CN110280229A - 喋呤类化合物选择性分离富集材料制备与应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种可选择性分离富集复杂背景样品中蝶呤类目标物的复合纳米纤维材料及其制备方法与应用方法，该复合纳米纤维材料由电纺纳米纤维芯层、修饰层I和修饰层II组成；同时还公开了该复合纳米纤维材料的制备方法，同时还公开了应用上述复合纳米纤维材料选择性分离富集复杂样品中蝶呤类化合物的方法。经修饰液I和修饰液II先后修饰的功能化纳米纤维，其对复杂样品中的蝶呤类物质有选择性吸附作用，可在蝶呤类化合物的提取、检测方面应用。

Description

喋呤类化合物选择性分离富集材料制备与应用方法
技术领域
本发明涉及一种基于功能化复合纳米纤维的萃取方法，特别涉及一种可选择性分离富集喋呤类化合物的复合纳米纤维材料、其制备方法、以及应用该复合纳米纤维材料对复杂样品中的喋呤类化合物进行选择性分离富集的方法。
背景技术
蝶呤是指有两个氮环组成为蝶啶衍生物2-氨基-4-羰基蝶啶的一般名称或其衍生物之总称。蝶呤类物质为人体生物活性物质，同时也有部分蝶呤类物质作为药物应用于临床。这造成人体液和环境中都可能含有蝶呤类物质。研究表明，在人体中，健康人与各种疾病患者血表及尿液蝶呤物质水平有比较大的差异。对蝶呤类物质的研究，涉及与细胞免疫反应激活相关的各类疾病，包括感染、创伤、肿瘤、自身免疫和其他炎症性疾病，也应用于对疾病进程的预计、预后的评估，如恶性疾病和HIV引起的感染等。
蝶呤类物质作为药物的研究中，叶酸类抗肿瘤药甲氨蝶呤的临床应用最为广泛。其主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞的合成，而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。在癌症治疗中，通过监测血清甲氨蝶呤的浓度，可以大大提高大剂量甲氨蝶呤治疗后使用亚叶酸解救治疗的疗效。低剂量的甲氨喋呤也用于治疗自身免疫性疾病。由于甲氨蝶呤的过量使用具有严重的副作用，如骨髓抑制、胃肠损害、肝肾功能损伤、低白蛋白血症和全血细胞减少等，因此治疗药物监测对于改善甲氨喋呤治疗具有重要意义。有研究表明甲氨蝶呤在细胞内代谢为多聚谷氨酸化甲氨蝶呤,从而发挥其药理作用。因此，对血液或尿液等生物样本中的甲氨喋呤或者多聚体等蝶呤类化合物含量的检测具有实际意义。
在血液、尿液等复杂生物样本中，蝶呤类物质的含量十分微量，对其检测还是严峻的挑战。例如血液样本中存在的甲氨蝶呤及其多聚体都集中在红细胞组织中，血清中含有大量可以分解甲氨喋呤多聚体使其失去生物活性的物质，因此，若想检测血液中的甲氨蝶呤类物质，对血液的处理要迅速，尽快通过离心等方式去除血清留下红细胞，以去除血液中的大量干扰物和酶类等。但即使如此，红细胞的生物样本基质仍旧十分复杂，其中含有的大量氨基酸、蛋白质等会干扰目标化合物的检测。现在对于该类化合物的检测使用的基本是微生物法，酶联免疫法，液相色谱-质谱(LC-MS)联用，液相色谱-电喷雾离子-质谱(LC-ECI-MS)等方法，这些方法对于样品的纯度都有一定的要求，过多的杂质会污染机器或者使检测结果不准确，提高检测成本和难度。而现在广泛应用的萃取技术就是针对这个难题而生，尤其是固相萃取技术。针对蝶呤类物质，现在的研究多是应用市售的由特定固定相构成的固相萃取柱如C18柱或者二氧化硅柱等，吸附样品中的目标物，然后再用特定的洗脱液对目标物进行解析。这些固定相的吸附作用基于颗粒表面密布的孔道或者较大的比表面积，目标物的吸附/解析过程涉及微孔内外传质、扩散等过程，吸附效率的发挥有限制性因素，吸附和脱附速度较慢，通常需要几个柱床体积的洗脱剂将目标位从柱子上洗脱下来，还需要加热、氮吹等步骤进一步浓缩目标物，操作过程十分繁琐耗时，加热、氮吹等操作也会破坏目标物的结构，对于不稳定的蝶呤类聚合物的前处理并不是最优选择。
蝶呤类物质的分子结构中，都含有两个氮环。而已有研究证实，在弱酸性的pH(4.6～5.0)环境中，蝶呤类物质分子中的-NH：和杂环N原子及羰基和羧基中氧原子均可作为给予体而与金属离子形成配位键，而重金属原子钯Pd(Ⅱ)或者铊Tl(Ⅲ)作为亲氮元素更易与N原子结合，虽然蝶呤类分子中有多个杂环氮原子、-NH和>NH的氮原子，仅4位--NH和5位杂环N原子与Pd(Ⅱ)或者Tl(Ⅲ)能形成稳定的螯合结构。而此结构在pH值发生变化，变为弱碱性时会被破坏，使蝶呤类物质分子脱落重新回到溶液中。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种可选择性分离富集复杂样品中喋呤类化合物的功能化复合纳米纤维材料，并提供该复合纳米纤维材料的制备方法，该复合纳米纤维材料萃取效率高且可以实现复杂样品中喋呤类化合物的快速分离富集；另外，本发明还提供了一种以该复合纳米纤维材料为吸附剂对复杂样品中的喋呤类化合物进行选择性分离富集的方法。
