CN110291401A - 成纤维细胞活化蛋白(fap)-靶向成像和治疗 - Google Patents

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Abstract

本教导通常涉及用于将患者的肿瘤微环境成像的缀合物和方法，和涉及用于将患者的肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞(CAF)成像的缀合物和方法。本教导通常涉及制备包含成纤维细胞活化蛋白(FAP)抑制剂的缀合物的方法。

Description

成纤维细胞活化蛋白(FAP)-靶向成像和治疗
相关申请的交叉参考
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2016年12月14日递交的美国临时申请序列号62/434380和2017年10月20日递交的美国临时申请序列号62/575050的优先权，其中其两者通过参考以其全部结合至本文中。
技术领域
本教导通常涉及用于将患者的肿瘤微环境成像的缀合物和方法，并且在一些实施方案中涉及用于将患者的肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞(CAF)成像的缀合物和方法。本教导还涉及用于在患者中治疗性治疗癌细胞和/或CAF的缀合物和方法。
背景
肿瘤微环境在肿瘤的生长和发育中起重要作用。除癌细胞之外，肿瘤还包括浸润免疫和炎性细胞，比如T细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓样抑制细胞、癌症相关成纤维细胞(CAF)、血液和淋巴管系统网络及细胞外基质(ECM)。没有这些细胞的帮助，肿瘤无法获得免疫逃逸、转移和抵抗特性。
CAF为肿瘤微环境中存在的主要细胞类型之一，并且在许多趋化因子、细胞因子、生长因子的分泌以及ECM的修饰和降解中起作用。CAF过度表达成纤维细胞活化蛋白α(FAP)，其在健康细胞上具有有限的表达。
FAP为II型膜整合蛋白，其属于能够切割脯氨酸-氨基酸肽键的较大的蛋白酶家族。同一家族的其他成员为二肽基肽酶IV(DPPIV)和脯氨酰寡肽酶(POP)。FAP呈现出内肽酶和外肽酶两种活性。发现FAP主要位于细胞表面，但也报道了在人体血浆中可溶形式的该蛋白质。FAP作为同型二聚体存在。发现FAP在超过90％的上皮实体肿瘤的CAF、涉及伤口愈合和重塑的组织中表达。
通过荧光引导手术改善了肿瘤块的有效手术去除。然而，靶向癌细胞中过度表达的受体/蛋白质的NIR染料缀合物仅可将抗原阳性癌细胞而非将基质细胞成像。目前，没有可用于有效地将肿瘤微环境成像的方法。因此，没有成像和手术去除这些细胞的有效方法。
概述
本发明的范围仅由所附权利要求定义，并且不受该概述中的陈述的任何程度的影响。
在以下列举的条款中描述了本发明的若干实施方案：
1.一种具有以下结构的缀合物或其药学上可接受的盐：
B-L-X，
其中B包含成纤维细胞活化蛋白(FAP)抑制剂；
L包含二价接头；和
X包含近红外(NIR)染料、放射性成像剂或有效对抗癌细胞和/或癌症相关成纤维细胞(CAF)的治疗剂。
2.条款1的缀合物，其中B具有以下结构：
其中R1和R2为相同或不同，并且各自独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；
R3为C1-C4烷基、腈或异腈；
R4、R5和R6为相同或不同，并且各自独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；和
n为1-8的整数。
3.条款2的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2的每一个为卤素。
4.条款2或3的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2的每一个为氟。
5.条款2-4中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R3为腈。
6.条款2-5中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R4、R5和R6的每一个为氢。
7.条款2-6中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中B具有以下结构：
8.条款2-7中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中B具有以下结构：
9.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头包含至少一种选自以下的D-或L-构型的氨基酸或其衍生物：Lys、Asn、Thr、Ser、Ile、Met、Pro、His、Gln、Arg、Gly、Asp、Glu、Ala、Val、Phe、Leu、Tyr、Cys和Trp。
10.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头包含至少两种独立地选自Glu和Cys的氨基酸或其衍生物。
11.条款9或10的缀合物或其药学上可接受的盐，其中氨基酸衍生物为具有与侧链羧酸共价连接以形成酰胺键的氨基糖部分的谷氨酸。
12.条款11的缀合物或其药学上可接受的盐，其中氨基糖部分为1-脱氧-1-氨基-D-葡萄糖醇。
13.条款9或10的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头包含式Glu-Glu-Glu的氨基酸部分，其中谷氨酸任选地用与侧链羧酸共价连接以形成酰胺键的氨基糖部分取代。
14.条款14的缀合物或其药学上可接受的盐，其中氨基糖部分为1-脱氧-1-氨基-D-葡萄糖醇。
15.条款13或14的缀合物，其中Glu-Glu-Glu通过羧酸侧链彼此共价键合。
16.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头包含下式的部分：
其中m为0-9的整数，p为3-10的整数，q为3-100的整数。
17.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头包含选自以下的部分：
其中
R7和R8的每一个独立地为H或C1-C6烷基；
t为1-8的整数。
18.条款17的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头具有下式：
19.条款17或18的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R7和R8为H；和t为2。
20.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头包含肼。
21.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L包含以下结构：
22.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头包含选自以下的部分：
其中R6为H或C1-C6烷基。
23.条款1的缀合物或其药学上可接受的盐，其包含下式：
24.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X包含荧光染料。
25.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X包含NIR染料。
26.条款24的缀合物或其药学上可接受的盐，其中荧光染料为荧光素马来酰亚胺或异硫氰酸荧光素(FITC)。
27.条款25的缀合物或其药学上可接受的盐，其中NIR染料为S0456。
28.条款1-24或26中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X具有以下结构：
29.条款1-23或25中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X具有以下结构：
30.具有以下结构的条款1的缀合物或其药学上可接受的盐：
31.具有以下结构的条款1的缀合物或其药学上可接受的盐：
32.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X为下式的螯合剂：
33.条款32的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X包含与螯合剂配位的放射性金属同位素。
34.一种具有以下结构的缀合物：
其中L包含二价接头；和
X包含近红外(NIR)染料。
35.具有以下结构的条款34的缀合物：
36.一种从患者手术去除癌症相关成纤维细胞(CAF)的方法，方法包括：
将缀合物传递至患者的肿瘤微环境，肿瘤微环境包含至少一个CAF，缀合物具有以下结构
其中L包含二价接头和X包含近红外(NIR)染料；
通过对其施加光学刺激引起NIR染料发荧光；和
基于荧光的结果切割患者的含有CAF的组织。
37.条款22的方法，其中通过缀合物成像的含有CAF的组织包含基质细胞。
38.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A为选自长春花生物碱、念珠藻素、硼替佐米、硫代硼替佐米、微管溶素、氨基喋呤、雷帕霉素、紫杉醇、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、依维莫司、α-鹅膏毒素、疣孢菌素、膜海鞘素B、格尔德霉素、purvalanol A、伊斯平斯、布地奈德、达沙替尼、埃博霉素、美登素和酪氨酸激酶抑制剂的药物。
39.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中药物为微管溶素。
40.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中药物为下式的四肽：
其中
R1a、R3a、R3a’和R3a”各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-OR13a、-OC(O)R13a、-OC(O)NR13aR13a’、-OS(O)R13a、-OS(O)2R13a、-SR13a、-SC(O)R13a、-S(O)R13a、-S(O)2R13a、-S(O)2OR13a、-S(O)NR13aR13a’、-S(O)2NR13aR13a’、-OS(O)NR13aR13a’、-OS(O)2NR13aR13a’、-NR13aR13a’、-NR13aC(O)R14a、-NR13aC(O)OR14a、-NR13aC(O)NR14aR14a’、-NR13aS(O)R14a、-NR13aS(O)2R14a、-NR13aS(O)NR13aR14a’、-NR13aS(O)2NR14aR14a’、-P(O)(OR13a)2、-C(O)R13a、-C(O)OR13a或-C(O)NR13aR13a’取代；
R2a、R4a和R12a各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基；
R5a和R6a各自独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-OR15a、-SR15a和-NR15aR15a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR16a、-SR16a、-NR16aR16a’、-C(O)R16a、-C(O)OR16a或-C(O)NR16aR16a’取代；或者R5a和R6a与它们所连接的碳原子一起形成-C(O)-；
每个R7a、R8a、R9a、R10a和R11a独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-CN、-NO2、-NCO、OR17a、-SR17a、-S(O)2OR17a、-NR17aR17a’、-P(O)(OR17a)2、-C(O)R17a、-C(O)OR17a和-C(O)NR17aR17a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR18a、-SR18a、-NR18aR18a’、-C(O)R18a、-C(O)OR18a或-C(O)NR18aR18a’取代；
每个R13a、R13a’、R14a、R14a’、R15a、R15a’、R16a、R16a’、R17a和R17a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基，其中C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基或5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OH、-SH、-NH2或-CO2H取代；
每个R18a和R18a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-C(O)R19a、-P(O)(OR19a)2和-S(O)2OR19a，
每个R19a独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基；和
a为1、2或3。
41.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中D为下式的四肽：
其中
