CN110302171A - 一种瘤内注射用sn-38-plga缓释微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种瘤内注射用sn-38-plga缓释微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种瘤内注射用SN‑38‑PLGA缓释微球及其制备方法和应用，本发明以SN‑38为模型药物，PLGA为载体材料，采用乳化‑溶剂挥发法成功构建了一种可供瘤内注射给药的SN‑38‑PLGA缓释微球，所述SN‑38‑PLGA缓释微球具有表面光滑圆整、粒径适中、包封率和载药量高等优点，同时本发明的瘤内注射用SN‑38‑PLGA缓释微球能够使SN‑38在瘤区长时间维持有效高浓度，有效避免SN‑38药物的失活，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前，癌症的发病率和死亡率都在逐年上升，给人类健康和生命造成严重威胁和挑战。其发病过程极为复杂，遗传、环境甚至饮食习惯及心理负担等因素都在其中扮演着相当重要的角色。近年来，随着药理学、药剂学、分子生物学及药用器械的发展，癌症的治疗已取得不断突破。然而，遗憾的是，目前很多人对癌症筛查还不够重视，多数癌症在初次诊疗时已处于晚期。化疗在癌症控制和治疗中占据重要地位。但化疗药物在全身给药时由于缺乏选择性使得其在达到治疗目的的同时给患者带来了严重的毒副作用，为此，直接靶向病灶的瘤内注射给药方式逐渐成为一种越来越受关注的给药途径。
伊立替康作为一种广谱抗癌药，对多种癌细胞均具有较强的抑制作用，但它须在羧酸酯酶作用下转变为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)后方可显示抗肿瘤效果，不幸的是，该转化效率仅有2％到8％，不能被高效利用在一定程度上造成了极大的浪费。
而且，SN-38的活性虽然很高(有研究指出，SN-38治疗效果约是其前药伊立替康的1000倍)，但是其本身的一些化学以及药理作用特点限制了其在临床上的应用：首先，SN-38的溶解性很差，在水中几乎不溶(11-38μg/ml)，因此成药性差，迄今为止未开发出成功的SN-38制剂；其次，SN-38的E环内酯环结构具有可逆的pH依赖型水解作用，在酸性条件下E环能保持稳定的内酯环结构，而在碱性条件下E环会迅速开环形成羧酸盐结构，从而导致SN-38失去抗肿瘤活性，而人生理条件是偏碱性的，这一特性也限制SN-38在抗肿瘤方面的应用。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球及其制备方法和应用，本发明以SN-38为模型药物，PLGA为载体材料，采用乳化-溶剂挥发法成功构建了一种可供瘤内注射给药的SN-38包覆的PLGA微球，所述SN-38-PLGA缓释微球具有表面光滑圆整、粒径适中、包封率和载药量高等优点，同时本发明的瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球能够使SN-38在瘤区长时间维持有效高浓度，有效避免SN-38药物的失活，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一种瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球的制备方法，所述制备方法如下：
(1)将SN-38与聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)共溶于由二氯甲烷与二甲基亚砜组成的混合溶液中，溶解形成有机相；
(2)将聚乙烯醇溶液(水相)加入到有机相中，高速剪切形成初乳；
(3)将初乳注入到聚乙烯醇溶液(分散相)中，室温下搅拌使二氯甲烷挥发完全，得到微球的聚乙烯醇混悬液。
其中，所述步骤(1)中，
SN-38与PLGA的质量比(即药脂比，w/w)为1:5～20(优选为1:10)；
所述PLGA的浓度为40～160mg/mL(优选为80mg/mL)；
其中，所述步骤(2)中，
所述初乳中油相与水相的体积比1:1～8(优选为1:3)；
所述水相中的聚乙烯醇浓度为0.5～2％(优选为1.5％)；
剪切速度控制为5000～20000r/min(优选为5000r/min)；
剪切时间为0.5～2min(优选为1min)；
其中，所述步骤(3)中，
所述初乳中水相与分散相的体积比1:3～10(优选为1:5)；
所述分散相中聚乙烯醇浓度为0.1～1.0％(优选为0.5％)，
进一步的，所述制备方法还包括将步骤(3)中含有微球的聚乙烯醇混悬液进行离心，去上清液，使用蒸馏水分散，离心去上清，连续水洗2～3次即得瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球。
更进一步的，所述离心转速为7000～9000r/min(优选8000r/min)，离心时间为7～15min(优选10min)。
进一步的，所述制备方法还包括将上述瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球加入蒸馏水分散均匀后，加入甘露醇作为冻干保护剂，采用低温冷冻干燥法制备干燥微球。
更进一步的，所述甘露醇浓度为1～5％(优选为4％)；
更进一步的，所述低温冷冻干燥法具体包括：-80℃预冻12h，然后置于-50℃条件下，冻干24h。
