CN110174362A - 一种检测中性糖和酸性糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种检测中性糖和酸性糖含量的方法，先采用间羟基联苯法处理样品溶液，再利用紫外可见光谱仪进行检测后，最后利用PLS多变量分析样品溶液中中性糖和酸性糖含量；包括如下步骤：1)配制硫酸硼砂溶液；2)配制间羟基联苯溶液；3)配制样品溶液；4)紫外可见光谱检测吸光度；5)PLS多变量计算；特别之处在于：所述PLS多变量计算是先于300‑700nm处测试混合溶液，每隔0.5nm采集一次数据后，经PLS多变量校正制成标准曲线，然后在将步骤4)的测试结果带入标准曲线中进行酸性糖和中性糖的预测，本发明开发了一种能够同时检测中性糖和酸性糖浓度的方法，还能改善测定结果的准确度，减小了平均相对误差。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种检测中性糖和酸性糖含量的方法。
背景技术
随着生物技术的发展，混合糖组分检测方法的研究愈发重要，按照化学性质，可分为中性糖和酸性糖，由于组分性质的不同，使组分的分析条件也不同，增加了其分析测定的难度，并且酸性糖与中性糖两种组分会相互干扰而影响到实验准确性。
在文献《植物多糖中糖醛酸和中性糖分析检测方法的研究进展》(陈辉等人于2011年发表)中提出马云翔等采用3，5-二甲方酚为显色剂、参比波长为400nm和测定波长为450nm的测定方法，测定了不同豆类中非淀粉多糖中糖醛酸的含量，并且消除了中性单糖和木质素等干扰，使糖醛酸测定的准确度大大的提高。王远红等运用硫酸-咔唑法测定梅花参多糖中糖醛酸的含量，结果精密度比较良好，并且硫酸-间羟联苯法特异性更强。用以上两种方法分析糖醛酸时，中性单糖也会产生一定的紫外吸收，会影响到糖醛酸的定量检测的准确性。
另外，硫酸-咔唑法随着杂质性糖浓度的增大其吸收度也增大，说明中性糖与咔唑也发生反应，因而这种方法检测的糖醛酸含量测定结果偏离理论值较大，并且咔唑有剧毒，不适宜常用。
加之，现有光谱法检测物质的方法为了避免混合物中其他物质对检测造成干扰，进而选择特异性强的显色剂，如对中性糖特异性强的显色剂(苯酚、蒽酮等)，对酸性糖特异性强的显色剂(如间羟基联苯)，但显色剂易于其他物质发生反应，进而也会造成检测干扰以及健康危害。
目前，还没有文献公开一种高效、精确度高且能同时检测中性糖和酸性糖的技术方案。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种检测中性糖和酸性糖含量的方法。
具体通过以下技术方案实现：
一种检测中性糖和酸性糖含量的方法，先采用间羟基联苯法处理样品溶液，再利用紫外可见光谱仪进行检测后，最后利用PLS多变量分析样品溶液中中性糖和酸性糖含量；包括如下步骤：1)配制硫酸硼砂溶液；2)配制间羟基联苯溶液；3)配制样品溶液；4)紫外可见光谱检测吸光度；5)PLS多变量计算；特别之处在于：所述PLS多变量计算是先于300-700nm处测试混合溶液，每隔0.5nm采集一次数据后，经PLS多变量校正制成标准曲线，然后在将步骤4)的测试结果带入标准曲线中进行酸性糖和中性糖的预测。
所述配制硼砂硫酸是将硼砂溶于浓硫酸中配制成浓度为12.5mmol/L的硼砂硫酸溶液。
所述配制间羟基联苯溶液是将MHDP溶于0.5％的氢氧化钠中配制成质量浓度为0.15％的溶液。
所述样品溶液是将样品溶液和硼砂硫酸溶液按体积比1：(5.5-6.5)，涡旋混合后，放入沸水浴恒温反应，再置于冰水浴中冷却至室温，再加入间羟基联苯溶液，涡旋混合均匀，放置。