R1a、R3a、R3a’和R3a”各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-OR13a,-OC(O)R13a、-OC(O)NR13aR13a’、-OS(O)R13a、-OS(O)2R13a、-SR13a、-SC(O)R13a、-S(O)R13a、-S(O)2R13a、-S(O)2OR13a、-S(O)NR13aR13a’、-S(O)2NR13aR13a’、-OS(O)NR13aR13a’、-OS(O)2NR13aR13a’、-NR13aR13a’、-NR13aC(O)R14a、-NR13aC(O)OR14a、-NR13aC(O)NR14aR14a’、-NR13aS(O)R14a、-NR13aS(O)2R14a、-NR13aS(O)NR13aR14a’、-NR13aS(O)2NR14aR14a’、-P(O)(OR13a)2、-C(O)R13a、-C(O)OR13a或-C(O)NR13aR13a’取代；
R2a、R4a和R12a各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基；
R5a选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-OR15a、-SR15a和-NR15aR15a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR16a、-SR16a、-NR16aR16a’、
-C(O)R16a、-C(O)OR16a或-C(O)NR16aR16a’取代；
每个R7a、R8a、R9a、R10a和R11a独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-CN、-NO2、-NCO、-OR17a、-SR17a、-S(O)2OR17a、-NR17aR17a’、-P(O)(OR17a)2、-C(O)R17a、-C(O)OR17a和-C(O)NR17aR17a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR18a、-SR18a、-NR18aR18a’、-C(O)R18a、-C(O)OR18a或-C(O)NR18aR18a’取代；
每个R13a、R13a’、R14a、R14a’、R15a、R15a’、R16a、R16a’、R17a和R17a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基，其中C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基或5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OH、-SH、-NH2或-CO2H取代；
每个R18a和R18a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-C(O)R19a、-P(O)(OR19a)2和-S(O)2OR19a，
每个R19a独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基；和
a为1、2或3。
42.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中D为下式的四肽：
其中
R9a选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-CN、-NO2、-NCO、-OR17a、-SR17a、-S(O)2OR17a、-NR17aR17a’、-P(O)(OR17a)2、-C(O)R17a、-C(O)OR17a和-C(O)NR17aR17a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR18a、-SR18a、-NR18aR18a’、-C(O)R18a、-C(O)OR18a或-C(O)NR18aR18a’取代；
每个R13a、R17a和R17a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基，其中C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基或5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OH、-SH、-NH2或-CO2H取代；
每个R18a和R18a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-C(O)R19a、-P(O)(OR19a)2和-S(O)2OR19a，
每个R19a独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基。
43.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A为天然存在的微管溶素。
44.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A选自微管溶素A、微管溶素B、微管溶素C、微管溶素D、微管溶素E、微管溶素F、微管溶素G、微管溶素H和微管溶素I。
45.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中药物为微管溶素B。
46.条款1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A具有下式：
47.前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A具有下式：
48.一种下式的缀合物或其药学上可接受的盐：
49.条款48的缀合物或其药学上可接受的盐，其中缀合物包含与其配位的选自111In、99mTc、64Cu、67Cu、67Ga和68Ga的放射性金属同位素。
50.条款49的缀合物，其中放射性金属同位素为99mTc。
51.一种下式的缀合物或其药学上可接受的盐：
52.一种下式的缀合物或其药学上可接受的盐：
53.一种药用组合物，其包含前述条款中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐和任选地至少一种药学上可接受的赋形剂。
54.一种在受试者中治疗癌症的方法，其包括：
a.给予受试者有效量的条款1-23、38-47或51中任何一项的缀合物或组合物或其药学上可接受的盐。
55.条款54的方法，其中受试者患有表达FAP的癌症。
56.条款54或55的方法，其中表达FAP的癌症为原发性或转移性的。
57.条款44-56中任何一项的方法，其中癌症选自前列腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌和脑癌。
58.条款1-23、38-47或51中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其用于在受试者中治疗表达FAP的癌症的方法。
59.条款58的缀合物，其中方法包括给予受试者有效治疗表达FAP的癌症的量的缀合物。
60.条款58或59的缀合物，其中表达FAP的癌症选自前列腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌和脑癌。
61.条款1-23、38-47或51中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐在制备用于在受试者中治疗表达FAP的癌症的药物中的用途。
62.条款61的用途，其中表达FAP的癌症选自前列腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌和脑癌。
63.一种在体外将细胞群成像的方法，方法包括
a.使细胞与条款1-31中任何一项的缀合物接触，以提供标记的细胞，和
b.使标记的细胞可视化。
64.条款1-31中任何一项的缀合物，其用于在体外将细胞群成像的方法。
65.条款63的缀合物，其中方法包括：
a.使细胞与条款1-31中任何一项的缀合物接触，以提供标记的细胞，和
b.使标记的细胞可视化。
66.一种在体内将细胞群成像的方法，方法包括
a.给予患者有效量的条款1-23、32、33、48或49中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，以提供标记的细胞，和
b.通过成像使标记的细胞可视化。
67.条款1-23、32、33、48或49中任何一项的缀合物，其用于在体外将细胞群成像的方法。
68.条款67的缀合物，其中方法包括：
a.给予患者有效量的条款1-23、32、33、48或49中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，以提供标记的细胞，和
b.通过成像使标记的细胞可视化。
附图简述
图1显示化合物3的化学结构和LC/MS迹线。
图2显示化合物4的化学结构和LC/MS迹线。
图3显示化合物5的化学结构和LC/MS迹线。
图4显示化合物7的化学结构和LC/MS迹线。
图5显示化合物8(JFL)的化学结构和LC/MS迹线。
图6显示化合物10的化学结构和LC/MS迹线。
图7显示JFL-L1的化学结构和LC/MS迹线。
图8显示JFL-L1-FM的化学结构和LC/MS迹线。
图9显示S0456马来酰亚胺的化学结构和LC/MS迹线。
图10显示JFL-L1-S0456的化学结构和LC/MS迹线。
图11显示使用JFL-L1-FM的体外共聚焦成像结果。
图12显示如通过荧光相对于浓度测定的JFL-L1-S0456FAP转染的HEK293细胞的体外结合亲和力。
图13显示FaDu小鼠异种移植物中的JFL-L1-S0456的体内成像。
图14显示KB小鼠异种移植物中的JFL-L1-S0456的体内成像。
图15显示HT29小鼠异种移植物中的JFL-L1-S0456的体内成像。
图16显示MDA-MB231小鼠异种移植物中的JFL-L1-S0456的体内成像。
图17显示JFL-L1-TubBH的LC/MS迹线。
图18A显示随着时间的推移响应于用JFL-L1-TubBH治疗的肿瘤体积和图18B显示用于实验的小鼠的体重。(▲)对照；(◆)FAP-竞争；(-)连续数天-FAP-TubBH(40nmoles)；(●)每日FAP-TubBH(40nmoles)。
图19A显示随着时间的推移响应于JFL-L1-TubBH和JFL-L1-TubBH与其他治疗的组合的肿瘤体积，和图19B显示用于实验的小鼠的体重。(Δ)对照；(▲)FAP-竞争；(■)FAP-TubBH；(▼)叶酸-TLR7；(●)叶酸-PI3K；(□)FAP-TubBH&叶酸-TLR7；(○)FAP-TubBH&叶酸-PI3K。
图20A显示随着时间的推移响应于JFL-L1-FM的肿瘤体积和图20B显示用于实验的小鼠的体重。(○)对照；(■)FAP-FM；(●)FAP-竞争。
图21A-B显示JFL-L2-S0456的LC/MS迹线。
图22A-C显示用JFL-L2-S0456的体内成像。
图23显示使用不同浓度的JFL-L1-S0456的体内成像。
图24A-B显示混合成像：靶向FAPα和LHRH-R的NIR缀合物。
图25A-B显示JFL-L3的LC/MS迹线。
图26显示JFL-L3的体外结合亲和力。
图27A-C显示JFL-L3的体内成像。
详述
通过以下列举的条款描述本发明的若干实施方案，并且考虑这些实施方案与该详述部分所述的实施方案的任何组合。应当理解，以下描述的各种代表性实施方案的要素和特征可以不同方式组合以产生同样落入本教导的范围内的新实施方案。
1.一种具有以下结构的缀合物：
B-L-X，
其中B包含成纤维细胞活化蛋白(FAP)抑制剂；L包含二价接头；和X包含近红外(NIR)染料、放射性成像剂或对癌细胞和/或癌症相关成纤维细胞(CAF)有效的治疗剂。
2.条款1的缀合物，其中B具有以下结构：
其中R1和R2为相同或不同，并且各自独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；R3为C1-C4烷基、腈或异腈；和R4、R5和R6为相同或不同，并且各自独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基。
3.任何一项前述条款的缀合物，其中R1和R2的每一个为卤素。
4.任何一项前述条款的缀合物，其中R1和R2的每一个为氟。
5.任何一项前述条款的缀合物，其中R3为腈。
6.任何一项前述条款的缀合物，其中R4、R5和R6的每一个为氢。
7.任何一项前述条款的缀合物，其中B具有以下结构：
8.任何一项前述条款的缀合物，其中B具有以下结构：
9.任何一项前述条款的缀合物，其中L包含以下结构：
10.任何一项前述条款的缀合物，其中L包含以下结构：
11.任何一项前述条款的缀合物，其中X包含NIR染料。
12.任何一项前述条款的缀合物，其中NIR染料为异硫氰酸荧光素(FITC)。
13.任何一项前述条款的缀合物，其中NIR染料为S0456。
14.任何一项前述条款的缀合物，其中X具有以下结构：
15.任何一项前述条款的缀合物，其中X具有以下结构：
16.任何一项前述条款的具有以下结构的缀合物：
17.任何一项前述条款的具有以下结构的缀合物：
18.条款1-10中任何一项的缀合物，其中X包含放射性成像剂。
19.条款1-10中任何一项的缀合物，其中X包含对癌细胞和/或CAF有效的治疗剂。
20.一种具有以下结构的缀合物：
其中L包含二价接头；和X包含近红外(NIR)染料。
21.条款20的具有以下结构的缀合物：