为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：
本发明所述的一种可选择性分离富集复杂样品中喋呤类化合物的功能化复合纳米纤维材料，该功能化复合纳米纤维材料包括电纺纳米纤维芯层、修饰层I和修饰层II；纳米纤维芯层以高分子聚合物用高压静电纺丝法制备，其中高聚物溶解于溶剂B中得到修饰液Ⅰ，经过处理使修饰液Ⅰ中的高聚物涂覆于纳米纤维芯层表面获得修饰层Ⅰ；金属氯化物溶解于溶剂C中得到修饰液Ⅱ，经过处理使修饰液Ⅱ中的金属氯化物涂覆于修饰层Ⅰ表面获得修饰层Ⅱ。对应纳米纤维芯层高分子聚合物使用浓度为10wt％、含有修饰层Ⅰ的高聚物材料的修饰液Ⅰ中高聚物浓度为0.83wt％、含有修饰层Ⅱ的金属氯化物的修饰液Ⅱ中金属氯化物使用浓度为10～25mg/ml。将高分子聚合物加入溶剂A中获得纺丝溶液，以溶剂体积计，纺丝液中，纳米纤维芯层高分子聚合物使用浓度为10wt％。
优选的，纳米纤维芯层高分子聚合物包含一般市售的所有聚合物，优选聚氧乙烯、聚乙烯醇、聚萘二甲酸乙二酯、聚苯胺、尼龙、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯硫醚、醋酸纤维素、聚苯乙烯、聚已内酰胺、丙烯酸树脂和聚丙烯腈中的一种或几种混配。
优选的，修饰层Ⅰ的高聚物选用表面含有多个氮原子的聚醚酰亚胺高聚物。
优选的，修饰层Ⅱ的金属氯化物优选氯化钯或者氯化铊。
优选的，溶剂A包含市售的能溶解高分子聚合物的所有溶剂，优选乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、水、卤代烃、芳香烃中的一种或几种混配。
本发明所述的一种可选择性分离富集复杂样品中喋呤类化合物的功能化复合纳米纤维材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将所述高分子聚合物加入到溶剂A中，待其溶解后、放在恒温磁力搅拌器上混合均匀后，将溶液置于室温下持续搅拌12～20h，得到高分子聚合物溶液；
步骤2，将此溶液加入到静电纺丝装置的注射针管中，通过喷射装置注射到放置的接收屏上进行静电纺丝，得到高分子聚合物纳米纤维芯层；
步骤3，用纯水和乙醇的混合溶剂(体积比1:2)将30wt％的聚醚酰亚胺高聚物水溶液稀释到0.83wt％后，得到修饰液I。再将50mg纳米纤维芯层浸泡于2ml修饰液I中反应至少4h，过夜烘干，修饰液I中的聚醚酰亚胺高聚物涂覆于纳米纤维芯层表面，成为修饰层I，获得涂覆有修饰层I的纳米纤维材料。
步骤4，将一定量的金属氯化物溶解于0.1M的盐酸溶液中，获得修饰液II。将步骤3中获得的涂覆有修饰层I的纳米纤维材料50mg浸泡于2ml特定浓度修饰液II中至少2h，再将材料取出置于40℃烘箱烘干去除水分，材料修饰层I表面涂覆上修饰液II中的金属氯化物，此金属氯化物作为修饰层II，得到表面功能化的纳米纤维。
优选的，上述步骤3中，金属氯化物包含一些亲氮的重金属元素，优选氯化钯或者氯化铊。
优选的，上述步骤2中，所述注射静电纺丝的步骤包括：将高分子聚合物溶液加入到静电纺丝装置的注射针管中，将针头接高压源，接收端接地，然后在22～28kv下，用微量泵以1.5～2.0mL/h推进，通过喷射装置注射到放置的接收屏上进行静电纺丝。
本发明所述的一种应用功能化复合纳米纤维材料可选择性分离富集复杂样品中蝶呤类化合物的方法，包括下述步骤：
步骤1、获得样品后，需要尽快对其进行冷冻保存或者处理，获得待测液或者处理液。
步骤2、将可选择性分离富集复杂样本中蝶呤类化合物的功能化复合纳米纤维材料填充于固相微萃取柱中，使用与固相微萃取柱相匹配的助推器加压分别使第一活化液，第二活化液流过功能化复合纳米纤维；
步骤3、将样品或其处理液转移至固相微萃取器中，使用助推器加压，使样品或其处理液流过功能化复合纳米纤维，从而吸附样品中的蝶呤类化合物，然后将洗脱液转移至固相微萃取器中，助推器加压使洗脱液流过功能化复合纳米纤维，从而将吸附在功能化纳米纤维上的蝶呤类化合物解析下来。
优选的，吸附样品中的蝶呤类化合物前，先对复合纳米纤维进行活化，活化的具体方法为：复合纳米纤维填充到固相微萃取器中，将第一活化液中转移至固相微萃取器中，使用与固相微萃取器匹配的助推器将固相微萃取器加压，使第一活化液流过复合纳米纤维；然后再将第二活化液转移至固相微萃取器，再次使用与固相微萃取器匹配的助推器加压，使第二活化液流过复合纳米纤维，使纳米纤维达到可以吸附类蝶呤化合物的状态。
优选的，步骤3中，所述采用复合纳米纤维吸附复杂样品中的蝶呤类化合物的方法包括以下步骤：将样品或其处理液转移至固相微萃取器中，所述固相微萃取器中含有已活化过的功能化复合纳米纤维，使用与固相微萃取器匹配的助推器将含有蝶呤类化合物的样品或其处理液加压使样品或其处理液流过功能化复合纳米纤维，将样品或其处理液中的喋呤类化合物吸附于功能化复合纳米纤维上。
优选的，所述第一活化液选自甲醇、乙醇、甲酸、乙酸的一种或两种以上的任意组合；所述第二活化液选自甲醇、乙醇、水的一种或两种以上的任意组合。