所述沸水浴恒温反应的时间为8-10min。
所述放置时间为18-20min。
所述PLS多变量校正由以下参数来确定：均方根误差(RMSE)；交叉检验均方根误差(RMSECV)；校正集相关系数(Rc 2)；预测集相关系数(Rp 2)。
所述标准曲线为Y＝K*X，K为系数矩阵，X为光谱检测值。
所述标准曲线的获取方法，包括如下步骤：
①配制储备液：制备0.5g/L的葡萄糖储备液和0.5g/L的葡萄糖醛酸储备液待用；
②配制标准溶液：用储备液配置一系列的从20μg/mL到100μg/mL的葡萄糖标准溶液及10μg/mL到50μg/mL的葡萄糖醛酸标准溶液；
③配制混合溶液：用标准溶液配制二元混合溶液，且保证葡萄糖浓度在20-100μg/mL范围内，葡萄糖醛酸浓度在10-50μg/mL范围内；
④用紫外可见光谱仪对混合溶液进行采集，波长范围为300-700nm，每隔0.5nm采集一次，每份测试品扫描3次并求均值，得到光谱矩阵X，矩阵为m*n＝25*400；
⑤计算系数矩阵K：利用二元混合溶液Y值如表1所示，矩阵为25*2和矩阵X进行PLS拟合，推导出系数矩阵K。
表1全因子设计(52)的25个二元混合溶液
进一步优选，所述波长范围为300-700nm。
有益效果：
本发明基于间羟基联苯紫外可见分光光度法的测定多糖的原理，结合化学计量学的多元校正方法—偏最小二乘回归(PLS)算法，开发了一种能够同时检测中性糖和酸性糖浓度的方法，还能改善测定结果的准确度，减小了平均相对误差。
附图说明
图1：间羟基联苯法的紫外可见光谱扫描曲线(a为50μg/mL葡萄糖醛酸溶液；b为50μg/mL葡萄糖溶液；c为葡萄糖醛酸和葡萄糖的混合溶液)；
图2：间羟基联苯法的校正集和预测集的PCA分析；
图3：间羟基联苯法的RMSECV VS因子数(a为中性糖；b为酸性糖)；
图4：蒽酮-硫酸法的校正集和预测集的PCA分析；
图5：蒽酮-硫酸法的RMSECV VS因子数(a)中性糖(b)酸性糖；
图6：蒽酮-硫酸法的紫外可见光谱扫描曲线(a为50μg/mL葡萄糖醛酸溶液；b为50μg/mL葡萄糖溶液；c为葡萄糖醛酸和葡萄糖的混合溶液)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的特征和优点将显而易见。
实施例中
PLS多变量校正由以下参数来确定：均方根误差(RMSE)；交叉检验均方根误差(RMSECV)；校正集相关系数(Rc 2)；预测集相关系数(Rp 2)。
标准曲线为Y＝K*X，K为系数矩阵，X为光谱检测值。
标准曲线的获取方法，包括如下步骤：
①配制储备液：制备0.5g/L的葡萄糖储备液和0.5g/L的葡萄糖醛酸储备液待用；
②配制标准溶液：用储备液配置一系列的从20μg/mL到100μg/mL的葡萄糖标准溶液及10μg/mL到50μg/mL的葡萄糖醛酸标准溶液；
③配制混合溶液：用标准溶液配制二元混合溶液，且保证葡萄糖浓度在20-100μg/mL范围内，葡萄糖醛酸浓度在10-50μg/mL范围内；
④用紫外可见光谱仪对混合溶液进行采集，波长范围为200-800nm，每隔0.5nm采集一次，
每份测试品扫描3次并求均值，得到光谱矩阵X，矩阵为m*n＝25*400；
⑤计算系数矩阵K：利用二元混合溶液Y值如表1所示，矩阵为25*2和矩阵X进行PLS拟合，推导出系数矩阵K。实施例1
一种检测中性糖和酸性糖含量的方法，包括如下步骤：
1)配制硫酸硼砂溶液：将硼砂溶于浓硫酸中配制成浓度为12.5mmol/L的硼砂硫酸溶液；
2)配制间羟基联苯溶液：将MHDP溶于0.5％的氢氧化钠中配制成质量浓度为0.15％的溶液；