22.一种从患者手术去除癌症相关成纤维细胞(CAF)的方法，方法包括：
将缀合物传递至患者的肿瘤微环境，肿瘤微环境包含至少一个CAF，缀合物具有以下结构
其中L包含二价接头和X包含近红外(NIR)染料；通过对其施加光学刺激引起NIR染料发荧光；和基于荧光的结果切割患者的含有CAF的组织。
23.条款22的方法，其中通过缀合物成像的含有CAF的组织包含基质细胞。
在上述的每一个和以下实施方案的每一个中，应当理解，所述式不仅包括和表示缀合物的所有药学上可接受的盐，而且包括缀合物式的任何和所有水合物和/或溶剂合物。应当意识到，某些官能团(比如羟基、氨基等)，以缀合物的各种物理形式与水和/或各种溶剂形成复合物和/或配位缀合物。因此，上式应理解为包括并表示那些各种水合物和/或溶剂合物。还应当理解，缀合物式的非水合物和/或非溶剂合物通过这种式以及缀合物式的水合物和/或溶剂合物描述。
在整个本描述和所附权利要求中，应当理解以下定义：
本文使用的短语“C1-C4烷基”是指含有1-4个碳原子的直链、支链或环状烃链。本教导的C1-C4烷基的代表性实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基和环丁基。
本文使用的术语“卤素”是指氟、氯、碘或溴。
本文使用的“氨基酸”(也称为“AA”)意指包含与氨基和酸基共价键合的α-碳原子的任何分子。酸基可包括羧基。“氨基酸”可包括具有下式之一的分子或其衍生物：
其中R’为侧基和Φ包含至少3个碳原子。“氨基酸”包括立体异构体比如D-氨基酸和L-氨基酸形式。说明性的氨基酸基团包括(但不限于)20种内源性的人体氨基酸及其衍生物，比如赖氨酸(Lys)、天冬酰胺(Asn)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)、磷酸丝氨酸(PSER)、磺基半胱氨酸、精氨基琥珀酸(ASA)、羟基脯氨酸、磷酸乙醇胺(PEA)、肌氨酸(SARC)、牛磺酸(TAU)、肌肽(CARN)、瓜氨酸(CIT)、鹅肌肽(ANS)、1,3-甲基-组氨酸(ME-HIS)、α-氨基己二酸(AAA)、β-丙氨酸(BALA)、乙醇胺(ETN)、γ-氨基丁酸(GABA)、β-氨基-异丁酸(BAIA)、α-氨基丁酸(BABA)、L-别胱硫醚(胱硫醚-A；CYSTA-A)、L-胱硫醚(胱硫醚-B；CYSTA-B)、胱氨酸、别异亮氨酸(ALLO-ILE)、DL-羟基赖氨酸(羟基赖氨酸(I))、DL-别羟基赖氨酸(羟基赖氨酸(2))、鸟氨酸(ORN)、高胱氨酸(HCY)及其衍生物。连同本文所述的实施方案，氨基酸可通过其α-氨基和羧基官能团(即以肽键构型)或通过其侧链官能团(比如谷氨酸中的侧链羧基)及其α-氨基或羧基官能团共价连接于本文所述的缀合物的其他部分。应当理解，当连同本文所述的缀合物一起使用时，氨基酸可作为两性离子存在于其中掺入它们的缀合物中。
在一些实施方案中，氨基酸的衍生物包括在侧链上包含在天然氨基酸上不存在的取代基的氨基酸。以上提供一些衍生物的实例。在一些实施方案中，谷氨酸的衍生物包含胺取代基通过谷氨酸侧链上的羧酸的共价连接以形成酰胺键。在一些实施方案中，胺取代基为氨基糖，比如如下所示的1-脱氧-1-氨基-D-葡萄糖醇。
本文使用的短语“治疗有效量”是指在研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在探寻的受试者(即组织系统、动物或人)引发生物或药物反应(包括(但不限于)减轻所治疗的疾病或障碍的症状)的药物或药用物质的量。在一个方面，治疗有效量为可以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗或减轻疾病或疾病的症状的活性物质的量。另一方面，治疗有效量为非活性前药的量，其在通过正常代谢过程转化时产生能够在正在探寻的受试者引发生物或药物反应的一定量的活性药物。
还应当意识到，无论是指涉单一疗法还是组合疗法，有利地参考在给予一种或多种本文所述的缀合物期间可能发生的任何毒性或其他不期望的副作用来选择剂量。进一步地，应当意识到，本文所述的协同疗法可使得给予较低剂量的显示出这种毒性或其他不期望的副作用的缀合物，其中那些较低剂量低于毒性阈值或者在治疗窗口中低于在没有协同疗法的情况下给予的那些剂量。
本文使用的术语“给予”包括将本文所述的缀合物和组合物引入到宿主动物的所有方式，包括(但不限于)口服(po)、静脉内(iv)、肌内(im)、皮下(sc)、透皮、吸入、颊、眼、舌下、阴道、直肠等。本文所述的缀合物和组合物可以含有常规非毒性药学上可接受的载体、辅剂和/或媒介物的单位剂型和/或制剂给予。
本文使用的短语“药用组合物”或“组合物”是指本教导的一种或多种缀合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物与其他化学组分(比如药学上可接受的赋形剂)的混合物。药用组合物的目的为便于将缀合物给予受试者。适用于本教导的缀合物的传递的药用组合物及其制备方法对于本领域的技术人员为易于显而易见的。这种组合物及其制备方法可例如在Remington's Pharmaceutical Sciences,19th Edition(Mack PublishingCompany,1995)中发现。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管可在本教导的实践或测试中使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法、装置和材料，但现在描述优选的方法、装置和材料。
在一些实施方案中，本教导的缀合物包括成像剂，比如近红外(NIR)染料或放射性成像剂。可用作本教导的成像剂的代表性化合物包括(但不限于)染料(例如罗丹明染料、花青染料、荧光素染料等)、PET成像剂、放射性标记的试剂等。罗丹明染料的代表性实例包括(但不限于)5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、罗丹明B、罗丹明6G、TRITC、德克萨斯红、罗丹明123、磺基罗丹明101等。荧光素染料的实例包括(但不限于)荧光素、荧光素马来酰亚胺(FM)、5-氨基荧光素、6-氨基荧光素、异氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、Oregon Green、Tokyo Green、Singapore Green、Philadelphia Green等。可根据本教导使用的代表性的近红外染料包括(但不限于)LS288、IR800、SP054、S0121、KODAK、IRD28、S2076、S0456及其衍生物。
在一些实施方案中，放射性标记的试剂可用作本教导的成像剂。在一些实施方案中，罗丹明染料或荧光素染料可为同位素标记的。适合于包含在缀合物中的同位素的实例包括氢(例如2H和3H)、碳(例如11C、13C和14C)、氯(例如36Cl)、氟(例如18F)、碘(例如123I和125I)、氮(例如13N和15N)、氧(例如15O、17O和18O)、磷(例如32P)和硫(例如35S)的同位素。
某些同位素标记的缀合物，例如掺入放射性同位素的那些缀合物，可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚(即3H)和碳-14(即14C)鉴于其易于掺入和现成的检测手段而特别适用于该目的。
用正电子发射同位素(比如11C、18F和13N)取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查底物受体占有率。同位素标记的缀合物通常可通过本领域的技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例所述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替先前使用的未标记的试剂来制备。
在一些实施方案中，本公开提供用于在体外或体内将细胞群或组织成像的方法。应当意识到，这种体外方法可通过本领域已知的任何方法进行。在一些实施方案中，本文所述的体外成像方法可包括(a)使细胞群与适合于成像的本教导的缀合物接触，以提供与表达FAP蛋白的细胞结合的缀合物，和(b)通过用光照射使与细胞结合的缀合物可视化。应当意识到，通过用光照射使与细胞结合的缀合物可视化可包括在激发波长下照射和在发射波长下检测。因此，在一些实施方案中，本文所述的体外成像方法可包括(a)使细胞群与适合于成像的本教导的缀合物接触，以提供与表达FAP蛋白的细胞结合的缀合物，(b)用激发波长的光照射与表达FAP蛋白的细胞结合的缀合物，和(c)以发射波长检测从癌细胞发射的光。
在一些实施方案中，可根据本文所述的方法将组织(比如癌性肿瘤)成像。例如，在一些实施方案中，本教导的体内成像方法可包括：(a)给予患者适合于成像的本教导的缀合物或其药学上可接受的盐，以提供与表达FAP蛋白的细胞结合的缀合物；和(b)通过用光照射使与表达FAP蛋白的细胞结合的缀合物可视化。应当意识到，通过用光照射使与细胞结合的缀合物可视化可包括在激发波长下照射和在发射波长下检测。因此，在一些实施方案中，本文所述的体内成像方法可包括：(a)给予患者适合于成像的本文所述的缀合物或其药学上可接受的盐，以提供与表达FAP蛋白的细胞结合的缀合物；(b)用激发波长的光照射与表达FAP蛋白的细胞结合的缀合物；和(c)以发射波长检测从癌细胞发射的光。应当意识到，可使用本领域已知的任何已知成像技术(诊断或其他)或仪器来进行通过用光照射使与细胞结合的缀合物可视化。
在一些实施方案中，本教导的缀合物包括治疗剂，其在一些实施方案中对癌细胞和/或癌症相关成纤维细胞(CAF)为治疗有效的。根据本教导使用的治疗剂可为能够调节或者以其它方式修改细胞功能的任何分子，包括药用活性化合物(例如治疗剂)或能够为将细胞或组织成像或可视化提供可测量的信号的任何分子(例如成像剂)。
可用作治疗剂的合适分子包括(但不限于)肽、寡肽、逆向反式寡肽、蛋白质、其中至少一个非肽键取代肽键的蛋白质类似物、载脂蛋白、糖蛋白、酶、辅酶、酶抑制剂、氨基酸及其衍生物、受体及其他膜蛋白；抗原及其抗体；半抗原及其抗体；激素、脂类、磷脂、脂质体；毒素；抗生素；镇痛剂；支气管扩张剂；β-阻断剂；抗微生物剂；抗高血压药；心血管药物(包括抗心律失常药、强心苷类、抗心绞痛药和血管扩张剂)；中枢神经系统药物(包括兴奋剂、精神药物、抗躁狂药和抑制剂)；抗病毒剂；抗组胺药；癌症药物(包括化学治疗剂)；镇静剂；抗抑郁药物；H-2拮抗剂；抗惊厥药；止恶心药；前列腺素类和前列腺素类似物；肌肉松弛剂；抗炎物质；兴奋剂；减充血剂；止吐剂；利尿剂；解痉剂；平喘药；抗帕金森剂；祛痰药；止咳药；黏液溶解剂；和矿物和营养添加剂。
在一些实施方案中，治疗剂可为微管溶素。天然微管溶素通常为线性四肽，由N-甲基哌啶酸(Mep)、异亮氨酸(Ile)、称为管式缬氨酸(Tuv)的非天然氨基酸和称为管式酪氨酸(Tut,酪氨酸的类似物)的非天然氨基酸或称为管式苯丙氨酸(Tup,苯丙氨酸的类似物)的非天然氨基酸组成。
在一些实施方案中，治疗剂为下式的四肽：
R1a、R3a、R3a’和R3a”各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-OR13a、-OC(O)R13a、-OC(O)NR13aR13a’、-OS(O)R13a、-OS(O)2R13a、-SR13a、-SC(O)R13a、-S(O)R13a、-S(O)2R13a、-S(O)2OR13a、-S(O)NR13aR13a’、-S(O)2NR13aR13a’、-OS(O)NR13aR13a’、-OS(O)2NR13aR13a’、-NR13aR13a’、-NR13aC(O)R14a、-NR13aC(O)OR14a、-NR13aC(O)NR14aR14a’、-NR13aS(O)R14a、-NR13aS(O)2R14a、-NR13aS(O)NR13aR14a’、-NR13aS(O)2NR14aR14a’、-P(O)(OR13a)2、-C(O)R13a、-C(O)OR13a或-C(O)NR13aR13a’取代；
R2a、R4a和R12a各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基；
R5a和R6a各自独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-OR15a、-SR15a和-NR15aR15a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR16a、-SR16a、-NR16aR16a’、-C(O)R16a、-C(O)OR16a或-C(O)NR16aR16a’取代；或者R5a和R6a与它们所连接的碳原子一起形成-C(O)-；
每个R7a、R8a、R9a、R10a和R11a独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-CN、-NO2、-NCO、OR17a、-SR17a、-S(O)2OR17a、-NR17aR17a’、-P(O)(OR17a)2、-C(O)R17a、-C(O)OR17a和-C(O)NR17aR17a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR18a、-SR18a、-NR18aR18a’、-C(O)R18a、-C(O)OR18a或-C(O)NR18aR18a’取代；