优选的，所述洗脱液由弱碱溶液和有机溶剂组成，弱碱溶液选自氨水、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钾溶液可形成弱碱性溶液的化合物；有机溶剂选自甲醇、乙醇的一种或两种以上的任意组合。
优选的，弱碱溶液质量分数为1％～10％，弱碱溶液和有机溶剂体积比为1：1～10：1，弱碱溶液pH范围7～9。
吸附后的解析步骤是指通过浸泡、冲洗、或者流过等方式，用氨水，碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾等弱碱性溶液将吸附在功能化复合纳米纤维上的蝶呤类化合物解析下来。
较优的，在采用复合纳米纤维材料吸附样品中的蝶呤类化合物前，先对该功能化纳米纤维进行活化。活化的具体方法为：复合纳米纤维填充到固相微萃取器中，将第一活化液中转移至固相微萃取器中，使用与固相微萃取器匹配的助推器将固相微萃取器加压，使第一活化液流过复合纳米纤维；然后再将第二活化液转移至固相微萃取器，再次使用与固相微萃取器匹配的助推器加压，使第二活化液流过复合纳米纤维，使纳米纤维达到可以吸附类蝶呤化合物的状态。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明的金属氯化物功能化的复合纳米纤维比表面积较大，纤维表面有较多的与目标分子相互作用位点，只使用现有颗粒型吸附剂1/10-1/100的用量(固定相体积显著减少)即可达到同样的萃取效果，吸附萃取效率大大提高；(2)本发明的功能化复合纳米纤维用于可选择性分离富集复杂样品中蝶呤类化合物时，其操作过程简单、快速，这一特点尤其适用于易被氧化易被破坏的不稳定的蝶呤类化合物的快速提取处理；(3)应用本发明的功能化复合纳米纤维可选择性分离富集复杂样品中蝶呤类化合物的过程中，功能化纳米纤维表面被富集的目标物只需用较少体积的弱碱性溶液即可解析，降低或者省去了常规固相萃取的洗脱液需挥发溶剂浓缩目标物的操作的能耗，也降低了蝶呤类化合物被破坏的风险。
附图说明
图1为本专利所使用的不同材料的透射电镜图；
图2为实施例1中用不同的材料对标液中甲氨蝶呤(MTX)及其谷氨酸多聚体(MTXPGn)化合物进行固相萃取操作处理后洗脱液进样的色谱图；
图3为实施例1中用不同的材料对尿液样本中甲氨蝶呤(MTX)及其谷氨酸多聚体(MTXPGn)化合物进行固相萃取操作处理后洗脱液进样的色谱图；
图4为实施例2中制得的功能化纳米纤维提取血液红细胞样品处理液中MTX的三种谷氨酸多聚体(MTXPGn)的色谱图。
其中：
图1中，(a)图为PS纳米纤维；(b)图为PS未经修饰层Ⅰ修饰，直接浸泡于修饰液Ⅱ的氯化钯溶液中，并烘干后得到的材料；(c)为本专利制备的Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维；
图2中，(a)为500ng/ml的MTX,MTXPG1,MTXPG2的混合标液；(b)使用纳米纤维芯层聚苯乙烯PS电纺纳米纤维作为固相萃取的吸附剂对500ng/ml的混合标液进行固相萃取操作后的洗脱液进样；(c)使用纳米纤维芯层聚苯乙烯(PS)电纺纳米纤维浸泡于25mg/ml的氯化钯溶液中至少2h后烘干获得的丝作为固相萃取的吸附剂对500ng/ml的混合标液进行固相萃取操作后的洗脱液进样；(d)为使用市面销售的Sep-Pak固相萃取小柱以标准方法处理500ng/ml的混合标液后获得的色谱图；(e)使用本专利制得的Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维作为固相萃取的吸附剂对500ng/ml的混合标液进行固相萃取操作后的洗脱液进样；
图3中，(a)为500ng/ml的MTX,MTXPG1,MTXPG2的混合标液；(b)使用纳米纤维芯层聚苯乙烯PS电纺纳米纤维作为固相萃取的吸附剂对加标500ng/ml的尿液进行固相萃取操作后的洗脱液进样；(c)使用纳米纤维芯层聚苯乙烯(PS)电纺纳米纤维浸泡于25mg/ml的氯化钯溶液中至少2h后烘干获得的丝作为固相萃取的吸附剂对加标500ng/ml的尿液进行固相萃取操作后的洗脱液进样；(d)为使用市面销售的Sep-Pak固相萃取小柱以标准方法处理加标500ng/ml的尿液后获得的色谱图；(e)使用本专利制得的Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维作为固相萃取的吸附剂对加标500ng/ml的尿液进行固相萃取操作后的洗脱液进样