3)配制样品溶液：将0.5mL样品溶液和3mL硼砂硫酸溶液涡旋混合20s后，放入沸水浴恒温反应10min，再置于冰水浴中冷却至室温，再加入间羟基联苯溶液，涡旋混合均匀，放置20min；
4)紫外可见光谱检测吸光度；
5)PLS多变量计算：先于300-700nm处测试混合溶液，每隔0.5nm采集一次数据后，经PLS多变量校正制成标准曲线，然后在将步骤4)的测试结果带入标准曲线中进行酸性糖和中性糖的预测。
实施例2
一种检测中性糖和酸性糖含量的方法，包括如下步骤：
1)配制硫酸硼砂溶液：将硼砂溶于浓硫酸中配制成浓度为12.5mmol/L的硼砂硫酸溶液；
2)配制间羟基联苯溶液：将MHDP溶于0.5％的氢氧化钠中配制成质量浓度为0.15％的溶液；
3)配制样品溶液：将样品溶液0.5mL和硼砂硫酸溶液2.75mL涡旋混合20s后，放入沸水浴恒温反应9min，再置于冰水浴中冷却至室温，再加入间羟基联苯溶液，涡旋混合均匀，放置20min；
4)紫外可见光谱检测吸光度；
5)PLS多变量计算：先于300-700nm处测试混合溶液，每隔0.5nm采集一次数据后，经PLS多变量校正制成标准曲线，然后在将步骤4)的测试结果带入标准曲线中进行酸性糖和中性糖的预测。
实施例3
一种检测中性糖和酸性糖含量的方法，包括如下步骤：
1)配制硫酸硼砂溶液：将硼砂溶于浓硫酸中配制成浓度为12.5mmol/L的硼砂硫酸溶液；
2)配制间羟基联苯溶液：将MHDP溶于0.5％的氢氧化钠中配制成质量浓度为0.15％的溶液；
3)配制样品溶液：将样品溶液0.5mL和硼砂硫酸溶液3.25mL涡旋混合20s后，放入沸水浴恒温反应8min，再置于冰水浴中冷却至室温，再加入间羟基联苯溶液，涡旋混合均匀，放置18min；
4)紫外可见光谱检测吸光度；
5)PLS多变量计算：先于300-700nm处测试混合溶液，每隔0.5nm采集一次数据后，经PLS多变量校正制成标准曲线，然后在将步骤4)的测试结果带入标准曲线中进行酸性糖和中性糖的预测。
试验例1
本试验例采用葡萄糖标准溶液和葡萄糖醛酸标准溶液配制成多个混合溶液，然后对PLS多变量计算的准确性进行验证
1、为了识别每一种化学物质的动态线性范围，研究了每种化合物的单变量校正。一系列的葡萄糖和葡萄糖醛酸溶液用间羟基联苯法检测后，结果列于表2中：
表2单变量校正方程的相关参数
| 参数 | 葡萄糖 | 葡萄糖醛酸 |
| λ<sub>max</sub>(nm) | 320 | 520 |
| 线性范围(μg/mL) | 20-100 | 10-50 |
| 截距 | -0.0719 | 0.0464 |
| 斜率 | 0.0168 | 0.0158 |
| 相关系数(R<sup>2</sup>) | 0.9972 | 0.9989 |
2、和传统紫外可见分析方法对比
预测集的样本同样用传统的紫外可见分析法进行分析，结果和PLS模型的预测结果相对比。中性糖的含量用苯酚硫酸法来测定，间羟基联苯法用来测定酸性糖含量；
3、结果与分析
3.1吸收光谱的分析
间羟基联苯法中的反应试剂和多糖中的中性糖和酸性糖反应的紫外可见光谱特征曲线，通过葡萄糖代替中性糖，葡萄糖醛酸代替酸性糖，葡萄糖和葡萄糖醛酸的二元混合溶液代替酸性多糖溶液，按照将硼砂溶于浓硫酸中配制成浓度为12.5mmol/L的硼砂硫酸溶液。将MHDP溶于0.5％的氢氧化钠中配制成浓度为0.15％的溶液。在具塞试管中加入0.5mL样品溶液和3mL硼砂硫酸溶液，涡旋20s，后放入沸水浴恒温反应10min。然后在冰水裕中冷却至室温，加入50μL的间羟基联苯溶液，涡旋混合均匀，放置20min后在紫外可见光谱仪上扫描结果进行测定评估；反应后的光谱扫描曲线如图1所示；