每个R13a、R13a’、R14a、R14a’、R15a、R15a’、R16a、R16a’、R17a和R17a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基，其中C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基或5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OH、-SH、-NH2或-CO2H取代；
每个R18a和R18a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-C(O)R19a、-P(O)(OR19a)2和-S(O)2OR19a，
每个R19a独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基；
a为1、2或3；和
*表示与缀合物的其余部分的共价键。
在一些实施方案中，治疗剂具有下式：
其中R1a、R2a、R3a、R3a’、R3a”、R4a、R5a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a和R12a如本文所述，和*表示与缀合物的其余部分的共价键。
在另一个实施方案中，治疗剂可为以下通式的天然存在的微管溶素或其类似物或衍生物：
其中R9a和R13a如本文所述，和*表示与缀合物的其余部分的共价键。
本文描述每种上述微管溶素的缀合物。
在一些实施方案中，治疗剂可为以下通式的天然存在的微管溶素
因子 R<sup>13a</sup> R<sup>9a</sup>
A (CH<sub>3</sub>)<sub>2</sub>CHCH<sub>2</sub> OH
B CH<sub>3</sub>(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub> OH
C CH<sub>3</sub>CH<sub>2</sub> OH
D (CH<sub>3</sub>)<sub>2</sub>CHCH<sub>2</sub> H
E CH<sub>3</sub>(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub> H
F CH<sub>2</sub>CH<sub>3</sub> H
G (CH<sub>3</sub>)<sub>2</sub>C＝CH OH
H CH<sub>3</sub> H
I CH<sub>3</sub> OH
和*表示与缀合物的其余部分的共价键。
在一些实施方案中，本教导的方法可用于作为“受试者”的人类临床医学和兽医应用二者。因此，“受试者”可被给予本教导的缀合物，并且可为人类(“患者”)，或者在兽医应用的情况下可为实验室、农业、家养或野生动物。在一些实施方案中，受试者可为人类患者；实验室动物比如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔子、猴子、黑猩猩；家养动物比如狗、猫和兔子；农业动物比如牛、马、猪、绵羊、山羊；和圈养的野生动物比如熊、熊猫、狮子、老虎、豹、大象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚和鲸鱼。
在一些实施方案中，本文所述的癌症可为致瘤性的癌细胞群，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，或者癌症可为非致瘤性的。癌症可自发地或通过过程比如患者种系中存在的突变或体细胞突变产生，或者癌症可为化学、病毒或辐射诱导的。适用于本教导的癌症包括(但不限于)癌、肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、鼻咽癌、白血病、腺癌和骨髓瘤。
在一些实施方案中，癌症可为肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部癌症、颈部癌症、皮肤黑素瘤、眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、平滑肌肉瘤、直肠癌，胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌症、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、胆管癌、Hurthle细胞甲状腺癌或胃食管连接处的腺癌。
在本文所述方法的一些实施方案中，提供本教导的缀合物的药学上可接受的盐。本教导的缀合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐和碱盐。
合适的酸加成盐由形成非毒性盐的酸形成。说明性的实例包括(但不限于)乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、枸橼酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
本文所述的缀合物的合适的碱盐由形成非毒性盐的碱形成。说明性的实例包括(但不限于)精氨酸、苄星、钙、胆碱、二乙胺、二醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、醇胺、钾、钠、氨丁三醇和锌盐。也可形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。
在一些实施方案中，本教导的缀合物可作为与一种或多种药学上可接受的载体联合的制剂给予。载体可为赋形剂。载体的选择可取决于因素比如特定给予方式、载体对溶解度和稳定性的影响以及剂型的性质。适合于本文所述的缀合物的传递的药用组合物及其制备方法对本领域的技术人员为易于显而易见的。这种组合物及其制备方法可例如在Remington:The Science&Practice of Pharmacy,21th Edition(Lippincott Williams&Wilkins,2005)中发现。
在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等及其组合。在一些实施方案中，载体适合于非肠道给予。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。补充的活性化合物也可掺入到本发明的组合物中。
在一些实施方案中，液体制剂可包括混悬剂和溶液剂。这种制剂可包含载体(例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油)和一种或多种乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂也可通过固体的重构来制备。
在一些实施方案中，水性混悬剂可含有与适当的赋形剂混合的活性物质。这种赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，其可为天然存在的磷脂，例如卵磷脂；环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇；环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物比如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬剂还可含有一种或多种防腐剂，例如抗坏血酸、对羟基苯甲酸乙基、正丙基酯；或者一种或多种着色剂。
在一些实施方案中，适合于通过加入水制备水性混悬剂的可分散粉剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。还可存在另外的赋形剂，例如着色剂。
合适的乳化剂可为天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；和酯类，包括衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯(例如脱水山梨糖醇单油酸酯)和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。
在一些实施方案中，组合物中可包含等渗剂，例如糖类、多元醇比如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)，可实现可注射组合物的延长吸收。
用于口服给予的说明性形式包括(但不限于)片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等。
取决于本文所述的癌症类型、给予途径和/或缀合物是局部还是全身给予，本文考虑广泛范围的可允许剂量，包括落入约1μg/kg-约1g/kg范围内的剂量。剂量可为单一或分开的，并且可根据广泛范围的方案给予，包括q.d.、b.i.d.、t.i.d.或者甚至每隔一天一次、每周两次(b.i.w)、每周一次、每月一次、每季度一次等。在这些情况的每一种中，应当理解本文所述的治疗有效量对应于给予实例，或者对应于如通过给药方案确定的每日、每周、每月或每季度总剂量。
在一些实施方案中，本教导的缀合物可直接给予到血流、肌肉或内部器官中。用于这种非肠道给予的合适途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、硬膜外、脑室内、尿道内、胸骨内、颅内、肿瘤内、肌内和皮下传递。用于非肠道给予的合适方式包括针式(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术。
在一些实施方案中，非肠道制剂一般地为水溶液剂，其可含有载体或赋形剂比如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地为pH 3-9)，但是对于一些应用，它们可更合适地配制成无菌非水溶液剂或作为干燥形式连同合适的媒介物比如无菌无热原水一起使用。在其他实施方案中，本文所述的任何液体制剂可适用于非肠道给予本文所述的缀合物。在无菌条件下制备非肠道制剂，例如通过在无菌条件下冻干，可使用本领域技术人员熟知的标准制药技术易于完成。在一些实施方案中，通过使用合适的制剂技术，比如掺入溶解度增强剂，可增加用于制备非肠道制剂的本文所述的缀合物的溶解度。
在一些实施方案中，用于非肠道给予的制剂可配制用于立即和/或改进释放。在一些实施方案中，本教导的活性剂(即本文所述的缀合物)可以定时释放制剂，例如以包含缓释聚合物的组合物给予。可用保护缀合物免于快速释放的载体制备活性剂，比如控释制剂，包括植入物和微囊化传递系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PGLA)。用于制备这种制剂的方法通常为本领域的技术人员已知的。在其他实施方案中，在适当的情况下，可连续给予本教导的缀合物或包含缀合物的组合物。
在一些实施方案中，提供一种试剂盒。如果要给予本文所述的活性缀合物的组合，则可以适合于依序给予或共同给予组合物的试剂盒的形式组合两种或多种药用组合物。这种试剂盒可包含两种或多种单独的药用组合物(其中至少一种含有本教导的缀合物)和用于分别保留组合物的装置(比如容器、分开的瓶子或分开的箔纸包装)。在一些实施方案中，提供包含一种或多种本文所述的缀合物的组合物，组合物在具有标签的容器中，标签提供本文所述的缀合物用于患者选择和/或治疗的说明书。
本文使用的术语“试剂盒”是指用于实施本教导的方法的材料组件。试剂盒的组分可在相同或单独的容器中(这取决于其交叉反应性和稳定性和以液体还是固体形式)以包装的组合提供。可选择试剂盒中提供的组分的量和比例，以便为特定应用提供最佳结果。尽管在一些实施方案中，待给予(例如给予患者)的组分可以单独的物理形式(例如含有一种或多种组合物和一种或多种流体的试剂盒)提供，但应当理解，在其他实施方案中，所有待引入患者的组分可以一种共同的物理形式(例如一种组合物或一种流体)一起提供。
包含在本教导的试剂盒中的组分可以各种方式的容器提供，使得基本上保持不同组分的活性，而组分本身基本上不被容器的材料吸附或改变。合适的容器包括(但不限于)安瓿、瓶子、试管、小瓶、烧瓶、注射器、袋子和封袋(例如衬箔的)等。容器可由任何合适的材料形成，包括(但不限于)玻璃、有机聚合物(例如聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等)、陶瓷、金属(例如铝)、金属合金(例如钢)、软木塞等。另外，容器可含有一个或多个进入端口(例如用于经针进入)，比如可由隔垫提供。用于隔垫的优选材料包括橡胶和聚合物，包括(但不限于)例如由DuPont(Wilmington,Del.)以商品名TEFLON销售的类型的聚四氟乙烯。另外，容器可含有两个或更多个由隔断或隔膜隔开的隔室，隔断或隔膜可被移除以使得组分能够混合。
本教导的试剂盒还可提供有本领域已知的和/或从商业和用户角度可能期望的其他物品，包括(但不限于)用于将试剂盒的组分添加到热交换系统的说明书。
用本发明的试剂盒提供的说明材料可印刷(例如在纸上)和/或以电子可读介质(例如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、压缩磁盘、录像带、录音带等)提供。或者，说明书可通过将用户引导到因特网网站(例如由试剂盒的制造商或分销商指定)和/或经电子邮件、文本信息、社交媒体和/或类似途径及其组合来提供。
在一些实施方案中，无菌可注射溶液剂可通过将活性剂以所需的量掺入到根据需要含有上述成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。一般地，分散剂通过将缀合物掺入到含有分散介质和上述那些的任何另外成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液剂的任何另外期望的成分的粉末，或者成分可一起无菌过滤。