本发明的第二个方面，提供上述制备方法制备得到的瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球。采用本发明制备方法制备得到的瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球平均粒径为10.02±0.05μm；包封率为81.91±1.91％；载药量为6.89±0.07％。
本发明的第三个方面，提供瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球在制备肝靶向抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明直接以SN-38作为模型药物，有效解决了伊立替康的低转换率问题，提高了药物利用率，同时选用生物相容性和生物可降解性均较好的递送材料将活性药物包裹成功制备了瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球，所制备的微球表面光滑圆整、粒径适中、包封率和载药量高，具有良好的应用前景；
(2)本发明通过瘤内注射给药的方式将载药微球直接靶向于病灶，同时依靠微球的缓释长效定位作用，使药物缓慢释放，降低向体循环的渗漏，从而可以减少给药次数，提高患者的顺应性，为瘤内局部给药治疗探索了新的思路和手段，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中剪切速度的影响结果图；
图2为本发明实施例1中剪切时间的影响结果图；
图3为本发明实施例1中PLGA浓度的影响结果图；
图4为本发明实施例1中药脂比的影响结果图；
图5为本发明实施例1中PVA浓度的影响结果图；
图6为本发明实施例1中初乳中油相与水相体积比的影响结果图；
图7为本发明实施例1中水相与分散相体积比的影响结果图；
图8为本发明实施例1中不同浓度甘露醇的微球形态图；
图9为本发明实施例1中SN-38-PLGA-MS外观性状照片(图9(A)和图9(a):冻干前；图9(B)和图9(b)：冻干后,图9(C)和图9(c)：复溶后)；
图10为本发明实施例1中SN-38-PLGA-MS外观微观系列图，其中，图10(A)和图10(B)为SN-38-PLGA-MS在光学显微境下的照片；图10(C)和图10(D)为SN-38-PLGA-MS在超景深显微境下的照片；图10(E)和图10(F)为SN-38-PLGA-MS在扫描电子显微境下的照片；
图11为本发明肿瘤组织中SN-38浓度随时间变化关系图(n＝3)；
图12为本发明血浆中SN-38浓度随时间变化关系图(n＝3)；
图13(A)为本发明肿瘤体积随时间变化的曲线图(n＝8)，数据表示为平均值±SD；图13(B)18天后小鼠肿瘤体积的统计学分析图，##P﹤0.01、***P﹤0.001表示与NS组相比具有显著性差异；
图14(A)为本发明小鼠体重随时间变化的曲线图(n＝8)，数据表示为平均值±SD；图14(B)18天后小鼠体重的统计学分析图，**P﹤0.01表示与空白组相比具有显著性差异。
图15为本发明18天后小鼠肿瘤重量的统计学分析，**P﹤0.01、***P﹤0.001表示与NS组相比具有显著性差异；###P﹤0.01表示比SN-38-Sol组相比具有显著性差异；
图16为本发明不同制剂瘤内注射给药后的肿瘤病理切片显微照片(10х10)；
图17为本发明不同制剂瘤内注射给药后主要脏器的病理切片显微照片(10х10)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，SN-38的活性虽然很高(有研究指出，SN-38治疗效果约是其前药伊立替康的1000倍)，但是其SN-38的溶解性很差且在偏碱性环境中容易开环失去活性，限制SN-38在抗肿瘤方面的应用。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供的一种瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球的制备方法，所述制备方法如下：
(1)将SN-38与聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)共溶于二氯甲烷与二甲基亚砜组成的混合溶液中，溶解形成有机相；
(2)将聚乙烯醇溶液(水相)加入到有机相中，高速剪切形成初乳；
(3)将初乳注入到聚乙烯醇溶液(分散相)中，室温下搅拌使二氯甲烷挥发完全，得到微球的聚乙烯醇混悬液。
本发明的又一具体实施方式，所述步骤(1)中，
SN-38与PLGA的质量比(即药脂比，w/w)为1:5～20(优选为1:10)；
所述PLGA的浓度为40～160mg/mL(优选为80mg/mL)；
本发明的又一具体实施方式，所述步骤(2)中，
所述初乳中油相与水相的体积比1:1～8(优选为1:3)；
所述水相中的聚乙烯醇浓度为0.5～2％(优选为1.5％)；
剪切速度控制为5000～20000r/min(优选为5000r/min)；
剪切时间为0.5～2min(优选为1min)；
本发明的又一具体实施方式，所述步骤(3)中，
所述初乳中水相与分散相的体积比1:3～10(优选为1:5)；
所述分散相中聚乙烯醇浓度为0.1～1.0％(优选为0.5％)，
