CN105616385A - 磷脂蛋白质微粒复合微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磷脂蛋白质微粒复合微球及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：将蛋白质或多肽类水溶性药物以及冻干保护剂的水溶液与磷脂的醇溶液搅拌混合，得到磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液；冷冻干燥除去溶媒，得到磷脂蛋白质微粒；将磷脂蛋白质微粒均匀分散于高分子载体材料的有机溶液中，再加入含有乳化剂的水溶液，高速剪切制备成S/O/W的乳液；再经过溶剂挥发、微球固化等过程形成磷脂蛋白质微粒复合微球。用本发明所述方法制备的磷脂蛋白质微粒复合微球，药物包封率高，突释率低(首日释放率为9％-15％)，释放速率稳定持久，制剂缓释期可达20-60天，微球中药物的生物活性高，具备临床应用的实际价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别是涉及一种磷脂蛋白质微粒复合微球及其制备方法。
背景技术
随着基因组学、蛋白质组学和生物技术的高速发展，蛋白质和多肽药物的开发工作已经成为医药研发领域的热点之一。作为生物体内具备各种代谢功能的活性物质，蛋白质多肽药物涉及到激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。与小分子化学药物相比，蛋白质药物由于具备高活性和高选择性，往往疗效更为显著，且不良反应更少，安全性更高。因此，蛋白质药物已经成为治疗内分泌类、传染类、代谢类和疼痛缓解等多种疾病的一线药物。
蛋白类药物在临床上主要以注射液和冻干粉针的剂型为主，为了达到疗效常常需要频繁地注射给药，严重影响患者的顺应性。因此，为了减少注射给药的次数而达到长效用药的目的，开发蛋白质药物的制剂就成为一个亟待解决的问题。在众多解决方法中，开发长效微球所取得的成果是最引人瞩目的。到目前为止，通过FDA批准的关于蛋白质多肽类药物的微球包括益普生公司的曲普瑞林微球、安万特公司的布舍瑞林微球、武田公司的亮丙瑞林微球等。
聚乳酸(PLA)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是最常用的微球载体材料。作为合成高分子材料，PLA和PLGA具备良好的生物相容性和生物降解性，最终均可降解为二氧化碳和水，在体内不会引起毒副反应，已经被广泛应用于生物制药和医用工程领域。
在以往的研究中，一般常用W/O/W复乳法制备装载蛋白质药物的微球制剂。该法将水溶性蛋白质药物溶解于内水相中，加入溶解高分子材料的有机相中，通过超声或搅拌的方法制成O/W初乳，而后将初乳加入外水相搅拌形成W/O/W复乳，最后溶剂挥发干燥形成固化微球。但是W/O/W复乳法在制备过程中，由于内水相的蛋白药物容易渗漏至外水相，容易使得蛋白药物聚集在微球表层造成突释。另一方面，作为结构较为脆弱的生物活性试剂，蛋白质药物在W/O/W复乳法制备微球的过程中也会不可避免地与有机溶剂接触，从而导致蛋白质药物的活性下降。
发明内容
基于此，有必要提供一种磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，以提高微球制剂的包封率、降低其突释率，减少蛋白质药物在制备过程中与有机溶剂的直接接触，从而保持蛋白质药物的生物活性。
具体技术方案如下。
一种磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将蛋白质或多肽类水溶性药物和冻干保护剂溶于水，得到的水溶液A与磷脂的醇溶液在温度为30-45℃的条件下搅拌混合，得到磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液；
(2)将磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液冷冻干燥除去溶媒，得到磷脂蛋白质微粒；
(3)将磷脂蛋白质微粒均匀分散于高分子载体材料的有机溶液中，再加入含有乳化剂的水溶液B，高速剪切制备成S/O/W乳液；
(4)将S/O/W乳液置于含氯化钠或聚乙烯醇的水溶液C中，搅拌，挥发有机溶剂、固化微球；
(5)离心收集微球，用超纯水洗涤微球，冷冻干燥，即得所述磷脂蛋白质微粒复合微球。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的磷脂选自大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酸中的一种或几种。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的磷脂选自大豆磷脂酰胆碱和/或蛋黄磷脂酰胆碱。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的蛋白质或多肽类水溶性药物选自牛血清白蛋白、胸腺五肽、鲑鱼降钙素、胰岛素、艾塞那肽、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板生长因子、内皮生长因子、神经生长因子、骨衍生性生长因子、重组人粒细胞集落刺激因子、凝血因子中的一种或几种。