图4中，(1)(2)(3)分别为100ng/ml的甲氨喋呤一聚谷氨酸(MTXPG1)甲氨喋呤二聚谷氨酸(MTXPG2)甲氨喋呤三聚谷氨酸(MTXPG3)混标的标准品溶液的质谱图；(4)(5)(6)为血液红细胞样品中加标(三种甲氨喋呤多聚体分别加标浓度为100ng/ml)后未提取之前的处理液进样；(7)(8)(9)为使用本专利制得的Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维作为固相萃取的吸附剂对血液红细胞样品(三种甲氨喋呤多聚体分别加标浓度为100ng/ml)进行固相萃取操作后的洗脱液进样。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明所述的一种可选择性分离富集复杂样品中喋呤类化合物的功能化复合纳米纤维材料，该功能化复合纳米纤维材料包括电纺纳米纤维芯层、修饰层I和修饰层II；纳米纤维芯层以高分子聚合物用高压静电纺丝法制备，其中高聚物溶解于溶剂B中得到修饰液Ⅰ，经过处理使其中的高聚物涂覆于纳米纤维芯层表面获得修饰层Ⅰ；金属氯化物溶解于溶剂C中得到修饰液Ⅱ，经过处理使其中的金属氯化物涂覆于修饰层Ⅰ表面获得修饰层Ⅱ。纳米纤维芯层高分子聚合物使用浓度为10wt％；修饰液I中高聚物溶液使用浓度为0.83wt％；修饰液II中功能层金属氯化物溶液使用浓度为10～25mg/ml。。将高分子聚合物加入溶剂A中获得纺丝溶液，以溶剂体积计，纺丝液中，纳米纤维芯层高分子聚合物使用浓度为10wt％。
纳米纤维芯层高分子聚合物包含一般市售的所有聚合物，优选聚氧乙烯、聚乙烯醇、聚萘二甲酸乙二酯、聚苯胺、尼龙、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯硫醚、醋酸纤维素、聚苯乙烯、聚已内酰胺、丙烯酸树脂和聚丙烯腈中的一种或几种混配。
修饰层Ⅰ所使用的高聚物选用表面含有多个N原子的聚醚酰亚胺高聚物。
修饰层Ⅱ所使用的金属氯化物优选氯化钯或者氯化铊。
溶剂A包含市售的能溶解高分子聚合物的所有溶剂，优选乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、水、卤代烃、芳香烃中的一种或几种混配。
本发明所述的一种可选择性分离富集复杂样品中喋呤类化合物的功能化复合纳米纤维材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将所述高分子聚合物加入到溶剂A中，待其溶解后、放在恒温磁力搅拌器上混合均匀后，将溶液置于室温下持续搅拌12～20h，得到高分子聚合物溶液；将此溶液加入到静电纺丝装置的注射针管中，通过喷射装置注射到放置的接收屏上进行静电纺丝，得到高分子聚合物纳米纤维芯层；
步骤2，将上述高分子聚合物溶液进行注射静电纺丝，得到高分子聚合物纳米纤维芯层；
步骤3，用纯水和乙醇的混合溶剂(体积比1:2)将30wt％的聚醚酰亚胺高聚物水溶液稀释到0.83wt％后，得到修饰液I。再将5mg纳米纤维芯层浸泡于修饰液I中反应至少4h，过夜烘干，修饰液I中的聚醚酰亚胺高聚物涂覆于纳米纤维芯层表面，成为修饰层I，获得涂覆有修饰层I的纳米纤维芯层。
步骤4，将一定量的金属氯化物溶解于0.1M的盐酸溶液中，获得修饰液修饰液II。将步骤3中获得的涂覆有修饰层I的纳米纤维芯层材料浸泡于特定浓度金修饰液II中至少2h，再将材料取出置于40℃烘箱烘干去除水分，材料修饰层I表面涂覆上修饰液II中的金属氯化物，此金属氯化物作为修饰层II，得到表面功能化的纳米纤维。
上述步骤4中，修饰层II的金属氯化物包含一些亲氮的重金属元素，优选氯化钯或者氯化铊。上述步骤2中，所述注射静电纺丝的步骤包括：将高分子聚合物溶液加入到静电纺丝装置的注射针管中，将针头接高压源，接收端接地，然后在22～28kv下，用微量泵以1.5～2.0mL/h推进，通过喷射装置注射到放置的接收屏上进行静电纺丝。
本发明所述的一种应用功能化复合纳米纤维材料可选择性分离富集复杂样品中蝶呤类化合物的方法，包括下述步骤：
步骤1、获得样品后，需要尽快对其进行冷冻或者处理获得待测液或者处理液。
步骤2、将可选择性分离富集复杂样本中蝶呤类化合物的功能化复合纳米纤维材料填充于固相微萃取柱中，使用与固相微萃取柱相匹配的助推器加压分别使第一活化液，第二活化液流过功能化复合纳米纤维；
步骤3、将复杂样品或其处理液转移至固相微萃取器中，使用助推器加压，使处理液流过功能化复合纳米纤维，从而吸附样品中的蝶呤类化合物，然后将洗脱液转移至固相微萃取器中，助推器加压使洗脱液流过功能化复合纳米纤维，从而将吸附在功能化纳米纤维上的蝶呤类化合物解析下来。
本发明的金属氯化物功能化复合纳米纤维材料可作为吸附剂，实现复杂样本中蝶呤类化合物的快速分离富集。应用金属氯化物功能化复合纳米纤维可选择性分离富集蝶呤类化合物的过程包括活化、吸附和洗脱；整个操作过程简单、快速，这一特点尤其适用于易被氧化和破坏的蝶呤类化合物或其多聚物的快速提取处理。
吸附样品中的蝶呤类化合物前，先对复合纳米纤维进行活化，活化的具体方法为：复合纳米纤维填充到固相微萃取器中，将第一活化液中转移至固相微萃取器中，使用与固相微萃取器匹配的助推器将固相微萃取器加压，使第一活化液流过复合纳米纤维；然后再将第二活化液转移至固相微萃取器，再次使用与固相微萃取器匹配的助推器加压，使第二活化液流过复合纳米纤维，使纳米纤维达到可以吸附类蝶呤化合物的状态。