从图中可看出葡萄糖反应溶液(b)的最大吸收峰在320nm；葡萄糖醛酸反应液(a)的特征峰在520nm，在320nm处也有一吸收峰，但吸光度很小；葡萄糖和葡萄糖醛酸的混合溶液的反应液的光谱(c)和葡萄糖醛酸反应液的光谱的峰型很相似，只是在320nm处的峰高不同，证明了间羟基联苯法对酸性糖的反应是专一的不受中性糖干扰，但中性糖的峰却受酸性糖影响；
3.2主成分分析
主成分分析被用来观察校正集和预测集样品反应光谱的均一性，将校正集的光谱矩阵(300-700nm)和预测集的光谱矩阵进行分解，进行特征主成分分析，后将有最大特征的两组主成分提取出，以主成分1(PC1)为横坐标，主成分2(PC2)为纵坐标画图；图2即为所画图形。从图2中可以看到，校正集比较均匀的分布在图中，并没有聚集的点；因此，所有的校正集中的样品都可以被用来建立校正模型；另外，从图2中还可以看到，校正集有两个趋势，在相同的葡萄糖浓度下，随着葡萄糖醛酸浓度的升高PC2慢慢降低；在相同的葡萄糖醛酸的浓度下，随着葡萄糖浓度的升高PC1慢慢升高。再观察校正集的点和预测集的点，发现预测集的样本点刚好都落在校正集的样本点空间内，并且和校正集一样有着相同的趋势；
3.3PLS多变量校正的建立
3.3.1最优因子数的选择
图3是以RMSECV为纵坐标，因子数为横坐标的优化因子数图；从图3中可以看到当中性糖的因子数是4时，交叉检验均方根误差(RMSECV)的数值最小，酸性糖的因子数是2时，交叉检验均方根误差(RMSECV)的数值最小。所以中性糖和酸性糖的建模的最优因子数分别选择4和2；
3.3.2校正结果
采用最优化的因子数对中性糖和酸性糖含量建模；相关的PLS模型的参数列于表3中。从表3中可以看出中性糖和酸性糖的Rc 2分别是0.9986和0.9971，RMSEC分别是1.0094和0.8514；表明校正模型的质量很好；
表3PLS多变量校正的参数
3.3.3结果确认
为了对校正结果的质量进一步确认；独立测试集(随机挑选的20个落在校正集空间内的样品)被用来验证校正模型。评估的结果在表3中；可以看到测试集的中性糖和酸性糖的RMSEP分别为1.5333和0.7774，Rp2分别为0.9952和0.9956。结果证明了所建立的校正模型是可以对二元混合体系中的中性糖和酸性糖同时测定的；
3.4对比传统的紫外可见光度法与建立的方法
独立测试集中的20个样品的中性糖和酸性糖含量同样在传统的单变量紫外可见光度法(中性糖含量用苯酚硫酸法测定，酸性糖含量用间羟基联苯法测定)下进行了测定，并和所建立的PLS模型对独立测试集所预测的值进行了对比。结果列于表4中；对比平均相对误差(ARE)，可以发现PLS模型预测的结果的ARE明显比传统的单变量紫外可见光度法的ARE要小很多；结果证明了结合了PLS的间羟基联苯紫外光度法不仅能够同时测定中性糖和酸性糖，还能改善测定结果的准确度；
表4本发明方法与单变量校正模型对中性糖和酸性糖含量的预测
注：NS:中性糖；US:酸性糖；RE:相对误差；ARE:平均相对误差
试验例2
按照上述方法，与蒽酮-硫酸体系的模型进行对比，结果如下：
1)光谱对比
对比光谱图1的上图和下图发现，间羟基联苯法(图1)的中性糖和酸性糖的最大吸收光谱相差较大，相互干扰较小；蒽酮硫酸法(图6)的中性糖和酸性糖的吸收光谱很相似,干扰较大。
2)PCA和因子数的对比
通过观察对比图2与图4，图3与图5；我们发现间羟基联苯法的模型的PCA图中的点的分布比蒽酮-硫酸法模型的点分布要更均匀更具有规律，说明在两个主成分的条件下间羟基联苯法所能包含的信息就已经足够充分了。并且优选出的中性糖模型和酸性糖模型的因子数，间羟基联苯法的分别为4和2，比蒽酮-硫酸法的8和9也要小很多，所建立的模型更为简单。