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的蛋白质或多肽类水溶性药物选自牛血清白蛋白、胸腺五肽、鲑鱼降钙素、艾塞那肽、干扰素或表皮生长因子中的一种或几种。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的冻干保护剂选自硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠等盐类，蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等糖类，山梨醇、甘露醇、木糖醇、甘油等醇类，柠檬酸、酒石酸、乙二胺四乙酸等酸碱类，葡聚糖、聚乙二醇、聚维酮、明胶等聚合物，牛血清白蛋白、人血清白蛋白等蛋白质中的一种或几种。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇中的一种或几种，其质量为蛋白质或多肽类水溶性药物的40％-60％。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的冻干保护剂选自海藻糖或甘露醇，其质量为蛋白质或多肽类水溶性药物的45-55％。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述醇为乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇中的一种或几种，所述水溶液A中蛋白质或多肽类水溶性药物的浓度为0.2-5mg/mL，醇溶液中磷脂的浓度为40-60mg/mL，醇溶液与水溶液A的体积比为1：3-7。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述醇为叔丁醇，所述水溶液A中蛋白质或多肽类水溶性药物的浓度为1.5-2.5mg/mL，醇溶液中磷脂的浓度为48-52mg/mL，醇溶液与水溶液A的体积比为1：4-6。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述的高分子载体材料选自聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或两种，其分子量为10000-50000；所述高分子载体材料的有机溶液中的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮或者碳酸二甲酯中的一种或几种，高分子载体材料的浓度为40-160mg/mL。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述的高分子载体材料选自聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或两种，其分子量为35000-45000；所述高分子载体材料的有机溶液中的有机溶剂为二氯甲烷和/或碳酸二甲酯中，高分子载体材料的浓度为90-110mg/mL。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述乳化剂为聚乙烯醇、吐温-60或者吐温-80中的一种或几种，所述含有乳化剂的水溶液B中乳化剂的浓度为10-70mg/mL。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述乳化剂为聚乙烯醇，所述含有乳化剂的水溶液B中乳化剂的浓度为45-55mg/mL。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述磷脂蛋白质微粒与高分子载体材料的有机溶液的质量体积比为4-10mg/mL，高分子载体材料的有机溶液与含有乳化剂的水溶液B的体积比为1：3-18。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述磷脂蛋白质微粒与高分子载体材料的有机溶液的质量体积比为7-8mg/mL，高分子载体材料的有机溶液与含有乳化剂的水溶液B的体积比为1：9-11。
本发明还提供了一种磷脂蛋白质微粒复合微球，具体技术方案如下：一种磷脂蛋白质微粒复合微球，由上述制备方法制备得到。
本发明的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法中，先将蛋白质或多肽类药物与磷脂制备成磷脂蛋白质微粒，再制备成S/O/W乳液，进一步将S/O/W乳液制备成微球，该方法制备的微球与现有的W/O/W复乳法制备的微球相比，磷脂微粒的存在可以有效减少内水相的蛋白或多肽类药物渗漏至外水相，从而减少蛋白或多肽类药物聚集在微球表层而造成的药物突释现象，可以有效减少蛋白质或多肽类药物在微球的制备过程中与有机溶剂的接触，从而可以保护蛋白质药物的生物活性。因此，本发明提供的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，可以有效地解决传统蛋白质微球制剂突释率高、药物活性下降等问题。用本发明所述方法制备的磷脂蛋白质微粒复合微球，其药物包封率高，药物活性高，突释率低(首日释放率为9％-15％)，药物释放速率稳定持久，接近于零级释放，微球制剂的缓释期可达20-60天，且微球表面光滑、球型完整，平均粒径在1-100μm之间。该方法适用于蛋白质、寡肽、多肽、疫苗、DNA、RNA等结构脆弱、活性敏感的生物药品，具备临床应用的实际价值。