活化的具体方法为：用水溶液、甲醇、乙醇等溶液中的一种或几种将复合纳米纤维材料进行浸润、然后冲洗，使功能化纳米纤维达到可以吸附蝶呤类化合物的状态。
吸附是采用功能化复合纳米纤维吸附复杂样品或其处理液中的蝶呤类化合物，具体步骤为：样品或其处理液转移至固相微萃取器中，使用助推器加压，使处理液流过功能化复合纳米纤维，使样品或其处理液中的蝶呤类化合物吸附于功能化复合纳米纤维上。将样品或其处理液转移至固相微萃取器中，所述固相微萃取器中含有已活化过的功能化复合纳米纤维，使用与固相微萃取器匹配的助推器将含有蝶呤类化合物的样品或其处理液加压使样品或其处理液流过功能化复合纳米纤维，将样品或其处理液中的喋呤类化合物吸附于功能化复合纳米纤维上。
将样品或其处理液转移至固相微萃取器中，所述固相微萃取器中含有已活化过的功能化复合纳米纤维，使用与固相微萃取器匹配的助推器将含有蝶呤类化合物的样品或其处理液加压使样品或其处理液流过功能化复合纳米纤维，将样品或其处理液中的喋呤类化合物吸附于功能化复合纳米纤维上。
所述洗脱液由弱碱溶液和有机溶剂组成，弱碱溶液选自氨水、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钾溶液可形成弱碱性溶液的化合物；有机溶剂选自甲醇、乙醇的一种或两种以上的任意组合。
所述洗脱液由弱碱溶液和有机溶剂组成，弱碱溶液选自氨水、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钾溶液可形成弱碱性溶液的化合物；有机溶剂选自甲醇、乙醇的一种或两种以上的任意组合。
洗脱是将吸附在功能化复合纳米纤维上的蝶呤类化合物解析下来，具体而言，通过浸泡、冲洗、或者流过等方式，用氨水，碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾等弱碱性溶液将吸附在功能化复合纳米纤维上的蝶呤类化合物解析下来。
应用本发明的功能化复合纳米纤维可选择性地分离富集复杂样品中蝶呤类化合物，使用的金属氯化物功能化纳米纤维的量取决于样品中含蝶呤类化合物的量，含量高，纳米纤维的量适当增加；需要检测的复杂样品通常含蝶呤类化合物是微量水平，即百万分之几，甚至更低，对于含微量蝶呤化合物的样品或其处理液，一般将5mg的功能化纳米纤维填充于固相萃取装置中，通过固相萃取过程进行吸附，然后使用0.05～0.2mL的解析液进行洗脱，即可保证高的回收率；针对复杂样本的分析测定应用，为了定量回收目标物，通常是0.1～0.5mL的生物样品或其处理液对应5mg的功能化纳米纤维进行吸附。
可以看到，本发明的功能化纳米纤维作为吸附剂使用时，其使用量很少，这还是由于本发明的功能化纳米纤维比表面积较大，纤维表面有较多的与目标分子相互作用位点，一般只使用现有颗粒型吸附剂1/10-1/100的用量(固定相体积显著减少)即可达到同样的萃取效果，吸附萃取效率大大提高。
另外，在上述处理过程中，解析液的用量也很少，降低或者省去了常规固相萃取的洗脱液需挥发溶剂浓缩目标物的操作的能耗，也降低了目标目标物被氧化破坏的风险。
实施例1尿液样本中甲氨蝶呤(MTX)及其谷氨酸多聚体(MTXPGn)化合物的快速提取分离
大部分生物样本的采集十分困难，且珍贵稀少，传统的方法需要的样品量一般比较大，至少达到毫升级别，且操作的过程十分复杂，涉及氮吹，蒸干等一系列步骤。而这些耗时耗力的操作对于生物样品的检测而言都是十分不利的。因为生物样本本身量稀少，而其中的蝶呤类化合物更是微量，多步的长时间的操作极易造成样品的损失和目标物的破坏、流失。本实施例中制备了Pd(Ⅱ)功能化的复合电纺纳米纤维材料，并将其应用到固相萃取技术中作为吸附剂。利用了纳米纤维材料的高比表面积和其表面修饰的Pd(Ⅱ)与目标物特定的螯合作用对目标物进行萃取，再利用少量的解析液对其解析，操作简单，易于实现。具体步骤如下：
步骤1：Pd(Ⅱ)功能化的复合电纺纳米纤维材料的制备：(1)取1.0g聚苯乙烯放入称量瓶中，加入10mL N-N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃(4/6,V/V)，搅拌过夜至溶解。溶液用静电纺丝法制备成含金属化合物的纳米纤维，40℃过夜烘干，制得的纳米纤维作为纳米纤维芯层使用。
(2)用纯水和乙醇的混合溶剂(重量比1:2)将30wt％的聚醚酰亚胺高聚物水溶液稀释到0.83wt％获得修饰液Ⅰ，将50mg的纳米纤维芯层材料浸泡于2ml修饰液Ⅰ中反应6h，过夜烘干使修饰液Ⅰ中的聚醚酰亚胺高聚物涂覆于纳米纤维芯层表面，作为修饰层Ⅰ，得到涂覆有修饰层Ⅰ电纺纳米纤维材料。
(3)将一定量的氯化钯溶解于0.1M的盐酸溶液中，调整氯化钯浓度为25mg/ml，获得含有Pd(Ⅱ)的修饰液Ⅱ。将上述涂覆有修饰层Ⅰ电纺纳米纤维材料50mg浸泡于2ml修饰液Ⅱ中至少2h，再将材料取出置于40℃烘箱烘干去除水分使修饰液Ⅱ中的Pd(Ⅱ)涂覆于修饰层Ⅰ表面，作为修饰层Ⅱ，得到Pd(Ⅱ)功能化修饰的纳米纤维。