本发明的一个具体实施方式中，所述制备方法还包括将步骤(3)中含有微球的聚乙烯醇混悬液进行离心，去上清液，使用蒸馏水分散，离心去上清，连续水洗2～3次即得瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球。
本发明的一个具体实施方式中，所述离心转速为7000～9000r/min(优选8000r/min)，离心时间为7～15min(优选10min)。
本发明的一个具体实施方式中，所述制备方法还包括将上述瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球加入蒸馏水分散均匀后，加入甘露醇作为冻干保护剂，采用低温冷冻干燥法制备干燥微球。
本发明的一个具体实施方式中，所述甘露醇浓度为1～5％(优选为4％)；
本发明的一个具体实施方式中，所述低温冷冻干燥法具体包括：-80℃预冻12h，然后置于-50℃条件下，冻干24h。
本发明的一个具体实施方式中，提供上述制备方法制备得到的瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球。采用本发明制备方法制备得到的瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球平均粒径为10.02±0.05μm；包封率为81.91±1.91％；载药量为6.89±0.07％。
本发明的一个具体实施方式中，提供瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球在制备肝靶向抗肿瘤药物中的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1实验材料
1.1药品与试剂
实验中所使用的主要药品与试剂见下：
1.2主要仪器
实验中所使用的主要仪器见下：
2实验方法
2.1基本处方
2.2基本工艺
首先，将处方量的SN-38与PLGA共溶于0.5mL由二氯甲烷与二甲基亚砜(4:1)组成的混合溶液中，涡旋并超声使其充分溶解形成有机相。其次，将2.5mL浓度为0.5％(W/V)的聚乙烯醇溶液(水相)加入到有机相中，高速剪切(5000rpm)1min，形成初乳。然后，立即将初乳注入到7.5mL浓度为0.5％聚乙烯醇溶液(分散相)中，室温下搅拌(400rpm)3h使二氯甲烷挥发完全，得到微球的聚乙烯醇混悬液。最后，将平衡好的装有微球混悬液的离心管对称地放在转子中离心(8000r/min)10min，弃除上清液，再用7mL蒸馏水分散，同等条件下离心，连续水洗3次，即得到微球。
2.3制备工艺的单因素考察
2.3.1剪切速度
参考“2.1项”基本处方和剪切时间(1min)不变，改变初乳制备时的剪切速度，使其分别为5000、10000、15000、20000r/min，考察剪切速度对SN-38-PLGA-MS包封率，载药量以及粒径的影响。
2.3.2剪切时间
参考“2.1项”基本处方和“2.2项”的基本工艺，固定基本处方和剪切速度(5000r/min)不变，改变初乳制备时的剪切时间，使其分别为0.5、2.0、2.5、2.0min，考察剪切时间对SN-38-PLGA-MS包封率，载药量以及粒径的影响。
2.4处方因素的单因素考察
2.4.1 PLGA浓度
参考“2.1项”下的基本处方和“2.2项”的基本工艺，固定制备工艺和处方中其他因素不变，只改变PLGA的浓度，使其分别为40、80、120、160mg/mL，考察PLGA的浓度对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响。
2.4.2药脂比
参考“2.1项”下的基本处方和“2.2项”的基本工艺，固定制备工艺和处方中其他因素不变，只改变药物SN-38与载体PLGA的比例，使其分别为1:5、1:10、1:15、1:20,考察药脂比对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响。
2.4.3初乳中PVA浓度
参考“2.1项”下的基本处方和“2.2项”的基本工艺，固定制备工艺和处方中其他因素不变，只改变初乳中PVA的浓度，使其分别为0.5％、1％、2.5％、2％，考察PVA浓度对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响。
2.4.4初乳中油相与水相的体积比
参考“2.1项”下的基本处方和“2.2项”的基本工艺，固定制备工艺和处方中其他因素不变，只改变初乳中油相与水相的体积比，使其分别为1:1、1:3、1:6、1:8，考察油相与水相的体积比对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响。
2.4.5初乳中水相与分散相的体积比
参考“2.1项”下的基本处方和“2.2项”的基本工艺，固定制备工艺和处方中其他因素不变，只改变初乳中水相与分散相的体积比，使其分别为1:3、1:5、1:7、1:10，考察水相与分散相的体积比对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响。
2.4.6正交试验设计优化处方与工艺
在单因素考察的基础上，选择对SN-38-PLGA-MS包封率影响较大的4个因素作为考察对象，即药脂比(A，w/w)、PLGA浓度(B，mg/mL)、初乳中油相与水相的体积比(C，V/V)、PVA浓度(D％，mg/100mL)，每个因素选择3个水平，按L9(34)进行正交设计，见表1。以包封率为评价指标，结果见表2。