附图说明
图1A-E分别为实施例1-4的磷脂蛋白质微粒复合微球和对比例1的微球扫描电镜图；
图2A-E分别为实施例1-4的磷脂蛋白质微粒复合微球和对比例1的微球粒径分布图；
图3为实施例3的胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒的透射电镜图；
图4为实施例4的鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质脂质囊泡粒径分布图；
图5为实施例1所制备的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒S/O/W复合微球以及对比例1所制备的普通W/O/W微球的体外释放曲线对比图；
图6为实例6中检测牛血清白蛋白药物二级结构的圆二色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制。
实施例1：牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备
本实施例的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法包括如下步骤：
1、制备磷脂蛋白质微粒
称取适量水溶性模型蛋白药物牛血清白蛋白及冻干保护剂海藻糖溶于超纯水中，配成牛血清白蛋白浓度为2mg/mL、海藻糖浓度为1mg/mL的溶液作为水相，称取适量大豆磷脂酰胆碱溶于叔丁醇中，配制成磷脂浓度为50mg/mL的叔丁醇溶液作为油相。在水浴37℃、磁力搅拌速率1300rpm的条件下，将油相逐滴加入水相中，油相与水相的体积比为1：4。滴加结束后，以水浴37℃、磁力搅拌速率1300rpm的条件继续搅拌15min，即可得到牛血清白蛋白的磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液。
利用液氮将上述得到的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液速冻固化，继而冷冻干燥24h以除去溶媒，即可得到牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒。
2、制备载有磷脂蛋白质微粒的微球
称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌至聚乙烯醇完全溶解，停止加热，静置冷却，配制成浓度为50mg/mL的PVA水溶液，置于4℃冰箱中待用。
精确称取一定量的聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)，分子量为40000，加入适量的二氯甲烷涡漩振荡溶解，配制成浓度为100mg/mL的PLGA二氯甲烷溶液，现用现配并置于冰浴中预冷。
将步骤1制备的30mg牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒分散于4mL的100mg/mL的PLGA二氯甲烷溶液中，涡漩振荡2min使其均匀分散；然后加入50mg/mL的PVA水溶液作为外水相，PLGA的二氯甲烷溶液与PVA水溶液的体积比为1：10；利用高速剪切机在冰浴、剪切速率为10000rpm、时长为1min的条件下，将两者混合制成S/O/W的乳液；而后转移至50mg/mL的氯化钠水溶液中，乳液与氯化钠水溶液的体积比为1：25，在500rpm的搅拌速率下搅拌3h以挥发有机溶剂、固化微球；离心收集微球，并用超纯水洗涤三次；将所得微球在-80℃条件下预冻过夜，最后进行冷冻干燥即得牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球。
将本实施例制备的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球放在贴有导电胶带的金属载物台上，喷金制成扫描电镜样本，在扫描电镜下观察微球外形(结果见图1A)。扫描电镜结果显示，本发明所制备的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球，表面光滑，球型完整，颗粒规则无粘连。
采用激光粒度分析仪(Mastersizer2000)对本实施例制备的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球进行粒径及分布的测量(结果见图2A)。结果表明，本发明所制备的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球粒径均一，呈现正态分布，d(0.1)＝1.602μm，d(0.5)＝3.002μm，d(0.9)＝5.983μm。