组合物可配制成溶液剂、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在一些实施方案中，例如通过使用包衣比如卵磷脂、通过在分散剂的情况下保持期望的粒度和通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。
可使用任何有效的用于给予本文所述的缀合物的方案。例如，本文所述的缀合物可作为单剂量给予，或者可将剂量分开并作为多剂量每日方案给予。进一步地，交错的方案，例如每周1-5天可用作每日治疗的备选方案，并且出于本文所述方法的目的，这种间歇或交错的每日方案认为等同于每日治疗并加以考虑。在一些实施方案中，用多次注射本教导的缀合物治疗患者以治疗癌症。在一些实施方案中，患者用本教导的缀合物例如以12-72小时间隔或以48-72小时间隔注射多次(例如约2次至多达约50次)。可在初始注射之后以数天或数月的间隔给予患者本教导的缀合物的另外注射，并且另外的注射可预防癌症的复发。
可使用本教导的缀合物的任何合适的治疗过程。在一些实施方案中，选择单独的给药和剂量方案以提供在1个月期间给予约15mg的总剂量。在一些实例中，本教导的缀合物以每周5天，在每4周周期的第1、2和3周给予，第4周不给予的单每日剂量给予。在一个备选实例中，本教导的缀合物以每周3天，在每4周周期的第1和3周给予，第2和4周不给予给予的单每日剂量给予。在一个备选实例中，本教导的缀合物在第1和2周每周两次(即在3周周期的第1、4、8、11天)给予。在一个备选实例中，本文所述的缀合物在第1和2周每周一次(即在3周循环的第1和8天)给予。
本教导的缀合物的单一每日剂量可根据患者状况、所治疗的癌症、本文所述的缀合物的给予途径和组织分布以及共同使用的其他治疗性治疗(比如组合疗法中的放射疗法或另外药物)的可能性而显著变化。待给予患者的有效量基于体表面积、体重和医师对患者状况的评价。治疗有效剂量(本文也称为“治疗有效量”)可例如在约0.5mg/m2-约20.0mg/m2的范围内。
本教导的缀合物可含有一个或多个手性中心，或者可能够作为多个立体异构体存在。因此，应当理解，本发明包括纯立体异构体以及立体异构体的混合物，比如对映异构体、非对映异构体和对映异构体或非对映异构体富集的混合物。本教导的缀合物可能够作为几何异构体存在。因此，应当理解，本发明包括纯几何异构体或几何异构体的混合物。
应当意识到，本教导的缀合物可以未溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。通常，溶剂化形式等同于未溶剂化形式，并且包括在本发明的范围内。本文所述的缀合物可以多种结晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本发明所考虑的用途是等同的，并且旨在处于本发明的范围内。
在一些实施方案中，用于给予本教导的缀合物的组合物和/或剂型由纯度为至少约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或约99.5％的缀合物制备。在其他实施方案中，用于给予本教导的缀合物的组合物和/或剂型由纯度为至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.5％的缀合物制备。
本文所述的靶向FAP的成像剂使得能够将肿瘤微环境成像并且可使得外科医生能够通过荧光引导手术解剖CAF细胞。本文所述的成像剂与其他靶向癌细胞的成像剂组合，可通过使得外科医生能够去除肿瘤微环境的CAF细胞而进一步增强荧光引导手术的效果，这是靶向癌细胞的成像剂无法实现的。与仅用靶向癌细胞的成像剂成像相比较，这还可减少由于剩余CAF导致的手术后肿瘤复发的可能性。
另外，本文所述的试剂和方法可为其中癌细胞本身不表达癌症相关抗原比如LHRH-R、叶酸受体、PSMA等，但支持那些癌症的CAF表达FAP的癌症的荧光引导手术敞开大门。肿瘤微环境细胞的解剖将进一步有助于减少手术后癌症的复发。在一些实施方案中，靶向FAP的近红外染料缀合物可与其他靶向癌细胞的成像剂组合以使得能够将癌细胞和肿瘤微环境两者成像。
除了FAP抑制剂的靶向特异性之外，本文所述的靶向FAP的近红外染料缀合物可使得具有高肿瘤穿透、低光漂白和高信噪比。另外，染料缀合物可从受体阴性组织快速清除。由于FAP在大多数实体肿瘤的CAF中表达，因此靶向FAP的NIR染料可用于将许多类型的癌症成像。
以下实施例和代表性程序说明本教导的特征，并且仅通过说明的方式提供。它们不旨在限制所附权利要求或其等同物的范围。
材料。苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBop)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(DIPEA)、异丙醇(IPA)、二氯甲烷(DCM)和三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷(TIPS)和所有其他化学试剂购自Sigma-Aldrich。细胞培养试剂比如Rosewell park memorial institute medium 1640(RPMI 1640)购自GIBCO，而胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素、2Mm谷氨酰胺购自Life Technologies。
化合物实施例
方案1.成纤维细胞活化蛋白α(FAP)配体JFL的合成。试剂和条件：a)HATU(无水)，DIPEA(无水)，DMF，rt；b)TFAA(无水)，DCM(无水)，吡啶，rt；c)TFA，rt；d)HATU(无水)，DIPEA(无水)，DMF，rt；e)TFA，rt。
通过使用HATU作为偶联剂使化合物1和2偶联来开始JFL的合成，得到化合物3。通过使用TFAA将化合物3上的酰胺基转化为腈(化合物4)。然后使化合物4经受Boc脱保护，随后与化合物6偶联，得到化合物7。通过使化合物7上的Boc基团脱保护得到化合物8。化合物8在本文或者称为FAP配体JFL。
化合物3.向1在无水DMF中的溶液中加入1当量的化合物2和HATU。向以上溶液中加入无水DIPEA(5eq)并在氩气氛下搅拌6小时。使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品产物，得到所需产物。LRMS-LC/MS(m/z):C13H21F2N3O4的[M+H]+理论值:321.32；实测值:323。化合物3的LC/MS迹线如图1所示。
化合物4.使HPLC纯化的化合物3溶解于无水DCM中。向该溶液中加入无水吡啶(1eq)，随后加入TFAA(1eq)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。通过LC/MS监测反应的完成。使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品产物，得到所需产物。LRMS-LC/MS(m/z):C13H19F2N3O3的[M+H]+理论值:303.31；实测值:305。化合物4的LC/MS迹线如图2所示。
化合物7.使化合物4溶解于TFA中并在室温下搅拌30分钟。通过LC/MS监测反应的完成。通过使用旋转蒸发器蒸发TFA，并将化合物5在高真空下干燥且进一步使用而无需任何纯化。化合物5的LC/MS迹线如图3所示。向化合物5的溶液中加入在DMF DIPEA(5eq)中的化合物6(1eq)和HATU(1eq)并在氩气氛下搅拌6小时。通过LC/MS监测反应的完成。使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品化合物7，得到所需产物。LRMS-LC/MS(m/z):C20H25F2N5O4的[M+H]+理论值:437.45；实测值:438。化合物7的LC/MS迹线如图4所示。
化合物8.使化合物7溶解于TFA中并在室温下搅拌30分钟。通过使用旋转蒸发器去除TFA，并将粗品化合物8用于下一步反应而无需任何进一步纯化。LRMS-LC/MS(m/z):C15H17F2N5O2的[M+H]+理论值:337.33；实测值:338。化合物8的LC/MS迹线如图5所示。
方案2.JFL-L1-S0456和JFL-L1-FM的合成。试剂和条件：a)(i)HATU(无水)，DIPEA(无水)，DMF，rt。(ii)TFA，rt；b)(i)PyBop(无水)，DMF(无水)，DIPEA，rt。(ii)TFA/H2O/TIPS/EDT(92.5:2.5:2.5:2.5)，1h；c)DMSO，DIPEA，S0456马来酰亚胺，rt；d)DMSO，DIPEA，荧光素马来酰亚胺，rt。
使化合物8与间隔基连接并且在本文称为JFL-L1。使配体在溶液相中并通过标准固相肽合成部分地与接头连接。然后使其与FM或S0456的马来酰亚胺衍生物偶联，分别得到JFL-L1-FM或JFL-L1-S0456。通过HPLC纯化中间体和最终缀合物，并使用LC/MS和UPLC表征。
化合物10.向化合物8在无水DMF中的溶液中加入化合物9(1eq)、HATU(1eq)和DIPEA(10eq)。将反应混合物在氩气氛下搅拌6小时。通过LC/MS监测反应的完成。通过使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品化合物10，得到所需产物。LRMS-LC/MS(m/z):C19H21F2N5O5的[M+H]+理论值:437.4；实测值:438。化合物10的LC/MS迹线如图6所示。
JFL-L1的合成。如方案2中所述，通过固相肽合成制备化合物。将PyBop(无水)、DMF(无水)、DIPEA、化合物10和H-Cys(Trt)2-氯三苯甲基树脂在室温下合并。使用TFA:水:TIPS:乙二硫醇(95％:2.5％:2.5％:2.5％)的标准混合溶液从树脂上裂解最终产物。通过使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品JFL-L1，得到所需产物。LRMS-LC/MS(m/z):C22H26F6N6O6S的[M+H]+理论值:540.54；实测值:541。JFL-L1的LC/MS迹线如图7所示。
JFL-L1-FM和JFL-L1-S0456的合成。使JFL-L1溶解于DMSO和5eq的DIPEA中。向该反应混合物中加入1eq的荧光素马来酰亚胺或S0456马来酰亚胺。将反应混合物在氩气氛下搅拌1小时并通过LC/MS监测反应的完成。通过使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品化合物JFL-L1-FM和JFL-L1-S0456，得到所需产物。JFL-L1-FM和JFL-L1-S0456的LCMS表征如下。LRMS-LC/MS(m/z):C46H39F2N7O13S的[M+H]+理论值:967.91；实测值:968。LRMS-LC/MS(m/z):C75H85F2N10Na3O22S5的[M+H]+理论值:1745.82.35；实测值:1747。JFL-L1-FM的LC/MS迹线如图8所示。JFL-L1-S0456的LC/MS迹线如图9所示。
方案3.S0456马来酰亚胺的合成。试剂和条件：a)KOH，H2O，rt-100℃；b)HATU(无水)，DIPEA(无水)，DMF，rt。S0456马来酰亚胺的LC/MS迹线如图10所示。
靶向FAPα的微管溶素B酰肼的合成
方案4.JFL-L1-TubBH的合成。试剂和条件：a.(i)JFL-L1，H2O/NaHCO3(pH＝7.0-7.2)，氩气，r.t.。(ii)活化的TubBH，无水THF，氩气，r.t.。
如下所述合成靶向FAP的微管溶素B酰肼缀合物。简而言之，使JFL-L1溶解于氩气吹扫的HPLC级水中，并使用相同水的NaHCO3饱和溶液调节至pH 7.0。将在THF中的二硫化物活化的微管溶素B酰肼(1eq)加入到反应混合物中并在室温下于氩气氛下搅拌。通过分析LRMS-LCMS监测反应的进程。通过使用制备型RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品产物，得到95％的期望的产物。LRMS-LC/MS(m/z):C67H93F2N13O17S3的[M+H]+理论值:1487；实测值[M/2+1]:744，如图17所示。
靶向FAP的NIR成像的合成：PEG和肽聚糖接头
方案5.JFL-L2-S0456的合成。试剂和条件：a)DMSO，DIPEA，S0456马来酰亚胺，rt。
JFL-L2-S0456的合成：使FAP靶向配体(JFL)与PEG和肽聚糖分子缀合以合成JFL-L2。简而言之，通过标准固相肽合成合成JFL-L2并通过RP-HPLC纯化，如图21A所示。LRMS-LC/MS(m/z):C48H75F2N9Na3O20S的[M+H]+理论值:1168；实测值:1169，如图21B所示。向1当量纯化的JFL-L2和S0456-马来酰亚胺在无水DMSO中的反应混合物中加入5当量的DIPEA。使反应混合物在氩气氛下搅拌并通过使用LC-MS监测反应的完成。通过使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-50％B，35分钟]纯化粗品JFL-L2-S0456，得到所需产物。LRMS-LC/MS(m/z):C101H134F2N13Na3O36S5的[M+H]+理论值:2371.5；实测值:790。
JFL-L3的合成