表1正交设计试验的因素水平表
表2正交试验设计的计划
2.5重现性试验
依据正交试验结果确定最佳处方及工艺，并根据该处方工艺制备3批SN-38-PLGA-MS，测定其包封率和粒径，考察处方的合理性以及工艺的稳定性。
2.6 SN-38-PLGA-MS冻干制剂的制备
首先将制得的SN-38-PLGA-MS混悬液离心(8000r/min)10min，收集沉淀。然后再用蒸馏水洗涤3次，每次7mL。最后用适量蒸馏水分散均匀，加入不同浓度的甘露醇作为冻干保护剂，采用低温冷冻干燥法(-80℃预冻12h，置于冷冻干燥机中-50℃，冻干24h)制备干燥微球。考察其对微球外观状态及再分散时间的影响，筛选出SN-38-PLGA-MS冻干粉的最佳用量。
2.7 SN-38-PLGA-MS理化性质的表征
2.7.1外观性状观察
取冻干前后及复溶后的微球，观察其外观性状、形态并分别拍照。
2.7.2光学显微镜观察
取SN-38-PLGA-MS混悬液适量，置于载玻片上，滴加适量蒸馏水分散，盖上盖玻片。然后将其置于光学显微镜载物台上，用压片夹压住，标本正对通光孔。调节粗准焦螺旋使物镜处于适当位置，然后再缓慢转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。在此视野下观察微球形态并拍照。
2.7.3超景深显微镜观察
取SN-38-PLGA-MS冻干粉末适量，于超景深显微镜下观察并拍照。
2.7.4扫描电子显微镜观察
取适量SN-38-PLGA-MS冻干粉末，放置于双面胶带上，涂布均匀，用EikoIB-5离子镀膜仪溅金，观察微球大小以及表面形态。
2.7.5粒径大小及其分布
以适量蒸馏水为空白背景，取适量SN-38-PLGA-MS粉末，均匀分散于该空白中直到透光度达到测定要求，用激光粒度分析仪测定SN-38-PLGA-MS粒径大小以及粒径分布范围。
3实验结果
3.1制备工艺的单因素考察结果
3.1.1剪切速度的影响
固定基本处方和剪切时间(1min)不变，剪切速度对SN-38-PLGA-MS包封率，载药量以及粒径的影响结果如表3所示。
表3剪切速度的影响结果(n＝3)
由表3和图1可知，剪切速率对SN-38-PLGA-MS的包封率和载药量影响均较小，而对SN-38-PLGA-MS的粒径影响较为显著，随着剪切速度的增加SN-38-PLGA-MS粒径呈现逐渐减小趋势。因为剪切速度越大，形成的乳滴越小，故得到的微球也就越小。综合考虑，本试验选择剪切速度为5000rpm。
3.1.2剪切时间的影响
固定基本处方和剪切速度(5000rpm)不变，考察剪切时间对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响，结果如表4和图2所示。
表4剪切时间的影响结果(n＝3)
由表4和图2可知，剪切时间对SN-38-PLGA-MS的包封率和载药量影响均较小，而对SN-38-PLGA-MS的粒径影响较为显著，随着剪切时间的增加SN-38-PLGA-MS粒径呈现逐渐减小趋势。因为剪切时间越大，形成的乳滴越小，故得到的微球也就越小。综合考虑，本试验选择剪切时间为1min。
3.2处方因素的单因素考察结果
3.2.1 PLGA浓度的影响
固定制备工艺和处方中其他因素不变，考察PLGA的浓度对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响，结果如表5、图3示。
表5 PLGA的浓度对载药微球的影响
由表5和图3可知，随着PLGA浓度的增大，微球的包封率呈现先升高后降低的趋势，而载药量逐渐降低，说明PLGA浓度对药物包封率和载药量有较大的影响。而粒径变化较为平稳，说明PLGA浓度对微球的粒径影响甚微。考虑到其对包封率和载药量较为明显的影响，本试验选择浓度为80～160mg/mL的PLGA溶液进行正交试验。
3.2.2药脂比的影响
固定制备工艺和处方中其他因素不变，考察药脂比对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响，结果如表6和图4所示。
表6药脂比对SN-38-PLGA-MS形成的影响
由表6和图4可知，随着药脂比的增大，微球的包封率呈现先升高后降低的趋势，而载药量逐渐降低，说明药脂比对药物包封率和载药量有较大的影响。而粒径变化较为平稳，说明药脂比对微球的粒径影响甚微。考虑到其对包封率和载药量较为明显的影响，本试验选择药脂比1:5～1:15进行正交试验设计。
3.2.3初乳中PVA浓度的影响
固定制备工艺和处方中其他因素不变，考察初乳中PVA的浓度对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响，结果如表7和图5所示。
表7 PVA浓度对SN-38-PLGA-MS形成的影响
由表7和图5可知，随着PVA浓度的增大，微球的包封率和载药量均呈现降低趋势，说明PVA的浓度对药物的包封率和载药量有较大的影响。而粒径变化较为平稳，说明PVA的浓度对微球的粒径影响甚微。考虑到其对包封率和载药量较为明显的影响，本试验选择PVA浓度在0.5～1.5％之间进行正交试验设计。
3.2.4初乳中油相与水相体积比的影响
固定制备工艺和处方中其他因素不变，考察初乳中油相与水相体积比对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响，结果如表8和图6所示。