精密称取实施例1所制备的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球10mg置于7mL离心管中，加入2mL二氯甲烷或者乙腈溶解；然后将样品在12000rpm条件下离心5min，弃去上清液；随后置于真空干燥箱中除去残留溶剂；最后用适量的超纯水或者PBS缓冲液溶解沉淀，采用MicroBCA试剂盒检测样品的牛血清白蛋白的含量，再计算其药物包封率。实验结果显示，实施例1所制备的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球的牛血清白蛋白的包封率达到76.02％。
实施例2：牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备
本实施例的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法包括如下步骤：
1、制备磷脂蛋白质微粒
称取适量水溶性模型蛋白药物牛血清白蛋白及冻干保护剂甘露醇溶于超纯水中，配成牛血清白蛋白浓度为2mg/mL、甘露醇浓度为1mg/mL的溶液作为水相，称取适量大豆磷脂酰胆碱溶于叔丁醇中，配制成磷脂浓度为50mg/mL的叔丁醇溶液作为油相。在水浴37℃、磁力搅拌速率1300rpm的条件下，将油相逐滴加入水相中，油相与水相的体积比为1：5。滴加结束后，以水浴37℃、磁力搅拌速率1300rpm的条件继续搅拌15min，即可得到牛血清白蛋白的磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液。
利用液氮将上述得到的牛血清白蛋白的磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液速冻固化，继而冷冻干燥24h以除去溶媒，即可得到牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒。
2、制备载有磷脂蛋白质微粒的微球
称取一定量的聚乙烯醇(PVA)和氯化钠(NaCl)，加入适量的超纯水，加热搅拌至聚乙烯醇和氯化钠完全溶解，停止加热，静置冷却，配制成PVA浓度为10mg/mL、NaCl浓度为50mg/mL的水溶液，置于4℃冰箱中待用。
精确称取一定量的聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)，分子量为40000，加入适量体积比为1：1的二氯甲烷和碳酸二甲酯的混合溶剂，涡漩振荡溶解，配制成浓度为50mg/mL的PLGA二氯甲烷/碳酸二甲酯的混合溶液，现用现配并置于冰浴中预冷。
将步骤1制备的30mg牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒分散于4mL的50mg/mL的PLGA二氯甲烷/碳酸二甲酯的混合溶液中，涡漩振荡2min使其均匀分散；然后加入浓度为10mg/mLPVA、50mg/mLNaCl的水溶液作为外水相，PLGA的二氯甲烷溶液与外水相的体积比为1：5；利用高速剪切机在冰浴、剪切速率为10000rpm、时长为1min的条件下，将两者混合制成S/O/W的乳液；而后转移至50mg/mL的氯化钠水溶液中，乳液与氯化钠水溶液的体积比为1：50，在500rpm的搅拌速率下搅拌3h以挥发有机溶剂、固化微球；离心收集微球，并用超纯水洗涤三次；将所得微球在-80℃条件下预冻过夜，最后进行冷冻干燥即得牛血清白蛋白的磷脂蛋白质微粒复合微球。
本实施例制备的牛血清白蛋白磷脂蛋白质微粒复合微球的扫描电镜图如图1B(测定方法同实施例1)，结果显示微球表面光滑，球型完整，颗粒规则均一；其粒径呈现近乎正态分布，粒径分布图如2B(测定方法同实施例1)，d(0.1)＝1.359μm，d(0.5)＝3.120μm，d(0.9)＝12.240μm；其牛血清白蛋白的包封率达到64.46％(测定方法同实施例1)。
实施例3：胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备
本实施例的胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法包括如下步骤：
1、制备磷脂蛋白质微粒
称取适量水溶性寡肽药物胸腺五肽及冻干保护剂海藻糖溶于超纯水中，配成胸腺五肽浓度为2mg/mL、海藻糖浓度为1mg/mL的溶液作为水相，称取适量大豆磷脂酰胆碱溶于叔丁醇中，配制成磷脂浓度为50mg/mL的叔丁醇溶液作为油相。在水浴37℃、磁力搅拌速率1300rpm的条件下，将油相逐滴加入水相中，油相与水相的体积比为1：6。滴加结束后，以水浴37℃、磁力搅拌速率1300rpm的条件继续搅拌15min，即可得到胸腺五肽的磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液。
利用液氮将上述得到的胸腺五肽的磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液速冻固化，继而冷冻干燥24h以除去溶媒，即可得到胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒。