经过上述步骤制得的Pd(Ⅱ)功能化修饰的纳米纤维如图1(c)，图1中(a)图为PS纳米纤维的透射电镜图，(b)图为PS未经修饰层Ⅰ修饰，直接浸泡于修饰液Ⅱ的氯化钯溶液中，并烘干后得到的材料的透射电镜图。图(b)与图(a)相比，只是表面附着了一些零散的颗粒状物质，而图(c)则明显形成了核-壳样结构，说明了本专利修饰层Ⅰ包裹与PS纳米纤维芯层表面，更清晰地显示出本发明的Pd(Ⅱ)功能化修饰的纳米纤维的结构。
步骤2：尿液样品处理液的获得：取尿液液0.5mL，尽快对其3000r/min离心5min，弃去沉淀，留下上清，获得尿液样品处理液。
步骤3：使用固相萃取材料对处理液进行处理：500μl尿液样品，转移至装填有5mg的Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维的固相微萃取柱中，使用与固相微萃取器配套的助推器加压使处理液流过功能化的纳米纤维后。再将1％(v/v)的氨水甲醇溶液(体积比为3：1)100μl转移至固相微萃取器中，使用与固相微萃取器配套的助推器加压使处理液流过功能化的纳米纤维后收集流出溶液，尽快测样或者冷冻留待测样。测样时，取20μl置于高效液相色谱自动进样器进样，检测器为紫外检测器，检测波长302nm。本实施例采取了甲氨喋呤及其三种谷氨酸聚合物作为目标物：甲氨喋呤(MTX)，一聚谷氨酸甲氨喋呤(MTXPG1)，二聚谷氨酸甲氨喋呤(MTXPG2)，三聚谷氨酸甲氨喋呤(MTXPG3)。
图1为用不同的材料对500ng/ml的MTX及其三种多聚体的混合标液进行固相萃取操作处理后洗脱液进样的色谱图，与(a)标液相比，(b)和(c)、(d)所使用的分别为PS纳米纤维，PS浸泡修饰液Ⅱ的氯化钯溶液并烘干后得到的材料，市面销售的Sep-Pak固相萃取小柱。(e)使用的为本专利发明的Pd(Ⅱ)功能化修饰的纳米纤维。(b)(c)(e)都按照实施例一中步骤三所述进行处理，图(d)则是由Sep-Pak固相萃取小柱按照操作标准步骤进行操作。针对标液可看出，(b)(c)(e)丝对于目标物仍然是没有太多吸附作用。而(e)的峰值几乎为(a)的五倍，获得了良好的浓缩效果，绝对回收率处于90％以上。
图2为用不同的材料对500ng/ml的加标尿液进行固相萃取操作处理后洗脱液进样的色谱图，与(a)标液相比，(b)和(c)、(d)所使用的分别为PS纳米纤维，PS浸泡修饰液Ⅱ的氯化钯溶液并烘干后得到的材料，市面销售的Sep-Pak固相萃取小柱。(e)使用的为本专利发明的Pd(Ⅱ)功能化修饰的纳米纤维。(b)(c)(e)都按照实施例一中步骤三所述进行处理，图(d)则是由Sep-Pak固相萃取小柱按照操作标准步骤进行操作。针对尿液样品可看出，(b)(c)丝对于目标物仍然是没有太多吸附作用。而(d)(e)都有获得了较好的浓缩效果。且(d)和(e)相比，(e)具有更好的选择性，可以在减少干扰性杂质的同时获得浓缩过后的目标峰。
这说明纳米纤维芯层经过修饰层Ⅰ的修饰，可以更加好的将修饰层Ⅱ的Pd(Ⅱ)固定在材料表面，这应该是由于聚醚酰亚胺高聚物的分子结构上含有大量的N原子，而Pd(Ⅱ)具有亲N的作用，过量的Pd(Ⅱ)被高聚物固定在了材料表面。当血液中的MTX目标物流过材料表面时，其结构中的4位--NH和5位杂环N原子与材料表面的Pd(Ⅱ)再形成稳定的螯合物。这些螯合的结构在弱碱性的溶液中被破坏，MTX分子得到释放，所以用Pd(Ⅱ)功能化的纳米纤维对血液样品中的目标物进行吸附后，用弱碱性的洗脱液再对其进行洗脱，获得最终的进样溶液。
所述固相微萃取器可以选择使用中国专利2005101231485和201020500026X所公开的萃取器，所述助推器可以选择使用中国专利2005101231485中所公开的常规注射器，也可以使用201020500026X中所公开的特制助推器。
从图2和图3可以看出，与没有经过Pd(Ⅱ)功能化的聚苯乙烯纳米纤维芯层的材料以及纳米纤维芯层浸泡10mg/ml的氯化钯溶液后烘干的材料相比，MTXPGn标液经过Pd(Ⅱ)功能化纳米纤维固相萃取后，峰值明显增大为未提取前的处理液中目标物浓度的近乎2倍，提示纳米纤维确实可以对目标物有吸附和浓缩作用，且应用于实际样品中绝对回收率达到90％～100％。而已有的研究多是采用市售的固相萃取小柱，已有报导的针对MTX及其多聚体的回收率30％～90％不等，且因为市售的固相萃取小柱没有选择性，若不是使用质谱进行检测，杂峰干扰较多。而由本专利图2和图3可知，本专利回收率的结果优于市面的固相萃取材料且对目标物具有一定的选择性，可以在去除大量干扰杂质的同时，获得较为洁净的待测液。因此经过Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维处理后的尿液样本可以最大程度对目标物进行富集浓缩，说明本发明的重金属离子功能化复合纳米纤维可以选择性的分离、提取和浓缩目标物，且操作过程简便、快速。
实施例2血液红细胞样品中甲氨蝶呤的谷氨酸多聚体(MTXPGn)化合物的快速提取分离