表8水相/油相体积比对微球包封率的影响
由表8和图6可知，随着初乳中油相与水相体积比的增大，微球的包封率和载药量均呈现先下降后上升趋势，说明油水体积比对药物的包封率和载药量有较大的影响。而粒径变化较为平稳，说明油水体积比对微球的粒径影响甚微。考虑到其对包封率和载药量较为明显的影响，本试验选择油水体积比在1:1～1:6之间进行正交试验设计。
3.2.5初乳中水相与分散相体积比的影响
固定制备工艺和处方中其他因素不变，考察初乳中水相与分散相的体积比对SN-38-PLGA-MS包封率、载药量以及粒径的影响，结果如表9和图7所示。
表9水相/分散相体积比对微球包封率的影响(实验记录0005136，p16)
由表9和图7可知，随着初乳中水相与分散相的体积比的增大，微球的包封率和载药量以及粒径变化均较为平稳，说明水相与分散相的体积比对药物的包封率、载药量和粒径影响甚微。因此，不再作为正交试验设计考察的因素。
3.3正交试验设计优化SN-38-PLGA-MS处方与工艺的结果
依据单因素考察结果，选择药脂比(A，w/w)、PLGA浓度(B，mg/mL)、初乳中油相与水相的体积比(C，V/V)、PVA浓度(D％，mg/100mL)作为正交试验考察的四个因素，每个因素选择3个水平，由于这些因素对粒径的影响不明显，所以只以包封率为评价指标筛选最佳处方组成，L9(34)正交试验设计的结果与分析见表10。
表10 L9(34)正交试验结果
极差R反映的是各因素对指标影响的程度，R值越大，对评价指标的影响程度越大。由表1-14可知R值大小排列顺序依次为B＞C＞D＞A，其中各因素水平分析结果为：A：3＞1＞2；B：2＞3＞1；C：2＞3＞1；D：3＞2＞1，因此最佳处方组成为A3B2C2D3，即：药脂比为1:15；PLGA浓度为120mg/mL；初乳中油相与水相的体积比1:3；PVA浓度1.5％。
3.4重现性试验结果
按照正交试验设计得到的最佳处方制备SN-38-PLGA-MS，发现载药量较低(5.27％)，因此对正交设计试验结果中药脂比进行微调，将药脂比改为1:10。最后确定最优处方为：药脂比为了1:10；PLGA的浓度80mg/ml；水相中PVA浓度为1.5％；分散相中PVA浓度为0.5％；初乳中油相与水相体积比为1:3；水相与分散相体积比为1:5。最佳工艺为：初乳剪切速度为5000r/min；剪切时间为1min；离心速度为8000r/min；离心时间为10min；水洗次数为3次。
按照最佳处方和工艺制备三批SN-38-PLGA-MS，其包封率，载药量以及粒径测定结果见表11。
表11重复性试验结果
由表11可知，三批样品的包封率均在80％以上，各个指标批间差异均较小，粒径稳定且符合预定要求，表明最优处方和工艺重现性良好。
3.5 SN-38-PLGA-MS冻干制剂的制备结果
向新制备的SN-38-PLGA-MS中加入不同浓度的甘露醇，按照“2.6项”下方法冻干。以冻干后外观性状以及复溶时间为指标，考察甘露醇的浓度对冻干制剂的影响，从而筛选出冻干保护剂的最佳用量。甘露醇的浓度对SN-38-PLGA-MS冻干粉的影响结果如表12所示。
表12甘露醇浓度对冻干制剂的影响
由表12可知，随着甘露醇浓度的不断增加，SN-38-PLGA-MS冻干粉的外观越来越饱满，复溶的再分散时间也相对缩短。综合分析，选择4％的甘露醇作为SN-38-PLGA-MS的冻干保护剂。
3.6 SN-38-PLGA-MS的表征结果
3.6.1外观性状表征结果
以4％的甘露醇作为SN-38-PLGA-MS的冻干保护剂，其冻干前后以及复溶后的外观性状照片如图9所示。由图可知，新鲜制备的微球混悬液分散均匀，呈乳白色；冷冻干燥后的微球呈乳白色疏松粉末状；其冻干粉可快速复溶于蒸馏水中，与新鲜制备的微球混悬液无明显差别。
3.6.2微观形态观察结果
将载有SN-38-PLGA-MS混悬液的载玻片置于光学显微镜观察，其在10倍及40倍下的显微观察结果如图10(A)和10(B)所示；取SN-38-PLGA-MS冻干粉末适量，于超景深显微镜下观察结果如图10(C)和10(D)所示；扫描电镜下观察结果如图10(E)和10(F)所示。
由图10可知，所制备的微球呈均匀圆球形，表面光滑，而且粒径大小分布较为均匀。采用激光粒度分析仪测得的SN-38-PLGA-MS平均粒径为10.02μm，粒径大小分布较为均匀，能够满足瘤内注射的给药要求。
效果验证
一、SN-38-PLGA-MS在肿瘤组织中的滞留量和组织渗漏情况研究
方案设计
1.1荷H22肿瘤细胞的小鼠动物模型的建立
采用RPMI-1640培养基(含10％的胎牛血清)培养鼠原发性肝癌细胞(H22)，然后将培养瓶置于细胞培养箱中。将处于对数生长期的H22细胞于无菌条件下离心，收集细胞沉淀，再用无血清的培养基将其稀释为1×106个/mL的细胞混悬液，计数板计数。取1mL该混悬液通过腹腔注射至昆明小鼠体内完成传代，待小鼠腹腔内有足量腹水后(注射7天左右)，抽取腹水，用生理盐水稀释至适合浓度。按照0.1mL/只的剂量接种于小鼠右侧腋下皮下，然后隔一天用游标卡尺测量一次肿瘤的长径(L)和短径(W)，并按照以下公式计算瘤体积，待瘤体积长至400mm3左右时(大约接种后7天)，小鼠肿瘤模型即构建成功。
1.2实验分组与给药