2、制备载有磷脂蛋白质微粒的微球
称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌至聚乙烯醇完全溶解，停止加热，静置冷却，配制成浓度分别为50mg/mL和5mg/mL的PVA水溶液，置于4℃冰箱中待用。
精确称取一定量的聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)，分子量为40000，加入适量的二氯甲烷涡漩振荡溶解，配制成浓度为150mg/mL的PLGA二氯甲烷溶液，现用现配并置于冰浴中预冷。
将步骤1制备的30mg胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒分散于4mL的150mg/mL的PLGA二氯甲烷溶液中，涡漩振荡2min使其均匀分散；然后加入50mg/mL的PVA水溶液作为外水相，PLGA的二氯甲烷溶液与PVA水溶液的体积比为1：15；利用高速剪切机在冰浴、剪切速率为10000rpm、时长为1min的条件下，将两者混合制成S/O/W的乳液；而后转移至5mg/mL的PVA水溶液中，乳液与PVA水溶液的体积比为1：10，在500rpm的搅拌速率下搅拌3h以挥发有机溶剂、固化微球；离心收集微球，并用超纯水洗涤三次；将所得微球在-80℃条件下预冻过夜，最后进行冷冻干燥即得胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒复合微球。
将本实施例步骤1制备的胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒复悬于超纯水中，用移液枪滴加一滴混悬液于铜网之上，静置吸附后，用滤纸将多余液体吸干；再滴加一滴1％磷钨酸溶液于铜网上对样品进行染色，静置吸附后，用滤纸将多余液体吸干；带铜网完全干燥后，采用透射电镜JEM100B对胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒的形态进行观察(结果见图3)。结果表明，本发明所制备的胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒为圆球形或类球形的颗粒，粒径在100-300nm之间。
本实施例制备的胸腺五肽磷脂蛋白质微粒复合微球的扫描电镜图如图1C(测定方法同实施例1)，表面光滑，球型完整，颗粒规则无粘连；其粒径呈现正态分布，粒径分布图如2C(测定方法同实施例1)，d(0.1)＝1.434μm，d(0.5)＝2.261μm，d(0.9)＝3.456μm。
精密称取本实施例所制备的胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒复合微球10mg置于7mL离心管中，加入2mL二氯甲烷或者乙腈溶解；然后将样品在12000rpm条件下离心5min，弃去上清液；随后置于真空干燥箱中除去残留溶剂；最后用适量的超纯水或者PBS缓冲液溶解沉淀，采用高效液相色谱法检测样品的胸腺五肽的含量，再计算药物其包封率。色谱系统为岛津SIL-20A色谱系统；固定相为PhenomenexGemini-NX5μC18110A(250×4.60mm)；流动相为50mmol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)：甲醇＝80:20(v/v)；流速为1.0mL·min-1，柱温：30℃，检测波长：275nm，进样量：20μL。实验结果显示，本实施例所制备的胸腺五肽的磷脂蛋白质微粒复合微球的药物包封率达到60.14％。
实施例4：鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备
本实施例的鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法包括如下步骤：
1、制备磷脂蛋白质微粒
称取适量水溶性药物鲑鱼降钙素及冻干保护剂海藻糖溶于超纯水中，配制成鲑鱼降钙素浓度为2mg/mL、海藻糖浓度为1mg/mL的溶液作为水相，称取适量蛋黄磷脂酰胆碱溶于叔丁醇中，配制成磷脂浓度为50mg/mL的叔丁醇溶液作为油相。在水浴37℃、磁力搅拌速率1300rpm的条件下，将油相逐滴加入水相中，油相与水相的体积比为1：4。滴加结束后，以水浴37℃、磁力搅拌速率1300rpm的条件继续搅拌15min，即可得到鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质脂质囊泡混悬液。
利用液氮将上述得到的鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液速冻固化，继而冷冻干燥24h以除去溶媒，即可得到鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质固态微粒。
2、制备载有磷脂蛋白质微粒的微球
称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌至聚乙烯醇完全溶解，停止加热，静置冷却，配制成浓度为50mg/mL的PVA水溶液，置于4℃冰箱中待用。
