CN110187116A - 一种介孔微球及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物纳米磁珠应用和医学检验技术领域，涉及一种介孔微球及其制备和应用，本发明所述介孔微球，由聚苯乙烯制成，所述聚苯乙烯介孔微球实体内包埋Fe3O4纳米粒子，所述Fe3O4纳米粒子粒径为5‑30nm，具有超顺磁特性，在没有磁场的状态下没有磁性，不会发生聚集，分散性好，所述荧光基团包埋于所述介孔内，与介孔微球的表面亲和性好，荧光强度高，避免量子点暴露在生物、水溶液等样品中而造成荧光减弱，进一步提高了荧光强度及荧光强度的稳定性，长期保证其满足检测的需求，表面具有包封保护层利于在介孔微球表面进一步修饰活化，而且量子点包埋进介孔微球的内部，给表面留有更多的结合空间，增加其偶联的分子量。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米磁珠应用和医学检验技术领域，特别涉及一种介孔微球及其制备和应用。
背景技术
化学发光免疫测定(CLIA)属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体、抗原或其他具有特异性识别功能的分子，当特异性识别结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生化学反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测，化学发光免疫测定技术具有特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒和安全稳定的优势，在现今的科技发展过程中，随着全自动技术、人工智能和大数据技术的发展，化学发光免疫测定的可自动化前景吸引了很多关注。
流式细胞术和液相芯片检测方法都利用了化学发光免疫测定技术，近年来，有学者利用荧光微球，结合流式细胞术，集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体，使得荧光微球在液流中流动，逐个通过检测区，并用高灵敏度检测器记录下其散射光及各种荧光信号，从而对微球进行多参数分析。
然而在实际应用时，有机荧光染料存在易降解、光漂白等缺点，而且激发波长不相同，容易发生能量转移淬灭，因此常将量子点用于荧光编码微球，包埋于磁性微球内或连接在磁性微球的表面，中国专利文献CN109233836A公开了一种量子点荧光微球及其制备方法，通过量子点上的活性基团与活性微球表面连接，通过更稳定的连接相对提高了荧光强度和稳定性，然而由于被活性基团改性，量子点荧光产率降低，而量子点包埋于磁性微球内，虽然能使用油溶性量子点，但是包埋量有限。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术用于编码微球的量子点荧光强度低，稳定性不好难以实现检测应用，进而提供了一种荧光强度强，稳定性好的介孔微球及其制备和应用。
本发明公开了一种介孔微球，包括：
聚苯乙烯介孔微球，粒径为2-20um，介孔孔径为5-50nm；
Fe3O4纳米粒子，所述Fe3O4纳米粒子粒径为5-30nm，包埋于所述聚苯乙烯介孔微球的球体内；
荧光基团，包埋于所述介孔内。
优选的，所述介孔微球表面包封有经氨基和/或羧基改性的聚乙烯亚胺层。
优选的，所述Fe3O4纳米粒子的质量占所述聚苯乙烯介孔微球和Fe3O4纳米粒子的质量之和的1-5％。
优选的，所述荧光基团选自波长各不相同的CdSe/ZnS量子点，波长范围为520nm-680nm。
优选的，所述荧光基团包括至少四种中心发射波长各不相同的所述荧光基团，每两个所述荧光基团的中心发射波长差值≥30nm。
本发明还公开了所述介孔微球的制备方法，包括以下步骤：
制备聚苯乙烯介孔微球步骤：取聚苯乙烯与Fe3O4纳米粒子采用反相微乳法制备包埋有Fe3O4纳米粒子的聚苯乙烯介孔微球；
导入荧光基团：将荧光基团导入所述聚苯乙烯介孔微球的介孔中即得所述介孔微球。
优选的，还包括包封和改性步骤，采用聚乙烯亚胺包覆在所述介孔微球的外表面，然后进行氨基化改性和/或羧基化改性，所述聚乙烯亚胺和所述介孔微球的质量比为(8-12):1。
优选的，所述反相微乳的体系为Span 85/Tween/液体石蜡，其中所述Span85、Tween80和液体石蜡的比例为(0.5-6):1:(30-80)(g:g:mL)。
优选的，所述荧光基团通过超声引导真空技术导入，所述超声的频率为30-40kHz，功率为500-800W，所述真空的真空度>9.8×10-4Pa。