方案6.JFL-L3的合成。试剂和条件：(a)(i)20％哌啶/DMF，rt，(ii)Fmoc-Asp(OtBu)，PyBop，DMF，DIPEA，(b)(i)20％哌啶/DMF，rt，10min，(ii)Fmoc-二氨基丙酸(DAP)，PyBop，DMF，DIPEA，(c)(i)20％哌啶/DMF，rt，(ii)Fmoc-8-氨基-辛酸，PyBop，DMF，DIPEA，(d)(i)20％哌啶/DMF，rt，10min，(ii)化合物10，PyBop，DMF，DIPEA，(iii)TFA/H2O/TIPS/EDT(92.5:2.5:2.5:2.5)，1h。*通过使用HPLC纯化粗产物并通过使用LC/MS表征。
JFL-L3的合成：如方案所述，JFL-L3通过标准固相肽合成来合成。缀合物的所有组分均在H-Cys(Trt)2-氯三苯甲基树脂上构建。TFA:水:TIPS:乙二硫醇的标准混合溶液(95％:2.5％:2.5％:2.5％)用于从树脂上裂解最终缀合物。通过使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品产物，得到所需产物。对于JFL-L3，LRMS-LC/MS(m/z):C37H52F2N10O11S的[M+H]+理论值:882.9；实测值:882，如图25A所示。
非放射性JFL-L3的配制：在用99mTc放射性标记之前，根据先前公开的程序配制JFL-L3。简而言之，使0.1mg的JFL-L3、80mg的α-D-葡庚糖酸钠和10mg的锡(II)盐酸盐溶解于氩气吹扫的水中。用氢氧化钠或盐酸将溶液的pH调节至6.8±0.2。将最终体积调节至10ml并然后转移至10个各自含有1ml以上溶液的小瓶中且冻干。在氩气下将冻干粉末密封于小瓶中并储存于-20℃下。
JFL-L3的99mTc标记：根据公开的程序进行缀合物的放射性标记。简而言之，向配制的JFL-L3小瓶中加入1ml的99mTc高锝酸钠并在100℃下加热～18分钟。使螯合的溶液冷却至室温，之后将其用于体外和体内研究。通过放射性HPLC证实缀合物的螯合效率，如图25B所示。
JL-L3-S0456的合成
方案7.JL-L3-S0456的合成。试剂和条件：(a)(i)20％哌啶/DMF，rt，(ii)3,4,5,6-二亚异丙基-1-氨基-脱氧(Fmoc-Glu-OH)-D-葡萄糖醇，PyBop，DMF，DIPEA，(b)(i)20％哌啶/DMF，rt，10min，(ii)Fmoc-Glu(OtBu)-OH，PyBop，DMF，DIPEA，(c)(i)20％哌啶/DMF，rt，(ii)3,4,5,6-二亚异丙基-1-氨基-脱氧(Fmoc-Glu-OH)-D-葡萄糖醇，PyBop，DMF，DIPEA，(d)(i)20％哌啶/DMF，rt，10min，(ii)Fmoc-8-氨基-辛酸，PyBop，DMF，DIPEA，(e)(i)20％哌啶/DMF，rt，10min，(ii)JL，PyBop，DMF，DIPEA，(iii)TFA/H2O/TIPS/EDT(92.5:2.5:2.5:2.5)，1h，(f)JL-L3，S0456马来酰亚胺，无水DMSO，DIPEA，rt。
JL-L3的合成：如方案7所述，通过标准固相肽合成制备接头。如其他地方所述合成肽聚糖亚基。然后使JL与固相上的接头偶联。使用TFA:水:TIPS:乙二硫醇的标准混合溶液(95％:2.5％:2.5％:2.5％)，从H-Cys(Trt)2-氯三苯甲基树脂上裂解最终产物。通过使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品JL-L3，得到所需产物。LRMS-LC/MS(m/z):C67H94F2N10O23S的[M+H]+理论值:1477；实测值:1478。
NIR缀合物JL-L3-S0456的合成：如方案3所述合成含有马来酰亚胺的S0456染料。使1当量的S0456-马来酰亚胺和JL-L3溶解于无水DMSO中，随后加入5当量的DIPEA。将反应混合物在氩气氛下搅拌1小时。通过使用LC-MS监测反应的完成。通过使用RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度0％B-80％B，35分钟]纯化粗品JL-L3-S0456，得到所需产物。JL-L3-S0456的LCMS表征如下。LRMS-LC/MS(m/z):C120H151F2N14Na3O39S5的[M+H]+理论值:2680.85；实测值:2682。
方法实施例
细胞培养。癌细胞FaDu、HT29、MDA-MB231和KB细胞在含有RPMI 1640、10％FBS、1％青霉素-链霉素、1％2mM谷氨酰胺的培养基中，于37℃下及5％CO2和95％潮湿气氛中进行培养。转染HEK 293细胞以产生HEK293-FAP。将FAP阳性细胞在补充有2μl/ml嘌呤霉素、10％FBS、1％青霉素-链霉素、1％2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中，于37℃下及5％CO2和95％潮湿气氛中进行培养。
共聚焦显微术。将FaDu、HT29、MDA-MB231和KB癌细胞(30000个)接种于4孔共聚焦板上。将细胞与100mM JFL-L1-FM一起温育并温育1小时。通过用培养基洗涤细胞3次去除未结合的荧光。通过使用Olympus共聚焦显微术观察细胞结合的荧光。
体外结合测定。将100000个HEK293-FAP细胞接种于胺包被的24孔板中。使细胞经24小时生长为单层，并在存在或不存在过量JFL-L1的情况下与各种浓度的JFL-L1-S0456一起温育。温育1小时之后，用培养基洗涤细胞3次以去除未结合的荧光。使细胞溶解于1％SDS中并通过使用荧光计测量细胞结合的荧光。
动物饲养。5-6周龄雌性无胸腺nu/nu小鼠购自Harlan Laboratories。动物随意获取正常的啮齿动物食物和水。动物以标准的12小时光暗循环圈养。所有动物程序均经Purdue动物护理和使用委员会批准。
体内荧光成像和生物分布。为了开发皮下肿瘤异种移植物，将0.2ml无菌PBS中的MDA-MB231、OVCAR-3和HEC-1B 5x 106个细胞皮下注射在雌性nu/nu小鼠的右后侧。一旦肿瘤体积达到200mm3-300mm3之间，就开始肿瘤成像。在存在或不存在100倍过量的未标记缀合物的情况下，用10纳摩尔的荧光染料缀合物静脉内注射(经尾静脉)每只荷瘤小鼠。使用CO2在注射后2小时对动物实施安乐死，并使用Caliper IVIS Luminal II获取图像。在进行全身成像之后，收获感兴趣的器官并成像以检查这些器官中荧光的积累。图像采集参数如下：i)灯水平-高，ii)激发-745nm，iii)发射-ICG，iv)像素组合(M)4M，(v)光圈级数-4，(vi)FOV-12.5，(vii)采集时间，5s。
体外结合亲和力和共聚焦成像。研究癌细胞FaDU、HT29、MDA-MB231和KB的FAP表达。为此目的，将癌细胞接种于共聚焦孔板上并与100nM靶向FAP的FM缀合物(JFL-L1-FM)一起温育。在37℃下温育1小时之后，洗涤细胞以去除任何过量的未结合的染料。在共聚焦显微镜下观察，以研究染料的任何吸收，如图11所示。在所有4种细胞类型中，未观察到染料缀合物的摄取。这意味着在这些癌细胞上不存在FAP。
为了发现靶向FAP的NIR染料缀合物(JFL-L1-S0456)的结合亲和力，将FAP转染的HEK293细胞接种于胺包被的24孔板上，并在存在或不存在过量的FAP配体JFL的情况下与各种浓度的染料缀合物一起温育。温育1小时之后，洗涤细胞以去除任何过量的未结合的染料。使细胞溶解于1％SDS中，随后使用荧光计量化细胞结合的荧光。为了量化荧光，以745nm激发样品并测量790nm的发射。通过使用Graph pad prism将细胞结合的荧光针对各种浓度作图，以发现表观KD值，如图12所示。JFL-L1-S0456的表观解离常数为约3.5nM。当在存在过量JFL的情况下与NIR染料缀合物一起温育时竞争细胞结合的荧光，表明JFL-L1-S0456的摄取为FAP介导的。
体内荧光成像。为了研究JFL-L1-S0456在体内积累的能力，用FaDu(n＝5)、HT29(n＝5)、MDA-MB231(n＝5)或KB(n＝5)细胞植入小鼠。这些荷瘤小鼠静脉内单独注射NIR染料缀合物或共注射过量的FAP靶向配体JFL。注射后2小时之后，对小鼠实施安乐死并成像，如图13A和13B(FaDu)、图14A和14B(KB)、图15A和15B(HT29)及图16A和16B(MDA-MB231)所示。在所有肿瘤类型中观察到FAP介导的染料缀合物的摄取，并且过量的JFL能够竞争肿瘤中的荧光。为了检查染料缀合物在其他器官中的摄取，进行尸检以收获器官并成像，如图13C和13D(FaDu)、图14C和14D(KB)、图15C和15D(HT29)、和图16C和16D(MDA-MB231)所示(从上到下的器官：肿瘤、心脏、肺、脾、胰、肌肉、胃、小肠、大肠、肝和肾)。除肿瘤之外，在肝脏和肾脏中观察到染料缀合物的最少或不吸收。这些器官中的摄取不是受体介导的，并且主要是由于经肾脏或肝脏途径排泄缀合物。不旨在受理论的束缚，由于癌细胞为FAP阴性，因此预期NIR染料缀合物的体内摄取是在已知表达FAP的癌症相关成纤维细胞中积累的结果。当体内测试时，靶向FAP的染料缀合物在肿瘤中显示出FAP介导的摄取。其他器官(肾和肝)显示出近红外染料缀合物的摄取最少或不摄取。
体内治疗研究MDA-MB231：将5-6周龄雌性nu/nu无胸腺裸鼠皮下注射500万个乳腺癌细胞(MDA-MB-231)到其肩部。在用游标卡尺处理期间，每天或每隔一天在两个垂直方向上测量肿瘤，并且其体积计算为0.5x L x W2，其中L为最长轴(以毫米为单位)，和W为与L垂直的轴(以毫米为单位)。一旦肿瘤体积达到～100mm3，将小鼠随机分到不同组并开始治疗。以无菌盐水制备给药溶液并经尾静脉静脉内注射。对照组小鼠注射无菌盐水，而治疗组小鼠每天或每隔一天注射40nmoles的JFL-L1-TubBH。除接受40nmols的JFL-L1-TubBH之外，竞争组中的小鼠还给予100倍过量的与接头缀合的靶向FAP的配体(JFL-L1)，如图18A所示。每次给药时将小鼠称重作为总毒性的量度，如图18B所示。
为了研究靶向FAP的微管溶素缀合物的体内功效，将MDA-MB-231肿瘤异种移植物用JFL-L1-S0456治疗。在治疗期间，对照组和竞争组中的小鼠未显示出肿瘤体积的任何减小。在治疗组中，给予小鼠40nmols的JFL-L1-TubBH，并根据给予治疗剂的频率将其分成两个单独的组。当与对照和竞争组相比较时，两个治疗组中的小鼠显示出肿瘤体积显著减轻。每隔一天用JFL-L1-TubBH治疗的小鼠未显示出完全缓解，而是观察到肿瘤生长延迟。另一方面，当每天用相同剂量的JFL-L1-TubBH治疗小鼠时，观察到完全缓解。在整个研究中，监测小鼠的体重作为总毒性的量度。每隔一天接受JFL-L1-TubBH的盐水、竞争和治疗组中的小鼠没有显示出任何体重减轻。用靶向FAP的微管溶素治疗的小鼠显示出体重减轻约5％，但是相同的小鼠接近治疗结束时增加了体重。
用靶向FAP的TubBH和靶向叶酸的PI3激酶抑制剂或TLR7激动剂的体内组合疗法：
4-5周龄的雌性BALB/c小鼠在乳腺脂肪垫附近注射100000个4T1细胞。一旦肿瘤体积达到～100mm3，将小鼠随机分到不同组并开始治疗。以无菌盐水制备靶向FAP的微管溶素B酰肼缀合物(JFL-L1-TubBH)、靶向叶酸的PI3激酶抑制剂(FA-PI3K)和靶向叶酸的TLR7拮抗剂(FA-TLR7)的给药溶液，并经尾静脉静脉内注射。对照组小鼠给予无菌盐水，而治疗组小鼠接受单独或与其他试剂之一(JFL-L1-TubBH、FA-PI3K或FA-TLR7)组合的JFL-L1-TubBH或FA-PI3K或FA-TLR7。用于治疗的单剂量浓度为20nmoles的JFL-L1-TubBH、10nmoles的FA-PI3K和10nmoles的FA-TLR7。小鼠每天注射受试试剂，随后测量肿瘤体积(卡尺)。作为总毒性的量度，还在每次给药时监测小鼠的体重。FAP竞争组中的小鼠在存在过量的FAP配体JFL的情况下接受靶向FAP的微管溶素B酰肼。
对照和竞争(FAP-竞争)组中的4T1荷瘤小鼠未显示出肿瘤体积的任何减小，如图19A所示。与用单一试剂治疗的这两组小鼠相比较，靶向FAP的微管溶素B酰肼(JFL-L1-TubBH)或靶向叶酸的PI3激酶抑制剂(FA-PI3K)或TLR7拮抗剂(FA-TLR7)延迟肿瘤生长。为了研究靶向FAP和叶酸的化学治疗剂的组合治疗的效果，将组合治疗组中的小鼠分到两个不同组。其中一组接受JFL-L1-TubBH与FA-TLR的组合，而另一组的小鼠接受FA-PI3K以及JFL-L1-TubBH。当与单一试剂治疗相比较，组合治疗均显示出肿瘤体积减小，这是相加的。在整个治疗期间，监测小鼠的体重作为总毒性的量度。组中没有一个呈现出任何体重减轻，如图19B所示。
体内靶向FAP的CAR T细胞疗法：通过注射500万个癌细胞，使MDA-MB-231皮下肿瘤在雌性NSG小鼠内发育。一旦肿瘤体积达到～100mm3，将小鼠随机分到3个不同组并开始治疗。所有组中的小鼠给予1500万个CAR T细胞，其具有与荧光素特异性且紧密结合的scFv结构域。给予CAR T细胞之后2小时，所有组中的小鼠给予第一剂相应的受试试剂。对照组小鼠注射无菌盐水，而治疗组小鼠单独或与100倍过量的FAP配体JFL组合注射JFL-L1-FM(10nmoles)。在治疗期间，不同组中的小鼠每隔一天静脉内给予相应的受试试剂。作为总毒性的量度，在每次给药时也将小鼠称重。