优选66只肿瘤体积相近的小鼠随机分为2组，以10mg/kg的给药剂量分别瘤内注射SN-38-Sol(2mg/mL)和SN-38-PLGA-MS(相当于SN-38 2mg/mL)，试验周期内每组只给药一次。分别于给药0.5、1、4、8、12、24、48、240、336、432h后摘除小鼠眼球取血，每个时间点平行做3组。取出的全血置于事先用肝素钠润洗过的1.5mL EP管中，4000rpm离心10min，取上清液得到血浆；同时将小鼠颈部脱臼处死，剥离肿瘤组织并记录质量。每次实验后将得到的血浆和肿瘤组织样品置于-20℃冰箱中保存待测。
1.3肿瘤组织中药物浓度的测定
对肿瘤组织进行预处理，并对各个肿瘤组织样品分别进样20μL，记录峰面积A，计算药物浓度，比较两种制剂中SN-38在肿瘤组织中的滞留情况。
1.4肿瘤组织药物动力学参数的计算
采用DAS2.0程序(Drug And Statistics for Windows)对SN-38-Sol组和SN-38-PLGA-MS组中SN-38在肿瘤组织中的浓度测定结果进行处理，进而得到药动学参数。
1.5血药浓度测定
对血浆样品进行预处理，比较两种制剂中SN-38渗漏于血浆中的程度。
试验结果
2.1肿瘤组织中SN-38浓度测定结果
两种制剂(SN-38-Sol和SN-38-PLGA-MS)分别瘤内注射给药后于不同时间点剖离肿瘤组织，所测得的组织中SN-38浓度见表13，以平均药物浓度为纵坐标，以时间为横坐标绘制的变化关系结果见图11。
表13两种制剂于不同时间点测得的肿瘤组织中SN-38浓度(n＝3)
由表13和图11可知，瘤内注射给药后，SN-38-PLGA-MS组在各时间点所测得的瘤内药物浓度均明显高于SN-38-Sol组；此外，SN-38-Sol组中的SN-38浓度在144h后就已检测不到，而SN-38-PLGA-MS组中的SN-38浓度在432h还可以达到(4.93±0.43)μg/mL，说明SN-38被包覆于微球后，明显提高药物在肿瘤部位的滞留量，同时也延长了药物在靶区的滞留时间。
2.2药物动力学参数的计算结果
采用DAS软件测得的肿瘤组织中的药物动力学参数如表14所示。
表14两种制剂在小鼠肿瘤组织中的药物动力学参数
由表14可以看出，SN-38-PLGA-MS的AUC为3477.712mg/L*h，是SN-38-Sol组的3.83倍，表明生物利用度明显提高；SN-38-PLGA-MS组的t1/2、MRT和CL分别是SN-38-Sol的3.33、4.60和0.22倍，说明SN-38被包覆于微球以后，明显延长了SN-38在肿瘤部位的滞留时间，同时大大减少了SN-38从靶区向外部的渗漏，降低了其系统毒副作用。
2.3血浆中SN-38浓度测定结果
两种制剂(SN-38-Sol和SN-38-PLGA-MS)分别瘤内注射给药后于不同时间点眼球取血分离血浆，所测得的血浆中SN-38浓度见表15，以平均药物浓度为纵坐标，以时间为横坐标绘制的变化关系结果见图12。
表15血浆中SN-38药物浓度随时间变化关系(n＝3)
从表15和图12中可得，小鼠瘤内注射给药后，SN-38-Sol组血浆中SN-38的含量明显高于SN-38-PLGA-MS组，SN-38-Sol组的Cmax为7.588μg/mL是SN-38-PLGA-MS组的2.31倍，说明与SN-38-Sol相比，瘤内注射SN-38-PLGA-MS能减少SN-38从瘤体向血液循环的渗漏，降低SN-38全身的毒副作用。
二、SN-38-PLGA-MS瘤内注射治疗癌症的药效学研究
方案设计
1.1体内药效学实验设计
建立荷H22肿瘤的小鼠动物模型，优选32只瘤体积符合要求的荷瘤小鼠，将其随机分为4组，每组8只，分别于第一天以10mg/kg的给药剂量瘤内给予NS、SN-38-Sol、空白PLGA微球和SN-38-PLGA-MS，之后不再给予药物。试验周期内不断观察小鼠的进食及运动情况，同时检查小鼠肿瘤状况是否良好；每隔一天用游标卡尺测量各组小鼠的肿瘤长短径，计算瘤体积，同时每隔两天记录各组小鼠体重，于18天后，处死各组小鼠，剥离瘤组织并称重，绘制各组荷瘤小鼠瘤体积和体重随时间变化关系图，并通过分析最后一天的瘤重来评价各组制剂的抑瘤作用和体内安全性。最后，根据下面公式计算参数DT、TGI和SGR，量化评价各组制剂的抑瘤效果。
1.2组织切片实验设计
优选48只瘤体积符合要求的荷瘤小鼠，将其随机分为4组，每组12只，按照效果验证“1.2实验分组与给药”的方法给药，然后分别于第1、6、12、18天各组分别处死3只小鼠，剖离肿瘤组织，并于最后一天同时剖离包括心肝脾肺肾皮肤在内的小鼠主要脏器，将标本置于4％的甲醛中固定，石蜡包埋，并依次对切片进行H&E染色，最后在正置光学显微镜下观察肿瘤细胞的形态变化，评价各组制剂抵抗肿瘤生长的能力，同时通过对比各组制剂与生理盐水组的差异，确定其是否会对小鼠主要脏器产生毒性，以此评价其安全性。
试验结果
2.1一般观察结果
小鼠荷瘤后进食及饮水正常，活动情况与荷瘤前也未表现出异常，肿瘤在生长期间状态良好，试验周期内小鼠无死亡现象。
2.2肿瘤体积随时间的变化
瘤内注射前后肿瘤体积的变化情况见表16，同时为了更直观地比较各组肿瘤的生长趋势，以肿瘤体积为纵坐标，观察时间为横坐标，绘制了自给药幵始至给药后第18天的肿瘤生长曲线，见图13(A)，同时也对不同制剂最后一天的肿瘤体积进行了统计学分析，见图13(B)。
表16肿瘤体积随时间变化的关系(n＝8)