本发明还公开了所述介孔微球或所述介孔微球制备方法制备的介孔微球在荧光分析领域的应用。
本发明还公开了一种荧光编码微球，包括所述介孔微球或所述介孔微球制备方法制备的介孔微球，还包括连接在所述介孔微球外表面的生物识别分子。
本发明还公开了所述介孔微球或所述介孔微球制备方法制备的介孔微球或所述荧光编码磁珠在流式细胞分析领域或液相芯片检测领域的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述介孔微球，由聚苯乙烯制成，粒径和形状易于控制，表面容易改性，所述聚苯乙烯介孔微球实体内包埋Fe3O4纳米粒子，所述Fe3O4纳米粒子粒径为5-30nm，具有超顺磁特性，在没有磁场的状态下没有磁性，不会发生聚集，分散性好，所述荧光基团包埋于所述介孔内，与介孔微球的表面亲和性好，荧光强度高，避免量子点暴露在生物、水溶液等样品中而造成荧光减弱，进一步提高了荧光强度及荧光强度的稳定性，长期保证其满足检测的需求，此外，还有利于在介孔微球表面进一步修饰活化，从而进一步用于不同生物样品的标记，而且量子点包埋进介孔微球的内部，给表面留有更多的结合空间，增加其偶联的分子量。
2.本发明所述介孔微球，包括包封和改性步骤，采用聚乙烯亚胺PEI包覆在所述介孔微球的外表面，然后进行氨基化改性和/或羧基化改性，避免量子点的溢出和暴露在生物、水溶液等样品中而造成荧光减弱，而且使得原本表面结构复杂的介孔微球具有平整的表面保护层，还有利于在介孔微球表面进一步修饰活化，用于不同生物样品的标记。
3.本发明所述介孔微球采用反向微乳法制备，方法简单易操作，无污染成本低，克服了现有荧光染料的制备方法污染严重且成本高的缺点。
4.本发明所述荧光编码微球，采用包埋有Fe3O4纳米粒子和量子点的介孔微球，并包括外表面的保护层，荧光稳定不易淬灭，表面易于改性，结合位点丰富，检测量较大，实用性好。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
制备聚苯乙烯介孔微球：取0.03g粒径为5-20nm的Fe3O4纳米粒子溶解于12g DMF中，超声分散，加入2.97g聚苯乙烯加热至90℃制成聚苯乙烯溶液，将1g Span 85和0.5gTween溶解在80mL预热至85℃的液体石蜡中，加入至上述聚苯乙烯溶液中，在500rpm的搅拌速率下，保持10min，冰浴降温，继续搅拌10min后向其中滴加10mL异丙醇，10min内滴完，继续搅拌40min后将上述乳液倒入800mL体积比为1:1的乙醇和石油醚混合溶液中，搅拌静置后过滤，使用体积比为1:1的乙醇石油醚混合溶液洗涤两次，自然干燥得到聚苯乙烯多孔微球，所述聚苯乙烯介孔微球粒径为16-18um，所述介孔的孔径为5-20nm；
导入荧光基团：取200μl CdSe/ZnS分散液(正己烷分散液，30uM，中心发射波长为580nm)，加入1m L乙醇絮凝；8000rpm离心3min后倾倒上清液；室温挥发量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于1.5mL氯仿；取50mg所述聚苯乙烯介孔微球于离心管中，加入获得的1.5mL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，超声分散得到分散液，通过真空介导超声引导技术将量子点引导进介孔微球内，其中所述超声的频率为40kHz，功率为800W，所述真空为高于9.8×10-4Pa的真空度，然后将得到的混合液13000rpm离心2min，除去上清干燥，即得装载有量子点的介孔微球；
包封和改性步骤：取250mg聚乙烯亚胺PEI溶解于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液MEST(pH＝5.0，0.05％(w/V)Tween-20)中，取25mg上述装载有量子点的介孔微球，加入上述PEI溶液中，超声分散，避光反应30min，随后离心除去上清液，加入120μL超纯水和10mL乙醇，超声若干秒使微球充分分散，随后加入700μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES和800μL正硅酸乙酯TEOS，涡旋3秒，避光旋转反应30min，然后2000rpm离心2min除去上清，用乙醇在相同离心条件下离心洗涤，重复5次，最后重悬于10mL超纯水中即得所述介孔微球，所述介孔微球的表面介孔被包封，呈圆球形，直径为18-20um；