利用MDA-MB-231小鼠异种移植模型研究具有识别靶向FAP的FM缀合物(JFL-L1-FM)的荧光素片段的scFV结构域的CAR T细胞的作用。对照和竞争组中的小鼠未显示出肿瘤生长速率的任何差异，如图20A所示。在研究开始时，用CAR T细胞和靶向FAP的FM(JFL-L1-FM)治疗的小鼠未显示出肿瘤体积的任何减小。但在治疗1周之后，观察到肿瘤生长速率的略微分离。在该研究的任何组中均未观察到体重减轻，如图20B所示。结果表明，靶向FAP的CAR T细胞疗法具有杀死肿瘤的潜力，但需要优化CAR T细胞和JFL-L1-FM的剂量以在治疗早期诱导肿瘤抑制。
用JFL-L2-S0456进行体内成像：向荷MDA-MB-231瘤无胸腺雌性小鼠静脉内注射5nmols的JFL-L2-S0456。使用CO2在注射后2小时对小鼠实施安乐死，并使用IVIS LuminaII获取图像。在完成全身成像之后，收获器官并进一步成像以检查JFL-L2-S0456在这些器官中的积累。
利用MDA-MB-231异种移植物研究由PEG和肽聚糖接头组成的靶向FAP的NIR缀合物JFL-L2-S0456的体内成像能力，如图22A-C所示。全身成像显示，注射后2小时之后发现缀合物在肿瘤中累积。重要器官/组织的生物分布进一步证实肿瘤具有最高的染料缀合物摄取。肿瘤之后，另外两个显示JFL-L2-S0456摄取的器官为肝脏和肾脏。当与肝脏相比较，肾脏的摄取更高。肾脏和肝脏在小分子的排泄中起着至关重要的作用。数据表明，靶向FAP的染料缀合物在这些器官中的摄取是由于经肾脏和肝脏途径排泄荧光缀合物。在任何其他器官中均未观察到摄取。
使用不同浓度的JFL-L1-S0456进行体内成像：向荷MDA-MB-231瘤的雌性无胸腺裸鼠静脉内注射5、10或20nmoles的JFL-L1-S0456。2小时之后，使用CO2对小鼠实施安乐死，并用IVIS Lumina II成像。在完成全身成像之后，进行生物分布并对器官进行成像以检查JFL-L1-S0456的累积，如图23所示。
为了研究以剂量依赖性方式摄取JFL-L1-S0456，向MDA-MB-231肿瘤异种移植物给予5、10和20nmols的染料缀合物。观察到增加剂量和肿瘤的荧光强度增加之间具有直接相关性。当与5nmole组中的小鼠相比较时，在10nmole组中观察到肿瘤的荧光强度增加两倍。发现5和10nmole组的肿瘤的荧光强度在107范围内，而20nmole组的摄取在108内。因此，发现肿瘤的荧光强度随着给予更高剂量的JFL-L1-S0456而增加，并且没有显示出饱和度高达20nmoles的任何迹象。
混合成像：靶向FAPα和LHRH-R的NIR缀合物
向雌性无胸腺小鼠植入MDA-MB-231癌细胞以发育皮下肿瘤。荷瘤小鼠静脉内注射靶向FAP的NIR缀合物、单独的JFL-L1-S0456(5nmoles)或靶向促黄体激素释放激素受体的NIR缀合物、单独的JL-L3-S0456(5nmoles)或两种缀合物。注射后2小时，使用CO2对小鼠实施安乐死，并用Caliper IVIS Lumina II成像，如图24A所示。随后完成全身成像，进行生物分布并对所有器官进行成像以检查染料缀合物的摄取，如图24B所示。
评估使用靶向FAP的NIR染料(JFL-L1-S0456)和靶向促黄体激素释放激素受体(LHRH-R)的NIR染料(JL-L3-S0456)来将表达FAP和LHRH-R两者的癌症成像的可行性。当单独注射JFL-L1-S0456或JL-L3-S0456时，发现MDA-MB-231肿瘤中的染料缀合物的摄取处于类似的强度范围内。当将相同剂量的JFL-L1-S0456和JL-L3-S0456共同给予相同的肿瘤类型时，观察到肿瘤荧光强度的增加。当与单一试剂组(单独的JFL-L1-S0456或JL-L3-S0456)相比较时，组合组的强度增加超过两倍。结果表明，通过组合靶向FAP和LHRH-R的成像剂的混合成像可有效地用于提供对两种靶标均为阳性的肿瘤的更好图像。
使用99mTc标记的JFL-L3的体外结合研究：将人类FAPα转染的HEK-293细胞接种于胺包被的24孔板中，并使得生长为单层。用含有各种浓度的99mTc标记的FAP缀合物(JFL-L3)的培养基替换使用过的培养基。对于阻断研究，在存在过量JFL的情况下用99mTc标记的JFL-L3处理细胞。温育2小时之后，细胞用培养基洗涤3次以去除未结合的放射性缀合物，并溶解于0.5ml的0.25N NaOH中。使用γ闪烁计数器计数细胞结合的放射性。通过使用Graph PadPrism分析数据确定表观KD，并如图26所示。
体内放射性成像：荷MDA-MB-231瘤的无胸腺裸鼠(雌性)静脉内注射单独或在存在100倍过量的JFL的情况下的150μCi的99mTc标记的JFL-L3。2小时之后，通过CO2窒息处死小鼠，并用KODAK Image Station成像，如图27A所示。用于放射成像的参数为：采集时间＝2分钟，光圈级数＝4，焦平面＝7，FOV＝200，像素组合＝4。对于白光成像，参数为：采集时间＝0.05秒，光圈级数＝11，焦平面＝7，FOV＝200，没有像素组合。对于生物分布研究，进行尸检以收集器官/血液/组织。通过使用γ计数器计数与所有器官/血液/组织相关的放射性。
通过标准固相肽合成来合成用于99mTc放射性成像的靶向FAP的缀合物(JFL-L3)。当以用人类FAP转染的HEK细胞进行体外测试时，99mTc标记的JFL-L3显示出10.5nM的低纳摩尔结合(KD)。在体外研究后，通过静脉内给予放射性标记的化合物，在MDA-MB-231肿瘤异种移植物中研究99mTc标记的JFL-L3的体内靶向，如图27B所示。观察到靶向FAP的放射性缀合物在肿瘤和肾脏中积累。除肿瘤和肾脏以外，其他器官显示出非常低至不摄取放射性标记的化合物。在竞争研究中，发现过量的JFL阻断对肿瘤中99mTc标记的JFL-L3的肿瘤摄取，表明放射性示踪剂在肿瘤中的积累为FAP介导的。相反，如图27C所示，通过给予过量的JFL不阻断肾脏中的摄取。这表明肾脏中放射性示踪剂的摄取为相当非特异性的。由于小的亲水性分子通常通过肾脏途径排泄，因此肾脏中的摄取可能是短暂的。该数据表明99mTc标记的JFL-L3可在表达FAP的肿瘤中积累，同时对缺少靶抗原的器官造成最小的损伤。
本文引用的每个和所有专利公开、非专利公开和参考文献正文的全部内容通过参考由此结合，除非如果在本说明书中存在任何不一致的公开或定义，应认为本文的公开或定义为准。
应当理解，关于要素使用不定冠词“a”和“an”并不排除在一些实施方案中存在多个这种要素。
已通过解释和说明提供了上述详述和附图，并且不旨在限制所附权利要求的范围。本文所示的目前优选的实施方案的许多变化对于本领域的普通技术人员为显而易见的，并且仍然处于所附权利要求及其等同物的范围内。
应当理解，所附权利要求中列举的要素和特征可以不同方式组合以产生同样落入本发明范围内的新权利要求。因此，尽管以下所附的从属权利要求仅从属于单个独立或从属权利要求，但应当理解，在备选方案中可使这些从属权利要求(作为选择)从属于任何前述权利要求(无论是独立的还是从属的)，并且这种新组合应理解为形成本说明书的一部分。

Claims (68)

1.一种具有以下结构的缀合物或其药学上可接受的盐：
B-L-X，
其中B包含成纤维细胞活化蛋白(FAP)抑制剂；
L包含二价接头；和
X包含近红外(NIR)染料、放射性成像剂或有效对抗癌细胞和/或癌症相关成纤维细胞(CAF)的治疗剂。
2.权利要求1的缀合物，其中B具有以下结构：
其中R1和R2为相同或不同，并且各自独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；
R3为C1-C4烷基、腈或异腈；
R4、R5和R6为相同或不同，并且各自独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；和
n为1-8的整数。
3.权利要求2的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2的每一个为卤素。
4.权利要求2的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2的每一个为氟。
5.权利要求2的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R3为腈。
6.权利要求2的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R4、R5和R6的每一个为氢。
7.权利要求2的缀合物或其药学上可接受的盐，其中B具有以下结构：
8.权利要求2的缀合物或其药学上可接受的盐，其中B具有以下结构：
9.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头包含至少一种选自以下的D-或L-构型的氨基酸或其衍生物：Lys、Asn、Thr、Ser、Ile、Met、Pro、His、Gln、Arg、Gly、Asp、Glu、Ala、Val、Phe、Leu、Tyr、Cys和Trp。
10.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头包含至少两种独立地选自Glu和Cys的氨基酸或其衍生物。
11.权利要求10的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述氨基酸衍生物为具有与侧链羧酸共价连接以形成酰胺键的氨基糖部分的谷氨酸。
12.权利要求11的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述氨基糖部分为1-脱氧-1-氨基-D-葡萄糖醇。
13.权利要求9的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头包含式Glu-Glu-Glu的氨基酸部分，其中所述谷氨酸任选地用与侧链羧酸共价连接以形成酰胺键的氨基糖部分取代。
14.权利要求14的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述氨基糖部分为1-脱氧-1-氨基-D-葡萄糖醇。
15.权利要求14的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述Glu-Glu-Glu通过羧酸侧链彼此共价键合。
16.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头包含下式的部分：
其中m为0-9的整数，p为3-10的整数，q为3-100的整数。
17.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头包含选自以下的部分：
其中
R7和R8的每一个独立地为H或C1-C6烷基；
t为1-8的整数。
18.权利要求17的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头具有下式：
19.权利要求17的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R7和R8为H；和t为2。
20.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头包含肼。
21.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L包含以下结构：
22.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头包含选自以下的部分：
其中R6为H或C1-C6烷基。
23.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其包含下式：
24.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X包含荧光染料。
25.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X包含NIR染料。
26.权利要求24的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述荧光染料为荧光素马来酰亚胺或异硫氰酸荧光素(FITC)。
27.权利要求25的缀合物或其药学上可接受的盐，其中NIR染料为S0456。
28.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X具有以下结构：
29.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X具有以下结构：
30.具有以下结构的权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐：
31.具有以下结构的权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐：
32.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X为下式的螯合剂：
33.权利要求32的缀合物或其药学上可接受的盐，其中X包含与所述螯合剂配位的放射性金属同位素。
34.一种具有以下结构的缀合物：
其中L包含二价接头；和
X包含近红外(NIR)染料。
35.具有以下结构的权利要求34的缀合物：
36.一种从患者手术去除癌症相关成纤维细胞(CAF)的方法，所述方法包括：
将缀合物传递至所述患者的肿瘤微环境，所述肿瘤微环境包含至少一个CAF，所述缀合物具有以下结构
其中L包含二价接头和X包含近红外(NIR)染料；
通过对其施加光学刺激引起所述NIR染料发荧光；和
基于所述荧光的结果切割所述患者的含有CAF的组织。
37.权利要求36的方法，其中通过所述缀合物成像的含有CAF的组织包含基质细胞。
