泳图谱：参照左侧Marker(125bp、250bp、375bp、500bp、750bp、1000bp、1250bp、2000bp)泳道，扩增产物大约为270bp。

图2A为受试者测序结果图：T/T型。

图2B为受试者测序结果图：C/T型。

图2C为受试者测序结果图：C/C型。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，所述实施例是对本发明的解释，而非对本发明保护范围的限制。

本发明对SNP位点rs10770140的序列进行研究，通过提取人基因组DNA，测定受试者TH基因rs10770140多态位点的基因型，发现该多态位点与受试者对OD易感性密切相关：TH基因rs10770140多态位点的基因型为C/C纯合子时，受试者的易感性最高；TH基因rs10770140多态位点的基因型为C/T杂合子时，受试者的易感性较高；TH基因rs10770140多态位点的基因型为T/T纯合子时，受试者的易感性最低。基于以上发现，本发明提出一种阿片类物质依赖(OD)易感性相关的OD高危人群筛查方法及筛查试剂盒。

(一)血液样本收集和基因组DNA的提取

本发明实验组包括了中国西安精神卫生中心美沙酮维持治疗计划中登记的556名非相关阿片类药物(例如，吗啡等)成瘾者，对照组由600名从未被诊断出药物滥用和精神疾病的无关健康人士(健康对照)组成。所有受试者均为汉族，签署知情同意书，并采集外周静脉血样(时间为2014年6月)。实验也得到申请人所在单位伦理委员会批准。

根据下列方法，用受试者外周血制备人基因组DNA：

(1)将1mL抗凝贮冻血液于室温解冻后移入离心管中，加入1mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)，混匀，12000rpm离心10min(4℃)，倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。

(2)用500μL DNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h，加入10mg/mL蛋白酶K10μL，上下转动混匀，液体变粘稠。56℃水浴过夜，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

(3)第二天，反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。12000rpm离心10min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，上下转动混匀，12000rpm离心10min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复氯仿:异戊醇抽提一次。

(4)加0.1倍体积的3mol/L醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻倒置混匀，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5mL离心管中，加70％乙醇500μL，以12000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复洗涤一次。室温挥发残留的乙醇。加TE液50μL溶解DNA，置于摇床平台缓慢摇动，至DNA完全溶解。制成的DNA溶液(DNA浓度约为50ng/μL)于-20℃冰箱保存备用。

(二)SNP的识别确定

根据SNP的序列信息，设计PCR反应引物，并在生物工程(上海)有限公司合成。合成后的引物与样品DNA进行PCR反应，扩增后的反应产物进行TA克隆测序，确定SNP基因型。具体实验流程如下：

(1)引物设计：依据dbSNP数据库与基因组相比对结果，对rs10770140位点(chr11.p12.2172367.(GRCh38))两端突变较少区域(chr11.p12.2172249-2172504)设计兼并碱基引物，得到特异性核酸引物(引物设计完成于2019年3月)：

上游引物：5`-GCTTCTCSAGAAGATTCCAG-3`(参见SEQ.ID.NO.2)；

下游引物：5`-AACMCTGGTGGGGACTGTGATG-3`(参见SEQ.ID.NO.3)；

(2)PCR反应：

(2.1)PCR反应液(Mix)：按照表1中的顺序依次加入，放入ABI9700PCR仪中进行PCR扩增。

表1.PCR反应体系

其中，2×PCR Master Mix货号为Beyotime D7228

(2.2)ABI9700 PCR仪循环参数：

表2.PCR反应程序

(3)采用SanPrep胶回收试剂盒(SK8132)对PCR产物回收纯化

1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开(图1)，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中，称重。

2)根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖凝胶块加300～600μL的比例加入Buffer B2。

3)将离心管置于50℃水浴5～10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。

4)加入所使用的Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀。

5)将溶液全部移入吸附柱，8000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

6)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

7)重复步骤6一次。

8)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。

9)在吸附膜中央加入15～40μL Elution Buffer，室温静置1～2min，9000g离心1min。

将所得到的浓度约为40ng/μL的DNA溶液置于-20℃保存。其中的DNA为纯化得到的TA克隆的目的片段。

(4)采用零背景TOPO-TA克隆试剂盒(Hieff Clone^TM Zero TOPO-TA Cloning Kit)对目的片段进行TA克隆

1)按照表3配制连接体系(以10μL为例)