制备荧光编码微球：取5mL上述介孔微球，加入50mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体，37℃避光偶联反应2h后低速离心，去除上清重新分散，制得带有甲胎蛋白AFP识别分子Ⅰ的荧光编码微球；
制备荧光编码微球检测试剂盒：以上述荧光编码微球作为试剂Ⅰ，以120μl CdSe/ZnS量子点(中心发射波长680nm，溶于正己烷中，30μM)标记的60mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体作为生物识别分子Ⅱ，作为试剂Ⅱ，与试剂Ⅰ配合使用。
实施例2
制备聚苯乙烯介孔微球：取0.15g粒径为30-50nm的Fe3O4纳米粒子溶解于12g DMF中，超声分散，加入2.85g聚苯乙烯加热至80℃制成聚苯乙烯溶液，将3g Span 85和1.5gTween溶解在30mL预热至85℃的液体石蜡中，加入至上述聚苯乙烯溶液中，在1500rpm的搅拌速率下，保持30min，冰浴降温，继续搅拌20min后向其中滴加50mL异丙醇，60min内滴完，继续搅拌80min后将上述乳液倒入1000mL体积比为1:1的乙醇和石油醚混合溶液中，搅拌静置后过滤，使用体积比为1:1的乙醇石油醚混合溶液洗涤两次，自然干燥得到聚苯乙烯多孔微球，所述聚苯乙烯介孔微球粒径为2-5um，所述介孔的孔径为30-50nm；
导入荧光基团：取中心发射波长为520nm，550nm，580nm和610nm的CdSe/ZnS分散液各100μl(正己烷分散液，30uM)，加入1.5mL乙醇絮凝；8000rpm离心3min后倾倒上清液；室温挥发量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于1.5mL氯仿，取80mg所述聚苯乙烯介孔微球于离心管中，加入获得的1.5mL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，超声分散得到分散液，通过真空介导超声引导技术将量子点引导进介孔微球内，其中所述超声的频率为30kHz，功率为500W，所述真空为高于9.8×10-4Pa的真空度，然后将得到的混合液13000rpm离心2min，除去上清干燥，即得装载有量子点的介孔微球；
包封和改性步骤：取200mg聚乙烯亚胺PEI溶解于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液MEST(pH＝5.0，0.05％(w/V)Tween-20)中，取25mg上述装载有量子点的介孔微球，14000rpm离心3min除去上清液，加入上述PEI溶液中，超声分散，避光反应40min，随后离心除去上清液，加入120μL超纯水和10mL乙醇，超声若干秒使微球充分分散，随后加入600μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES和600μL正硅酸乙酯TEOS，涡旋10秒，避光旋转反应60min，然后2000rpm离心2min除去上清，用乙醇在相同离心条件下离心洗涤，重复3次，最后重悬于10mL超纯水中即得所述介孔微球，所述介孔微球的表面介孔被包封，呈圆球形，直径为3-8um；
制备荧光编码微球：取5mL上述介孔微球，加入50mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体，37℃避光偶联反应2h后低速离心，去除上清重新分散，制得带有甲胎蛋白AFP识别分子Ⅰ的荧光编码微球；
制备荧光编码微球检测试剂盒：以上述荧光编码微球作为试剂Ⅰ，以120μl CdSe/ZnS量子点(中心发射波长680nm，溶于正己烷中，30μM)标记的60mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体作为生物识别分子Ⅱ，作为试剂Ⅱ，与试剂Ⅰ配合使用。
实施例3
制备聚苯乙烯介孔微球：取0.01g粒径为20-40nm的Fe3O4纳米粒子溶解于10g DMF中，超声分散，加入0.99g聚苯乙烯加热至100℃制成聚苯乙烯溶液，将2.0g Span 85和1.0gTween溶解在40mL预热至85℃的液体石蜡中，加入至上述聚苯乙烯溶液中，在1000rpm的搅拌速率下，保持20min，冰浴降温，继续搅拌15min后向其中滴加35mL异丙醇，30min内滴完，继续搅拌60min后将上述乳液倒入800mL体积比为1:1的乙醇和石油醚混合溶液中，搅拌静置后过滤，使用体积比为1:1的乙醇石油醚混合溶液洗涤两次，自然干燥得到聚苯乙烯多孔微球，所述聚苯乙烯介孔微球粒径为10-15um，所述介孔的孔径为25-40nm；