精确称取质量比为1：1的聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)，加入适量的二氯甲烷涡漩振荡溶解，配制成高分子载体材料浓度为100mg/mL的二氯甲烷溶液，现用现配并置于冰浴中预冷。
将步骤1制备的20mg鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质微粒分散于4mL的100mg/mL的高分子载体材料二氯甲烷溶液中，水浴超声30s使其均匀分散；然后加入50mg/mL的PVA水溶液作为外水相，高分子载体材料的二氯甲烷溶液与PVA水溶液的体积比为1：10；利用高速剪切机在冰浴、剪切速率为10000rpm、时长为1min的条件下，将两者混合制成S/O/W的乳液；而后转移至50mg/mL的氯化钠水溶液中，乳液与氯化钠水溶液的体积比为1：25，在500rpm的搅拌速率下搅拌3h以挥发有机溶剂、固化微球；离心收集微球，并用超纯水洗涤三次；将所得微球在-80℃条件下预冻过夜，最后进行冷冻干燥即得最终成品鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质微粒复合微球。
采用激光粒度分析仪(MalvemZetasizerNanoZS90)对本实施例步骤1中制备的鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质脂质囊泡混悬液进行粒径及分布的测量(结果见图4)。结果表明，本发明所制备的鲑鱼降钙素的磷脂蛋白质脂质囊泡混悬液粒径均一，呈现正态分布，平均粒径Z-Ave＝165.2±12.3nm，多分散系数PDI＝0.060±0.040。
本实施例制备鲑鱼降钙素磷脂蛋白质微粒复合微球的扫描电镜图如图1D(测定方法同实施例1)，表面光滑，球型完整，颗粒规则无粘连；其粒径呈现正态分布，粒径分布图如2D(测定方法同实施例1)，d(0.1)＝1.462μm，d(0.5)＝2.368μm，d(0.9)＝3.679μm；药物包封率达到65.34％(测试方法同实施例1)。
对比例1：牛血清白蛋白W/O/W普通微球的制备
称取适量水溶性模型蛋白药物牛血清白蛋白及冻干保护剂海藻糖溶于超纯水中，配成牛血清白蛋白20mg/mL、海藻糖10mg/mL的内水相溶液。精确称取一定量的聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)，分子量为40000，加入适量的二氯甲烷涡漩振荡溶解，配制成浓度为100mg/mL的PLGA二氯甲烷溶液，现用现配并置于冰浴中预冷作为油相。称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌至聚乙烯醇完全溶解，停止加热，静置冷却，配制成浓度为50mg/mL的PVA水溶液，置于4℃冰箱中待用作为外水相。
取一定体积的内水相溶液加入PLGA的二氯甲烷溶液中，两者体积比为3：20，利用高速剪切机在冰浴、剪切速率为16000rpm、时长为1min的条件下，将两者混合制成W/O的乳液；然后加入50mg/mL的PVA溶液，油相与外水相的体积比为1：10，利用高速剪切机在冰浴、剪切速率为10000rpm、时长为1min的条件下，将两者混合制成W/O/W的乳液；而后转移至50mg/mL的氯化钠水溶液中，乳液与氯化钠水溶液的体积比为1：25，在500rpm的搅拌速率下搅拌3h以挥发有机溶剂、固化微球；离心收集微球，并用超纯水洗涤三次；将所得微球在-80℃条件下预冻过夜，最后进行冷冻干燥即得牛血清白蛋白W/O/W普通微球。
本对比例制备的牛血清白蛋白W/O/W普通微球的扫描电镜图如图1E(测定方法同实施例1)，与实施例1的微球相比，本对比例所制备的微球大部分球型完整，但存在少部分不规则、塌陷或破碎的微球；其粒径分布图如2E(测定方法同实施例1)，与实施例1的微球相比，本对比例所制备的微球粒径并不完全呈现正态分布，存在由于部分微球聚集而使粒径增大的情况，d(0.1)＝1.217μm，d(0.5)＝3.519μm，d(0.9)＝22.255μm；其药物包封率为58.84％(测定方法同实施例1)，与实施例1相比，本对比例制备方法中牛血清白蛋白的浓度远远高于实施例1，其得到的微球的药物包封率才达到58.84％，仍比实施例1的微球低。
实施例5：检测磷脂蛋白质微粒复合微球的体外效果
精密称取实施例1所制备的磷脂蛋白质微粒复合微球与对比例1所制备的微球各10mg置于1.5mL样品离心管中，加入磷酸盐缓冲液PBS(pH＝7.4)1mL，置于气浴摇床中，在37℃、100rpm的条件下恒温震荡，于第1、2、4、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60天取样检测牛血清白蛋白的含量。取样时将样品离心管从摇床中取出，12000rpm离心5min，吸取全部上清液作为体外释放的检测样品待测；另外再加入PBS(pH＝7.4)1mL于样品离心管中，置于摇床内继续震荡。体外释放的检测样品采用MicroBCA试剂盒进行牛血清白蛋白的含量检测(结果见图5)。实验结果显示，实施例1所制备的磷脂蛋白质微粒复合微球的缓释时间可以达到55天，接近于零级释放，且首日释放量仅为9.10％±0.95％。相比之下，对比例1所制备的普通微球首日释放量达到38.39％±6.54％，突释行为明显。