表3.连接体系

其中，Enhancer、pESI-T vector来自Hieff Clone^TM Zero TOPO-TA Cloning Kit

2)混匀上述体系，于室温(20-30℃)反应5min。

3)全量10μL加入100μL大肠杆菌感受态细胞(Rapid Competent Cell Preps Kit制备)，轻轻混匀，室温放置5min。

4)加300-500μL LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃、180rpm振荡培养10min。

5)取200μL菌液涂板(含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基)，培养过夜。

6)一个样本挑取20个单菌落转化子，进行接种。

(5)采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒

1)在含氨苄抗性的LB或SOC培养基中接种上述目标转化子，于37℃摇床充分振荡培养12-16h。

2)取1.5-5mL菌液，于室温，8000g离心2min收集菌体，倒尽或吸干培养基。

3)在菌体沉淀中加入250μL Buffer P1，吸打或振荡至菌体悬浮。

4)加入250μL Buffer P2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min。

5)加入350μL Buffer P3，立即温和颠倒离心管5-10次充分混匀。

6)于离心机最大转速(≥12000g)离心5-10min，将上清全部移入吸附柱，9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管。

7)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

8)重复步骤8一次。

9)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。

10)在吸附膜中央加入50-100μL Elution Buffer，室温静置1-2min，9000g离心1min。将所得到的质粒DNA溶液，(浓度一般为50-100ng/μL)置于-20℃保存或用于后续试验。

(6)阳性克隆子的鉴定

质粒用PstI单酶切，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定含有目的片段。

(7)PCR测序反应及测序结果分析

1)PCR测序反应

a)取0.2mL的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按表4加试剂：

表4.测序反应体系

盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。其中，M13(-26)为上海生工通用引物，M13(-26)引物序列：5`-CAGGAAACAGCTATGAC-3`(SEQ.ID.NO.4)。

b)将PCR管置于BBI PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

2)醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物

a)将扩增得到的混合物离心，将扩增产物转移到1.5mL EP管中。

b)加入25μL醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min，4℃离心30min，弃上清。

c)加70％(V/V)的乙醇50μL洗涤沉淀2次。12000r/min，4℃离心5min，弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10-15min。

3)电泳前测序PCR产物的处理

a)加入12μL的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

b)将溶液转移至盖体分离的0.2mL PCR管中，稍离心。

c)在PCR仪上进行热变性(95℃2min)，冰中骤冷，待上机。

4)上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器自动分析、打印出彩色测序图谱。

5)仪器自动进行序列分析，进行序列比较。

6)可通过NCBI数据库中参考基因组序列比较，以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

7)测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

某受试者的测序结果如下(SEQ.ID.NO.1)：

5`-GCTTCTCCAGAAGATTCCAGGCCGTGTGTCTCATAGACGTGGTTCCTAGGAGTGCCATCTGCCCACAGCCCCCGGGCCCTGCAGGTGTGGCCCTTGCAGCGGCTTCCCAAGCTCGCCC[C/T]GTGGGGTCCAGAATGTCCCAGGAGGGCCCACCTGTCCAGTGTGGAGGACCCTGGGAGGCTGAAGAAGACATCTCTAAGGAGACGCCACGCGTTTCCAAATGGCTGCCACCTCCTGCATCACAGTCCCCACCAGGGTT-3`

序列(SEQ.ID.NO.1)中119位碱基为rs10770140多态位点(C/T)。不同受试者的测序结果参见图2A、图2B、图2C。

(8)结果判定

根据上述测序结果，对TH基因的rs10770140位点(测序结果上为第120位碱基，TA克隆引入一个碱基)进行验证。20例TA克隆测序结果中，如果rs10770140位点均为C或T，说明此受试人员属于纯合子，即rs10770140位点为C/C或T/T型；如果rs10770140位点检测结果为C与T并存，且任意一方大于等于2例，说明此受试人员属于杂合子，即rs10770140位点为C/T型。

(三)TH基因rs10770140 SNP位点与OD的相关性

统计方法：利用SPSS 18.0软件中Pearson卡方检验计算TH基因rs10770140位点的基因型频率，Hardy-weinberg平衡检测，统计学的显著性水平设定为P<0.05。采用单因素Logistic回归分析计算TH基因rs10770140位点的患病(OD)风险0R值及其95％置信区间(CI)。具体结果如下：

1)健康对照组TH基因rs10770140位点多态性分布

按(一)、(二)中方法测定600名健康对照个体的基因多态性，发现有506名个体为T纯合子(84.3％)，92名个体为C和T的杂合子(15.3％)，2名个体为C的纯合子(0.3％)。