导入荧光基团：取中心发射波长为520nm，580nm，620nm和680nm的CdSe/ZnS分散液各100μl(正己烷分散液，30uM)，加入1.5mL乙醇絮凝；8000rpm离心3min后倾倒上清液；室温挥发量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于1.5mL氯仿，取68mg所述聚苯乙烯介孔微球于离心管中，加入获得的1.5mL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，超声分散得到分散液，通过真空介导超声引导技术将量子点引导进介孔微球内，其中所述超声的频率为35kHz，功率为600W，所述真空为高于9.8×10-4Pa的真空度，然后将得到的混合液13000rpm离心2min，除去上清干燥，即得装载有量子点的介孔微球；
包封和改性步骤：取150mg聚乙烯亚胺PEI溶解于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液MEST(pH＝5.0，0.05％(w/V)Tween-20)中，取25mg上述装载有量子点的介孔微球，14000rpm离心3min除去上清液，加入上述PEI溶液中，超声分散，避光反应30min，随后离心除去上清液，加入120μL超纯水和10mL乙醇，超声若干秒使微球充分分散，随后加入500μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES和500μL正硅酸乙酯TEOS，涡旋8秒，避光旋转反应40min，然后2000rpm离心2min除去上清，用乙醇在相同离心条件下离心洗涤，重复4次，最后重悬于10mL超纯水中即得所述介孔微球，所述介孔微球的表面介孔被包封，呈圆球形，直径为12-18um；制备荧光编码微球：取5mL上述介孔微球，加入50mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体，37℃避光偶联反应2h后低速离心，去除上清重新分散，制得带有甲胎蛋白AFP识别分子Ⅰ的荧光编码微球；
制备荧光编码微球检测试剂盒：以上述荧光编码微球作为试剂Ⅰ，以120μl CdSe/ZnS量子点(中心发射波长550nm，溶于正己烷中，30μM)标记的60mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体作为生物识别分子Ⅱ，作为试剂Ⅱ，与试剂Ⅰ配合使用。
实施例4
制备聚苯乙烯介孔微球：取0.04g粒径为10-30nm的Fe3O4纳米粒子溶解于10g DMF中，超声分散，加入1.96g聚苯乙烯加热至90℃制成聚苯乙烯溶液，将2.5g Span 85和0.5gTween溶解在50mL预热至85℃的液体石蜡中，加入至上述聚苯乙烯溶液中，在1000rpm的搅拌速率下，保持20min，冰浴降温，继续搅拌20min后向其中滴加30mL异丙醇，50min内滴完，继续搅拌50min后将上述乳液倒入1000mL体积比为1:1的乙醇和石油醚混合溶液中，搅拌静置后过滤，使用体积比为1:1的乙醇石油醚混合溶液洗涤两次，自然干燥得到聚苯乙烯多孔微球，所述聚苯乙烯介孔微球粒径为8-12um，所述介孔的孔径为25-30nm；
导入荧光基团：取中心发射波长为580nm和620nm的CdSe/ZnS分散液各200μl(正己烷分散液，30uM)，加入1.5mL乙醇絮凝；8000rpm离心3min后倾倒上清液；室温挥发量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于1.5mL氯仿，取75mg所述聚苯乙烯介孔微球于离心管中，加入获得的1.5mL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，超声分散得到分散液，通过真空介导超声引导技术将量子点引导进介孔微球内，其中所述超声的频率为35kHz，功率为600W，所述真空为高于9.8×10-4Pa的真空度，然后将得到的混合液13000rpm离心2min，除去上清干燥，即得装载有量子点的介孔微球；