步骤1：血液红细胞样品处理液的获得：取血液0.5mL，尽快对其3000r/min离心5min，弃去上清，留下沉淀，获得血液红细胞的样品，取100μl血液红细胞样品，加入300μl的水溶液或标液后，震荡混匀，再加入400μl的乙腈震荡30s，3000r/min离心5min，取上清，去除沉淀。上清中再次加入1ml氯仿溶液，震荡30s后，3000r/min离心5min，取上层清液，获得血液红细胞样品处理液。
步骤3：使用固相萃取材料对标准品溶液或者处理液进行处理：100ul红细胞样品获得的处理液共有400μl，转移至装填有5mg的Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维的固相微萃取柱中，Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维的制备方式参考实施例1中的步骤1完成，使用与固相微萃取器配套的助推器加压使处理液流过功能化的纳米纤维后。再将1％(v/v)的氨水甲醇溶液(体积比3：1)50μl转移至固相微萃取器中，使用与固相微萃取器配套的助推器加压使处理液流过功能化的纳米纤维后收集流出溶液，尽快测样或者冷冻留待测样。
测样时，取20μl置于高效液相色谱-质谱联用自动进样器进样，色谱柱采用VP-ODSShimadzu C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相采用10mmol碳酸氢铵溶液和甲醇(80：20，v/v)，以25％氨水调节pH＝10；流速0.3ml/min。质谱条件为电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式，采用一级全扫描、选择性离子扫描和多反应监测(MRM)模式。进样量5μl。本实施例采取了甲氨喋呤的三种谷氨酸聚合物作为目标物：一聚谷氨酸甲氨喋呤(MTXPG1)，二聚谷氨酸甲氨喋呤(MTXPG2)，三聚谷氨酸甲氨喋呤(MTXPG3)。各化合物质质谱参数条件如下表所示:
图4的左侧(1)和(2)、(3)为100ng/ml的三种MTX谷氨酸多聚体MTXOG1、MTXPG2、MTXPG3的标液质谱图；(4)(5)(6)为加标100ng/ml浓度未进行提取前的血样图；(7)(8)(9)提取使用本专利制得的Pd(Ⅱ)功能化复合纳米纤维作为固相萃取的吸附剂对血液样品(三种甲氨喋呤多聚体分别加标浓度为100ng/ml)进行固相萃取操作后的洗脱液进样获得的质谱图，由(4)(5)(6)和(7)(8)(9)的对比可看出本专利制备的功能化复合电纺纳米纤维对血液红细胞生物样本中的目标物具有良好吸附作用。(7)(8)(9)峰值对应基本大于(4)(5)(6)峰值2倍，绝对回收率可以达到90％～100％，获得了良好的浓缩效果，这说明纳米纤维芯层经过修饰层Ⅰ聚醚酰亚胺高聚物的修饰，可以更加好的将修饰层ⅡPd(Ⅱ)固定在材料表面。血液中的甲氨喋呤及多聚体等基本存在和作用于红细胞中，它的多聚体结构中含有蝶呤类化合物通常含有的结构：4位--NH和5位杂环N原子。这样的结构可以与材料表面的Pd(Ⅱ)形成稳定的螯合物。这些螯合的结构在弱碱性的溶液中被破坏，甲氨蝶呤分子得到释放，所以用功能化的纳米纤维对血液样品中的目标物进行吸附后，用弱碱性的洗脱液再对其进行洗脱，获得最终的进样溶液。
所述固相微萃取器可以选择使用中国专利2005101231485和201020500026X所公开的萃取器，所述助推器可以选择使用中国专利2005101231485中所公开的常规注射器，也可以使用201020500026X中所公开的特制助推器。
在血液中，MTX原型化合物通过复杂的作用还可以生成多种多聚物，这些多聚物含量更低，结构更加不稳定，其检测一直是困扰临床药物监测的难题。通过对多聚体的吸附回收实验，证明了本专利所述的新材料对于含有共有结构4位--NH和5位杂环N原子的蝶呤类目标物都可以进行尝试应用。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种复合纳米纤维材料，其特征在于，复合纳米纤维材料包括纳米纤维芯层、修饰层I、修饰层II；其中，纳米纤维芯层以高分子聚合物用高压静电纺丝法制备，其中，高聚物溶解于溶剂B中得到修饰液Ⅰ，修饰液Ⅰ中的高聚物涂覆于纳米纤维芯层表面获得修饰层Ⅰ；其中，金属氯化物溶解于溶剂C中得到修饰液Ⅱ，修饰液Ⅱ中的金属氯化物涂覆于修饰层Ⅰ表面获得修饰层Ⅱ。
2.根据权利要求1所述的复合纳米纤维材料，其特征在于，所述纳米纤维芯层的高分子聚合物为聚氧乙烯、聚乙烯醇、聚萘二甲酸乙二酯、聚苯胺、尼龙、聚苯硫醚、醋酸纤维素、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚已内酰胺、丙烯酸树脂和聚丙烯腈中的一种或几种混配；所述高分子聚合物溶于的溶剂A为乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、水、卤代烃、芳香烃中的一种或几种混配。