38.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A为选自长春花生物碱、念珠藻素、硼替佐米、硫代硼替佐米、微管溶素、氨基喋呤、雷帕霉素、紫杉醇、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、依维莫司、α-鹅膏毒素、疣孢菌素、膜海鞘素B、格尔德霉素、purvalanol A、伊斯平斯、布地奈德、达沙替尼、埃博霉素、美登素和酪氨酸激酶抑制剂的药物。
39.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述药物为微管溶素。
40.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述药物为下式的四肽：
其中
R1a、R3a、R3a’和R3a”各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-OR13a、-OC(O)R13a、-OC(O)NR13aR13a’、-OS(O)R13a、-OS(O)2R13a、-SR13a、-SC(O)R13a、-S(O)R13a、-S(O)2R13a、-S(O)2OR13a、-S(O)NR13aR13a’、-S(O)2NR13aR13a’、-OS(O)NR13aR13a’、-OS(O)2NR13aR13a’、-NR13aR13a’、-NR13aC(O)R14a、-NR13aC(O)OR14a、-NR13aC(O)NR14aR14a’、-NR13aS(O)R14a、-NR13aS(O)2R14a、-NR13aS(O)NR13aR14a’、-NR13aS(O)2NR14aR14a’、-P(O)(OR13a)2、-C(O)R13a、-C(O)OR13a或-C(O)NR13aR13a’取代；
R2a、R4a和R12a各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基；
R5a和R6a各自独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-OR15a、-SR15a和-NR15aR15a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR16a、-SR16a、-NR16aR16a’、-C(O)R16a、-C(O)OR16a或-C(O)NR16aR16a’取代；或者R5a和R6a与它们所连接的碳原子一起形成-C(O)-；
每个R7a、R8a、R9a、R10a和R11a独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-CN、-NO2、-NCO、OR17a、-SR17a、-S(O)2OR17a、-NR17aR17a’、-P(O)(OR17a)2、-C(O)R17a、-C(O)OR17a和-C(O)NR17aR17a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR18a、-SR18a、-NR18aR18a’、-C(O)R18a、-C(O)OR18a或-C(O)NR18aR18a’取代；
每个R13a、R13a’、R14a、R14a’、R15a、R15a’、R16a、R16a’、R17a和R17a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基，其中C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基或5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OH、-SH、-NH2或-CO2H取代；
每个R18a和R18a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-C(O)R19a、-P(O)(OR19a)2和-S(O)2OR19a，
每个R19a独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基；和
a为1、2或3。
41.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中D为下式的四肽：
其中
R1a、R3a、R3a’和R3a”各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-OR13a、-OC(O)R13a、-OC(O)NR13aR13a’、-OS(O)R13a、-OS(O)2R13a、-SR13a、-SC(O)R13a、-S(O)R13a、-S(O)2R13a、-S(O)2OR13a、-S(O)NR13aR13a’、-S(O)2NR13aR13a’、-OS(O)NR13aR13a’、-OS(O)2NR13aR13a’、-NR13aR13a’、-NR13aC(O)R14a、-NR13aC(O)OR14a、-NR13aC(O)NR14aR14a’、-NR13aS(O)R14a、-NR13aS(O)2R14a、-NR13aS(O)NR13aR14a’、-NR13aS(O)2NR14aR14a’、-P(O)(OR13a)2、-C(O)R13a、-C(O)OR13a或-C(O)NR13aR13a’取代；
R2a、R4a和R12a各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基；
R5a选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-OR15a、-SR15a和-NR15aR15a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR16a、-SR16a、-NR16aR16a’、-C(O)R16a、-C(O)OR16a或-C(O)NR16aR16a’取代；
每个R7a、R8a、R9a、R10a和R11a独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-CN、-NO2、-NCO、-OR17a、-SR17a、-S(O)2OR17a、-NR17aR17a’、-P(O)(OR17a)2、-C(O)R17a、-C(O)OR17a和-C(O)NR17aR17a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR18a、-SR18a、-NR18aR18a’、-C(O)R18a、-C(O)OR18a或-C(O)NR18aR18a’取代；
每个R13a、R13a’、R14a、R14a’、R15a、R15a’、R16a、R16a’、R17a和R17a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基，其中C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基或5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OH、-SH、-NH2或-CO2H取代；
每个R18a和R18a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-C(O)R19a、-P(O)(OR19a)2和-S(O)2OR19a，
每个R19a独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基；和
a为1、2或3。
42.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中D为下式的四肽：
其中
R9a选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-CN、-NO2、-NCO、-OR17a、-SR17a、-S(O)2OR17a、-NR17aR17a’、-P(O)(OR17a)2、-C(O)R17a、-C(O)OR17a和-C(O)NR17aR17a’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OR18a、-SR18a、-NR18aR18a’、-C(O)R18a、-C(O)OR18a或-C(O)NR18aR18a’取代；
每个R13a、R17a和R17a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基，其中C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基或5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地用卤素、-OH、-SH、-NH2或-CO2H取代；
每个R18a和R18a’独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-C(O)R19a、-P(O)(OR19a)2和-S(O)2OR19a，和
每个R19a独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基。
43.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A为天然存在的微管溶素。
44.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A选自微管溶素A、微管溶素B、微管溶素C、微管溶素D、微管溶素E、微管溶素F、微管溶素G、微管溶素H和微管溶素I。
45.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述药物为微管溶素B。
46.权利要求1-23中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A具有下式：
47.权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐，其中A具有下式：
48.一种下式的缀合物或其药学上可接受的盐：
49.权利要求48的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述缀合物包含与其配位的选自111In、99mTc、64Cu、67Cu、67Ga和68Ga的放射性金属同位素。
50.权利要求49的缀合物，其中所述放射性金属同位素为99mTc。
51.一种下式的缀合物或其药学上可接受的盐：
52.一种下式的缀合物或其药学上可接受的盐：
53.一种药用组合物，其包含权利要求1的缀合物或其药学上可接受的盐和任选地至少一种药学上可接受的赋形剂。
54.一种在受试者中治疗癌症的方法，其包括：
a.给予所述受试者有效量的权利要求1、38-47或51中任何一项的缀合物或组合物或其药学上可接受的盐。
55.权利要求54的方法，其中所述受试者患有表达FAP的癌症。
56.权利要求55的方法，其中表达FAP的癌症为原发性或转移性的。
57.权利要求56的方法，其中所述癌症选自前列腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌和脑癌。
58.权利要求1、38-47或51中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，其用于在受试者中治疗表达FAP的癌症的方法。
59.权利要求58的缀合物，其中所述方法包括给予所述受试者有效治疗表达FAP的癌症的量的所述缀合物。
60.权利要求59的缀合物，其中所述表达FAP的癌症选自前列腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌和脑癌。
61.权利要求1、38-47或51中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐在制备用于在受试者中治疗表达FAP的癌症的药物中的用途。
62.权利要求61的用途，其中所述表达FAP的癌症选自前列腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌和脑癌。
63.一种在体外将细胞群成像的方法，所述方法包括
a.使所述细胞与权利要求1-31中任何一项的缀合物接触，以提供标记的细胞，和
b.使所述标记的细胞可视化。
64.权利要求1-31中任何一项的缀合物，其用于在体外将细胞群成像的方法。
65.权利要求64的缀合物，其中所述方法包括：
a.使所述细胞与权利要求1-31中任何一项的缀合物接触，以提供标记的细胞，和
b.使所述标记的细胞可视化。
66.一种在体内将细胞群成像的方法，所述方法包括
a.给予患者有效量的权利要求1-23、32、33、48或49中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，以提供标记的细胞，和
b.通过成像使所述标记的细胞可视化。
67.权利要求1-23、32、33、48或49中任何一项的缀合物，其用于在体外将细胞群成像的方法。
68.权利要求67的缀合物，其中所述方法包括：
a.给予患者有效量的权利要求1-23、32、33、48或49中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，以提供标记的细胞，和
b.通过成像使所述标记的细胞可视化。
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