包封和改性步骤：取250mg聚乙烯亚胺PEI溶解于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液MEST(pH＝5.0，0.05％(w/V)Tween-20)中，取25mg上述装载有量子点的介孔微球，14000rpm离心3min除去上清液，加入上述PEI溶液中，超声分散，避光反应30min，随后离心除去上清液，加入120μL超纯水和10mL乙醇，超声若干秒使微球充分分散，随后加入700μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES和800μL正硅酸乙酯TEOS，涡旋3-10秒，避光旋转反应30-60min，然后2000rpm离心2min除去上清，用乙醇在相同离心条件下离心洗涤，重复3-5次，最后重悬于10mL超纯水中即得所述介孔微球，所述介孔微球的表面介孔被包封，呈圆球形，直径为10-15um；制备荧光编码微球：取5mL上述介孔微球，加入50mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体，37℃避光偶联反应2h后低速离心，去除上清重新分散，制得带有甲胎蛋白AFP识别分子Ⅰ的荧光编码微球；
制备荧光编码微球检测试剂盒：以上述荧光编码微球作为试剂Ⅰ，以120μl CdSe/ZnS量子点(中心发射波长680nm，溶于正己烷中，30μM)标记的60mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体作为生物识别分子Ⅱ，作为试剂Ⅱ，与试剂Ⅰ配合使用。
实施例5
制备聚苯乙烯介孔微球：取0.06g粒径为25-45nm的Fe3O4纳米粒子溶解于8g DMF中，超声分散，加入1.94g聚苯乙烯加热至90℃制成聚苯乙烯溶液，将1g Span 85和1.0gTween溶解在40mL预热至85℃的液体石蜡中，加入至上述聚苯乙烯溶液中，在600rpm的搅拌速率下，保持30min，冰浴降温，继续搅拌20min后向其中滴加50mL异丙醇，60min内滴完，继续搅拌60min后将上述乳液倒入800mL体积比为1:1的乙醇和石油醚混合溶液中，搅拌静置后过滤，使用体积比为1:1的乙醇石油醚混合溶液洗涤两次，自然干燥得到聚苯乙烯多孔微球，所述聚苯乙烯介孔微球粒径为15-18um，所述介孔的孔径为35-50nm；
导入荧光基团：取中心发射波长为520nm和680nm的CdSe/ZnS分散液各150μl(正己烷分散液，30uM)，加入1.5mL乙醇絮凝；8000rpm离心3min后倾倒上清液；室温挥发量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于1.5mL氯仿，取68mg所述聚苯乙烯介孔微球于离心管中，加入获得的1.5mL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，超声分散得到分散液，通过真空介导超声引导技术将量子点引导进介孔微球内，其中所述超声的频率为35kHz，功率为600W，所述真空为高于9.8×10-4Pa的真空度，然后将得到的混合液13000rpm离心2min，除去上清干燥，即得装载有量子点的介孔微球；
包封和改性步骤：取250mg聚乙烯亚胺PEI溶解于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液MEST(pH＝5.0，0.05％(w/V)Tween-20)中，取25mg上述装载有量子点的介孔微球，14000rpm离心3min除去上清液，加入上述PEI溶液中，超声分散，避光反应30min，随后离心除去上清液，加入120μL超纯水和10mL乙醇，超声若干秒使微球充分分散，随后加入300μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES和300μL正硅酸乙酯TEOS，涡旋3-10秒，避光旋转反应30-60min，然后2000rpm离心2min除去上清，用乙醇在相同离心条件下离心洗涤，重复3-5次，最后重悬于10mL超纯水中即得所述介孔微球，所述介孔微球的表面介孔被包封，呈圆球形，直径为18-20um；
制备荧光编码微球：取5mL上述介孔微球，加入50mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体，37℃避光偶联反应2h后低速离心，去除上清重新分散，制得带有甲胎蛋白AFP识别分子Ⅰ的荧光编码微球；
制备荧光编码微球检测试剂盒：以上述荧光编码微球作为试剂Ⅰ，以120μl CdSe/ZnS量子点(中心发射波长630nm，溶于正己烷中，30μM)标记的60mg鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体作为生物识别分子Ⅱ，作为试剂Ⅱ，与试剂Ⅰ配合使用。
实验例6