由表16和图13(A)可知，从总体上看，各组的小鼠肿瘤均呈现出一定的增长趋势，NS组和Blank PLGA-MS组的增长趋势较为明显，而SN-38-Sol组和SN-38-PLGA-MS组的增长速度相对缓慢。其中，0-2天，各组小鼠的肿瘤体积增幅不大，组间差异不明显，而自第4天开始，组间差异开始显现，NS组和Blank PLGA-MS组小鼠的瘤体积呈现快速增长趋势，第18天肿瘤体积分别达到(2252.11±393.22mm3)和(2381.13±860.76mm3)，分别为初始体积的5.79、6.14倍，两者趋势大致相似，说明Blank PLGA-MS对小鼠肿瘤没有治疗作用；而SN-38-Sol组和SN-38-PLGA-MS组小鼠的瘤体积增长均较为缓慢，抑瘤效果明显，但SN-38-Sol组在第4天后，肿瘤又开始出现明显增长，第18天时的肿瘤平均体积达到了(1121.56±562.72mm3)，为第4天的(363.56±128.37mm3)的3.08倍，而SN-38-PLGA-MS组的小鼠肿瘤一直呈现缓慢增长趋势，第18天的平均肿瘤体积为(605.59±468.81mm3)，仅是初始肿瘤体积(355.75±141.64mm3)的1.60倍。这是由于SN-38-Sol组的药物以分子形式存在，很容易通过组织间隙渗漏进入体循环，同时药物本身的半衰期较短，最终导致SN-38在4天左右已代谢完全，间接证明了微球的缓释效果，同时说明与药物溶液组相比，微球组能更好地抑制肿瘤生长。由图13的统计学分析结果可知，Blank PLGA-MS组与NS组相比没有统计学差异(P>0.05)，而SN-38-Sol组和SN-38-PLGA-MS组与NS组相比，均表现出显著抑瘤效果(P﹤0.001)，说明两者均可以抑制肿瘤生长；进一步分析发现SN-38-PLGA-MS组与SN-38-Sol组相比，仍然具有显著的统计学差异(P﹤0.01)，说明SN-38-PLGA-MS抑瘤效果更为明显，用于肿瘤治疗具有更强的给药优势。
2.3参数TGI、DT和SGR的计算结果
求得各组TGI、DT、SGR值，结果见表17。
表17各组TGU、DT、SGR结果
由表17中可知，NS组和Blank PLGA-MS组的三个指标均相差不大，说明载体PLGA本身不具备抑瘤作用；而SN-38-Sol组和SN-38-PLGA-MS组均具有一定的抗肿瘤效果，但SN-38-PLGA-MS组的TGI、DT和SGR分别为SN-38-Sol组的1.42、1.97和0.51倍，说明与SN-38-Sol相比，将SN-38包裹制成微球抑瘤效果更显著。
2.4小鼠体重随时间的变化
瘤内注射给药后，各组小鼠的体重变化情况见表18，同时为了更直观地比较各组小鼠体重变化趋势，以时间为横坐标，小鼠体重为纵坐标，绘制了自给药后0到18天小鼠体重的变化曲线，见图14。同时对不同制剂最后一天的小鼠体重进行了统计学分析，见图14(B)。
表18小鼠的体重随时间变化关系(n＝8)
从表18和图14可知，NS组和Blank PLGA-MS组的小鼠体重变化不明显，但通过分析可知这两组的小鼠肿瘤呈现快速增长趋势，综合考虑可得肿瘤的快速增长限制了小鼠的体重增长；SN-38-Sol组和SN-38-PLGA-MS组的小鼠体重出现了缓慢上升趋势，说明SN-38对肿瘤的抑制作用使小鼠病情有所好转，促进了小鼠的食欲；从图14(B)的统计学分析结果来看，同是SN-38的药物制剂，SN-38-PLGA-MS组与SN-38-Sol组相比，小鼠体重显著升高(**P﹤0.01)，说明将SN-38制成微球相对于溶液来说，具有更小的全身毒副作用，验证了微球制剂良好的安全性。
2.5治疗后各组小鼠的瘤重观察
为了直观分析不同制剂的抑瘤效果，在给药18天后脱颈处死小鼠，剥离瘤体并进行称重，结果见表19。同时对不同制剂最后一天的肿瘤体重进行了统计学分析处理，见图15。
表19不同制剂给药18天后肿瘤的重量(n＝8)
由表19可知，NS组和Blank PLGA-MS组的肿瘤较重，约在1.45g左右，而SN-38-Sol组和SN-38-PLGA-MS组的肿瘤重量分别是NS组的0.39和0.14倍，说明SN-38-Sol和SN-38-PLGA-MS都能不同程度的抑制肿瘤的生长。SN-38的两种制剂间进行比较发现SN-38-PLGA-MS的肿瘤重量为(0.21±0.10g)，是SN-38-Sol(0.57±0.17g)的0.37倍，说明SN-38制成微球后效果更佳。由图15可知，Blank PLGA-MS组与NS组相比没有统计学差异(P>0.05)，SN-38-Sol组同和SN-38-PLGA-MS组与NS组相比的统计学分析结果分别是P﹤0.01和P﹤0.001，说明两者均表现出了较好的肿瘤抑制效果；且发现SN-38-PLGA-MS组与SN-38-Sol组相比，仍然具有显著的统计学差异(P﹤0.001)，说明将SN-38制备成微球后的抑瘤效果更为明显。这是由于SN-38的半衰期较短，制成溶液剂将SN-38直接暴露在外使其在短时间内代谢完全，同时容易渗漏出去引起部分药物损失，而微球中的SN-38能依靠PLGA的包裹具有较好的稳定性，同时载体所赋予的缓释效果使SN-38能够缓慢释放，具有持续的抗癌作用。
2.6肿瘤组织病理学观察结果
不同制剂瘤内给药后，于不同的时间点剥离肿瘤组织进行H&E染色，显微镜进一步观察各组对肿瘤的抑制效果，其病理切片结果见如图16所示。