2)OD组TH基因rs10770140位点多态性分布

按(一)、(二)中方法测定556名OD患者个体基因多态性，发现有430名个体为T纯合子(77.3％)，121名个体为C和T的杂合子(21.8％)，5名个体为C的纯合子(0.9％)。

OD病例组和健康对照TH基因rs10770140位点C/T多态性的频率分布详见表5。

表5.中国汉族人TH基因rs10770140位点与OD易感性的关联分析

由表5可见，TH基因SNP位点(rs10770140)为T/C多态性位点，在OD患者群体中的基因型分布频率与健康对照有显著差别(P＝0.008)，等位基因频率与健康对照亦有显著差别(P＝0.002)。rs10770140位点基因型为C/C的个体为OD易感人群，rs10770140位点基因型为T/T的个体为OD非易感人群。

与OD显著相关的SNP位点rs10770140位于TH基因外显子，可能通过引起TH基因表达的改变，影响蛋白质的一级结构，因此，rs10770140是OD患者群体中的一个较高风险的易感基因位点。

(四)OD高危人群筛查试剂盒

试剂盒包括序列如SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3所示的特异性核酸扩增引物。还包括序列如SEQ.ID.NO.4的通用测序用引物。

所述的试剂盒还包括上述(一)、(二)所用到的标准试剂及试剂使用的说明书：利用该试剂盒扩增样本的DNA；然后进行TA克隆测序；根据测序结果进行SNP位点rs10770140分型结果判定。

实验表明：本发明的检测方法可用于特异、高效分析人染色体11p15.5 TH基因的rs10770140位点T/C多态性，分析结果可应用于对OD的辅助性诊断和对个体OD患病风险进行评估，以利于开展OD的早期干预和治疗。

本发明的进步意义：

(1)根据本发明提供的引物序列可以特异、高效检测出多态性位点，只需要少量DNA样品就足以测定TH基因SNP(rs10770140)位点的多态性。

(2)本发明根据检测rs10770140位点的基因分型结果判定OD易感人群的方法，为OD易感基因的揭示、OD的早期诊断和基因治疗提供重要的理论的依据。

(3)本发明建立的检测与OD相关的TH基因rs10770140位点的多态性的方法和试剂盒，具有高的灵敏度、特异性。

(4)利用本发明阐述TH基因rs10770140位点碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节TH表达的活性分子，促进临床治疗疼痛的新药开发。

<110> 西安交通大学

<120> 与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 256

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gcttctccag aagattccag gccgtgtgtc tcatagacgt ggttcctagg agtgccatct 60

gcccacagcc cccgggccct gcaggtgtgg cccttgcagc ggcttcccaa gctcgcccyg 120

tggggtccag aatgtcccag gagggcccac ctgtccagtg tggaggaccc tgggaggctg 180

aagaagacat ctctaaggag acgccacgcg tttccaaatg gctgccacct cctgcatcac 240

agtccccacc agggtt 256

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcttctcsag aagattccag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aacmctggtg gggactgtga tg 22

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

caggaaacag ctatgac 17

Claims (10)

1.一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

以待测个体基因组DNA为模板，PCR扩增TH基因部分片段，对扩增得到的片段进行测序，根据测序结果确定个体TH基因SNP位点rs10770140的等位基因类型或基因型。

2.根据权利要求1所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：所述TH基因部分片段对应于参考基因组序列chr11.2172249-2172504。

3.根据权利要求1所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的扩增引物如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

4.根据权利要求1所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：所述测序采用TA克隆测序法。

5.一种如权利要求1所述的检测方法在治疗疼痛的新药开发中的应用。

6.一种TH基因SNP位点在制备用于筛查阿片类物质依赖易感性的试剂盒以及在制备阿片类物质依赖的早期诊断试剂盒、基因治疗试剂盒中的应用，其特征在于：所述SNP位点为rs10770140。

7.一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的基因分型试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增包含TH基因SNP位点rs10770140的序列片段的引物对。

8.根据权利要求7所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的基因分型试剂盒，其特征在于：所述引物对的引物序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

9.根据权利要求7所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的基因分型试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于对扩增产物进行TA克隆测序的试剂。

10.根据权利要求7所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的基因分型试剂盒，其特征在于：所述SNP位点rs10770140的基因型为C/C的个体具有阿片类物质依赖易感性，基因型为T/T的个体不具有阿片类物质依赖易感性。