本实验例提供了一种所述荧光编码微球在液相芯片分析领域的应用。
本实施例提供了一种荧光编码检测试剂盒，包括荧光编码微球，所述荧光编码微球与试验例3基本相同，区别在于，所述荧光编码微球为连有不同生物识别分子Ⅰ的混合物，分别连接鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体，鼠抗人癌胚抗原CEA单克隆抗体，鼠抗人糖链抗原CA125单克隆抗体，鼠抗人糖链抗原CA199单克隆抗体，鼠抗人糖链抗原CA153单克隆抗体，同时制备相应的试剂Ⅱ，采用液相芯片法，用于血清中五种目标分子的同时检测。
实验例7
本实验例提供了一种所述荧光编码微球在流式细胞分析领域的应用。
本实施例提供了一种荧光编码检测试剂盒，包括荧光编码微球，所述荧光编码微球与试验例4基本相同，区别在于，所述荧光编码微球为连有不同生物识别分子Ⅰ的混合物，分别连接鼠抗人甲胎蛋白AFP单克隆抗体，鼠抗人癌胚抗原CEA单克隆抗体，鼠抗人糖链抗原CA125单克隆抗体，鼠抗人糖链抗原CA199单克隆抗体，鼠抗人糖链抗原CA153单克隆抗体，同时制备相应的试剂Ⅱ，采用流式细胞仪检测法，用于血清中五种目标分子的同时检测。
实验例1
将实施例1-5所述介孔微球放置15天(序号1)、6个月(序号2)、12个月(序号3)后，各取1mL，采用BeckmanCounter和荧光分光光度计测定所述介孔微球的分散性和荧光性能，发现介孔微球分散性和荧光性能均无明显变化，平均荧光强度和荧光强度CV值检测结果如表1所示。
表1实施例1-5所述介孔微球表征结果
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (12)
1.一种介孔微球，其特征在于，包括：
聚苯乙烯介孔微球，粒径为2-20um，介孔孔径为5-50nm；
Fe3O4纳米粒子，所述Fe3O4纳米粒子粒径为5-30nm，包埋于所述聚苯乙烯介孔微球的球体内；
荧光基团，包埋于所述介孔内。
2.根据权利要求1所述的介孔微球，其特征在于，所述介孔微球表面包封有经氨基和/或羧基改性的聚乙烯亚胺层。
3.根据权利要求1或2所述的介孔微球，其特征在于，所述Fe3O4纳米粒子的质量占所述聚苯乙烯介孔微球和Fe3O4纳米粒子质量之和的1-5％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的介孔微球，其特征在于，所述荧光基团选自波长各不相同的CdSe/ZnS量子点，波长范围为520nm-680nm。
5.根据权利要求1-4任一项说所述的介孔微球，其特征在于，所述荧光基团包括至少四种中心发射波长各不相同的所述荧光基团，每两个所述荧光基团的中心发射波长差值≥30nm。
6.一种权利要求1-5任一项所述介孔微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备聚苯乙烯介孔微球步骤：取聚苯乙烯与Fe3O4纳米粒子采用反相微乳法制备包埋有Fe3O4纳米粒子的聚苯乙烯介孔微球；
导入荧光基团：将荧光基团导入所述聚苯乙烯介孔微球的介孔中即得所述介孔微球。
7.根据权利要求6所述的介孔微球制备方法，其特征在于，还包括包封和改性步骤，采用聚乙烯亚胺包覆在所述介孔微球的外表面，然后进行氨基化改性和/或羧基化改性，所述聚乙烯亚胺和所述介孔微球的质量比为(8-12):1。
8.根据权利要求6或7所述的介孔微球制备方法，其特征在于，所述反相微乳的体系为Span85/Tween/液体石蜡，所述Span85、Tween80和液体石蜡的比例为(0.5-6):1:(30-80)(g:g:mL)。
9.根据权利要求6-8任一项所述的介孔微球的制备方法，其特征在于，所述荧光基团通过超声引导真空技术导入，所述超声的频率为30-40kHz，功率为500-800W，所述真空的真空度>9.8×10-4Pa。
10.权利要求1-5任一项所述介孔微球或权利要求6-9任一项所述介孔微球制备方法制备的介孔微球在荧光分析领域的应用。
11.一种荧光编码微球，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述介孔微球或权利要求6-9任一项所述介孔微球制备方法制备的介孔微球，还包括连接在所述介孔微球外表面的生物识别分子。
12.权利要求1-5任一项所述介孔微球或权利要求6-9任一项所述介孔微球制备方法制备的介孔微球或权利要求11所述荧光编码磁珠在流式细胞分析领域或液相芯片检测领域的应用。
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