3.根据权利要求1所述的复合纳米纤维材料，其特征在于，所述修饰层Ⅰ的高聚物为聚醚酰亚胺高聚物；所述溶剂B为纯水和乙醇的混合溶剂，纯水和乙醇体积比1:2。
4.根据权利要求1所述的复合纳米纤维材料，其特征在于，所述修饰层Ⅱ的金属氯化物为氯化钯或氯化坨；所述溶剂C为0.1M的盐酸溶液。
5.一种权利要求1所述的复合纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将高分子聚合物加入到溶剂A中，待其溶解后、放在恒温磁力搅拌器上混合均匀后，将溶液置于室温下持续搅拌12 ~20 h，得到高分子聚合物溶液；
步骤2，将上述高分子聚合物溶液进行注射静电纺丝，得到高分子聚合物纳米纤维芯层；
步骤3，用纯水和乙醇的混合溶剂，纯水和乙醇体积比为1:2；将30wt%的聚醚酰亚胺高聚物水溶液稀释到0.83wt%后，得到修饰液I；再将纳米纤维芯层浸泡于修饰液I中反应至少4h，烘干，修饰液I中的聚醚酰亚胺高聚物涂覆于纳米纤维芯层表面，成为修饰层I，获得涂覆有修饰层I的纳米纤维材料；
步骤4，将金属氯化物溶解于0.1M的盐酸溶液中，获得修饰液II,修饰液II中金属氯化物溶液使用浓度为10~25mg/ml；将步骤3中获得的涂覆有修饰层I的纳米纤维材料浸泡于修饰液II中至少2h，再将材料取出烘干去除水分，材料修饰层I表面涂覆上修饰液II中的金属氯化物，此金属氯化物作为修饰层II，得到表面功能化的复合纳米纤维材料。
6.根据权利要求5所述的复合纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述注射静电纺丝的步骤包括：将高分子聚合物溶液加入到静电纺丝装置的注射针管中，将针头接高压源，接收端接地，然后在22~28 kv下，用微量泵以1.5 ~2.0 mL/h推进，通过喷射装置注射到放置的接收屏上进行静电纺丝。
7.一种应用权利要求1-4所述的任意一种复合纳米纤维材料选择性分离富集复杂样品中蝶呤类化合物的方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤1、获得样品后，尽快对样品进行冷冻保存或者处理，获得待测液或者处理液；步骤2、将可选择性分离富集复杂样品中蝶呤类化合物的复合纳米纤维材料填充于固相微萃取柱中，使用与固相微萃取柱相匹配的助推器加压分别使第一活化液、第二活化液流过复合纳米纤维；步骤3、将样品或其处理液转移至固相微萃取器中，使用助推器加压，使样品或其处理液流过复合纳米纤维，吸附样品中的蝶呤类化合物，然后将洗脱液转移至固相微萃取器中，助推器加压使洗脱液流过复合纳米纤维，将吸附在功能化纳米纤维上的蝶呤类化合物解析下来。
8.根据权利要求7所述的应用复合纳米纤维材料选择性分离富集复杂样品中蝶呤类化合物的方法，其特征在于，吸附样品中的蝶呤类化合物前，先对复合纳米纤维进行活化，活化的具体方法为：复合纳米纤维填充到固相微萃取器中，将第一活化液中转移至固相微萃取器中，使用与固相微萃取器匹配的助推器将固相微萃取器加压，使第一活化液流过复合纳米纤维；然后再将第二活化液转移至固相微萃取器，再次使用与固相微萃取器匹配的助推器加压，使第二活化液流过复合纳米纤维，使纳米纤维达到可以吸附类蝶呤化合物的状态；将样品或其处理液转移至固相微萃取器中，所述固相微萃取器中含有已活化过的功能化复合纳米纤维，使用与固相微萃取器匹配的助推器将含有蝶呤类化合物的样品或其处理液加压使样品或其处理液流过功能化复合纳米纤维，将样品或其处理液中的喋呤类化合物吸附于功能化复合纳米纤维上。
9.根据权利要求7所述的应用功能化复合纳米纤维材料可选择性分离富集复杂样品中喋呤类化合物的方法，其特征在于，所述第一活化液选自甲醇、乙醇、甲酸、乙酸的一种或两种以上的任意组合；所述第二活化液选自甲醇、乙醇、水的一种或两种以上的任意组合。
10.根据权利要求7所述的应用复合纳米纤维材料选择性分离富集复杂样品中喋呤类化合物的方法，其特征在于，所述洗脱液由弱碱溶液和有机溶剂组成，弱碱溶液选自氨水、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钾溶液可形成弱碱性溶液的化合物；有机溶剂选自甲醇、乙醇的一种或两种以上的任意组合；弱碱溶液质量分数为1%~10%，弱碱溶液和有机溶剂体积比为1：1~10：1，弱碱溶液pH范围7~9。
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郗存显等: "钯（Ⅱ）-甲氨蝶呤螯合物与亚甲蓝相互作用的共振瑞利散射光谱及其分析应用", 《高等学校化学学报》 *
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CN112587959A (zh) * 2019-12-31 2021-04-02 杭州九源基因工程有限公司 制备酰化多肽步骤中色谱固定相的再生方法

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