实施例6：圆二色谱法检测磷脂蛋白质微粒复合微球的药物活性
称取一定量实施例1所制备的磷脂蛋白质微粒复合微球和对比例1所制备的微球分别置于7mL离心管中，加入2mL二氯甲烷或者乙腈溶解；然后将样品在12000rpm条件下离心5min，弃去上清液；随后置于真空干燥箱中除去残留溶剂；最后用适量的超纯水溶解蛋白沉淀，配成蛋白浓度约为400μg/mL的蛋白溶液；另称取适量牛血清白蛋白原料药，加水配成蛋白浓度约为400μg/mL的蛋白溶液。
利用圆二色谱法检测各样品中蛋白药物的活性：将样品加入1mm比色皿中，然后将比色皿置于圆二色谱仪中，设置波长扫描范围为180-260nm，记录各样品的圆二色谱曲线。结果显示(如图6)，与原料药溶液相比，实施例1和对比例1所制备的微球样品中的牛血清白蛋白药物均具有一致的蛋白二级结构，而且相比于对比例1的W/O/W微球，实施例1所制备的磷脂蛋白质微粒复合微球的牛血清白蛋白药物的圆二色谱曲线更接近于牛血清白蛋白原料药溶液。由此可以证明，本发明所制备的磷脂蛋白质微粒复合微球可以更加有效地保持蛋白药物的活性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将蛋白质或多肽类水溶性药物和冻干保护剂溶于水，得到的水溶液A与磷脂的醇溶液在温度为30-45℃的条件下搅拌混合，得到磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液；
(2)将磷脂蛋白质的脂质囊泡混悬液冷冻干燥除去溶媒，得到磷脂蛋白质微粒；
(3)将磷脂蛋白质微粒均匀分散于高分子载体材料的有机溶液中，再加入含有乳化剂的水溶液B，高速剪切制备成S/O/W乳液；
(4)将S/O/W乳液置于含氯化钠或聚乙烯醇的水溶液C中，搅拌，挥发有机溶剂、固化微球；
(5)离心收集微球，用超纯水洗涤微球，冷冻干燥，即得所述磷脂蛋白质微粒复合微球。
2.根据权利要求1所述的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的磷脂选自大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酸中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的磷脂选自大豆磷脂酰胆碱和/或蛋黄磷脂酰胆碱。
4.根据权利要求1-3任一项所述的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的蛋白质或多肽类水溶性药物选自牛血清白蛋白、胸腺五肽、鲑鱼降钙素、艾塞那肽、干扰素或表皮生长因子中的一种或几种。
5.根据权利要求1-3任一项所述的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇中的一种或几种，其质量为蛋白质或多肽类水溶性药物的40％-60％。
6.根据权利要求1-3任一项所述的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述醇为乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇中的一种或几种，所述水溶液A中蛋白质或多肽类水溶性药物的浓度为0.2-5mg/mL，醇溶液中磷脂的浓度为40-60mg/mL，醇溶液与水溶液A的体积比为1：3-7。
7.根据权利要求1-3任一项所述的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的高分子载体材料选自聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或两种，其分子量为10000-50000；所述高分子载体材料的有机溶液中的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮或者碳酸二甲酯中的一种或几种，高分子载体材料的浓度为40-160mg/mL。
8.根据权利要求1-3任一项所述的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述乳化剂为聚乙烯醇、吐温-60或者吐温-80中的一种或几种，所述含有乳化剂的水溶液B中乳化剂的浓度为10-70mg/mL。
9.根据权利要求1-3任一项所述的磷脂蛋白质微粒复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述磷脂蛋白质微粒与高分子载体材料的有机溶液的质量体积比为4-10mg/mL，高分子载体材料的有机溶液与含有乳化剂的水溶液B的体积比为1：3-18。
10.一种磷脂蛋白质微粒复合微球，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到。
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