由图16可知，荷瘤小鼠瘤内注射给药1天后，NS组与Blank PLGA-MS组的肿瘤细胞结构完好，体积较大，形状不规则，细胞核形态各异，可见核分裂像，癌细胞增殖旺盛；SN-38-Sol组和SN-38-PLGA-MS组的肿瘤细胞弥漫分布，部分视野内可见肿瘤细胞皱缩，细胞核固缩、溶解、消失，细胞结构遭到破坏；给药6天后，NS组与BlankPLGA-MS组肿瘤细胞结构依然完好，肿瘤细胞大或中等大，形状不规则，可见核分裂像，部分癌细胞呈密集片状，增殖分裂较为旺盛。SN-38-Sol组却表现出强于第4天的肿瘤增殖效果，部分肿瘤细胞重新增殖，逐渐显示较强的生长作用，说明此时溶液组的药物已释放大半，病灶区域药物量较少，不能进一步抑制肿瘤细胞的生长，而SN-38-PLGA-MS可见肿瘤结构坏死区域不断增多，肿瘤细胞体积缩小，并伴有大量炎性细胞浸润；给药12天后，NS组与Blank PLGA-MS组的肿瘤细胞仍然增生活跃，SN-38-Sol组细胞坏死区和正常区之间大量纤维肉芽组织形成，细胞坏死区域减少，部分癌细胞呈密集片状，可见核分裂像，肿瘤细胞增生较为活跃，SN-38-PLGA-MS组以重度坏死为主，肿瘤中心大片坏死，细胞结构完全破坏，并伴有大量炎细胞浸润，周边可见瘤细胞聚集，核分裂数减少；给药18天后，各组出现出与给药12天后相同的发展趋势，可见，药物被包裹于微球以后所具有的缓释长效效果对肿瘤的抑制作用明显提高，证实了其相对于其他组所具有的高效设计目的。
2.7小鼠各主要脏器的病理学观察结果
不同制剂瘤内注射给药后，于最后一天剥离小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾及皮肤)进行H&E染色，显微镜观察各组制剂对小鼠主要脏器是否产生毒性以证实其安全性，各病理切片结果见如图17所示。
由图17可知，在结束给药后，各实验组小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾及皮肤)与NS组相比均未出现明显差异。各组心肌纤维结构正常，未见变性、坏死、炎细胞浸润等组织病理学变化，间质内也无水肿、出血等异常；肝脏的肝索、肝窦清晰，结构完整，肝部未见异常病灶；脾脏的红髓、白髓结构均正常，未见淋巴细胞减少、纤维化等组织病理学变化；肺部的肺泡囊、肺泡等结构内无水肿、出血、气肿等变化；肾脏中的肾小球和肾小管结构正常，间质内未见水肿、炎细胞浸润、纤维化等组织病理学变化；皮肤中表皮、真皮、皮下组织各层分层清晰、各细胞结构清晰。实验结果表明，各组均未发现有病变趋势，证明本课题制备的SN-38-PLGA-MS安全性较好，实验周期内，对小鼠的主要脏器不会产生明显的毒副作用。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
(1)将SN-38与聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)共溶于二氯甲烷与二甲基亚砜组成的混合溶液中，溶解形成有机相；
(2)将聚乙烯醇溶液(水相)加入到有机相中，高速剪切形成初乳；
(3)将初乳注入到聚乙烯醇溶液(分散相)中，室温下搅拌使二氯甲烷挥发完全，得到微球的聚乙烯醇混悬液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，
SN-38与PLGA的质量比(即药脂比，w/w)为1:5～20(优选为1:10)；
所述PLGA的浓度为40～160mg/mL(优选为80mg/mL)。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，
所述初乳中油相与水相的体积比1:1～8(优选为1:3)；
所述水相中的聚乙烯醇浓度为0.5～2％(优选为1.5％)；
剪切速度控制为5000～20000r/min(优选为5000r/min)；
剪切时间为0.5～2min(优选为1min)。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，
所述初乳中水相与分散相的体积比1:3～10(优选为1:5)；
所述分散相中聚乙烯醇浓度为0.1～1.0％(优选为0.5％)。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将步骤(3)中含有微球的聚乙烯醇混悬液进行离心，去上清液，使用蒸馏水分散，离心去上清，连续水洗2～3次即得瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述离心转速为7000～9000r/min(优选8000r/min)，离心时间为7～15min(优选10min)。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球加入蒸馏水分散均匀后，加入甘露醇作为冻干保护剂，采用低温冷冻干燥法制备干燥微球。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述甘露醇浓度为1～5％(优选为4％)；
优选的，所述低温冷冻干燥法具体包括：-80℃预冻12h，然后置于-50℃条件下，冻干24h。
9.权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到的瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球。
10.权利要求9所述瘤内注射用SN-38-PLGA缓释微球在制备肝靶向抗肿瘤药物中的应用。
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