3)预测结果的对比
对比两种显色体系下的PLS模型对独立测试集的预测结果(表4和表5)可以看出间羟基联苯法体系下的预测模型对于酸性糖的预测比蒽酮-硫酸体系的预测模型的预测要更为准确,间羟基联苯模型的ARE为2.82，而蒽酮-硫酸模型的ARE为7.75。而对于中性糖的预测则相差不大。
表5蒽酮-硫酸体系PLS模型对中性糖和酸性糖含量的预测
NS:中性糖；US:酸性糖；RE:相对误差；ARE:平均相对误差
应当理解，本发明虽然已通过以上实施例进行了清楚说明，然而在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的变化和修正，但这些相应的变化和修正都应属于本发明的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测中性糖和酸性糖含量的方法，其特征在于，先采用间羟基联苯法处理样品溶液，再利用紫外可见光谱仪进行检测后，最后利用PLS多变量分析样品溶液中中性糖和酸性糖含量；包括如下步骤：1)配制硫酸硼砂溶液；2)配制间羟基联苯溶液；3)配制样品溶液；4)紫外可见光谱检测吸光度；5)PLS多变量计算；所述PLS多变量计算是先于300-700nm处测试混合溶液，每隔0.5nm采集一次数据后，经PLS多变量校正制成标准曲线，然后在将步骤4)的测试结果带入标准曲线中进行酸性糖和中性糖的预测。
2.如权利要求1所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述配制硼砂硫酸是将硼砂溶于浓硫酸中配制成浓度为12.5mmol/L的硼砂硫酸溶液。
3.如权利要求1所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述配制间羟基联苯溶液是将MHDP溶于0.5％的氢氧化钠中配制成质量浓度为0.15％的溶液。
4.如权利要求1所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述样品溶液是将样品溶液和硼砂硫酸溶液按体积比1：(5.5-6.5)，涡旋混合后，放入沸水浴恒温反应，再置于冰水浴中冷却至室温，再加入间羟基联苯溶液，涡旋混合均匀，放置。
5.如权利要求4所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述沸水浴恒温反应的时间为8-10min。
6.如权利要求4所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述放置时间为18-20min。
7.如权利要求1所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述PLS多变量校正由以下参数来确定：均方根误差(RMSE)；交叉检验均方根误差(RMSECV)；校正集相关系数(Rc 2)；预测集相关系数(Rp 2)。
8.如权利要求1所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述标准曲线为Y＝K*X，K为系数矩阵，X为光谱检测值。
9.如权利要求1或8所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述标准曲线的获取方法，包括如下步骤：
①配制储备液：制备0.5g/L的葡萄糖储备液和0.5g/L的葡萄糖醛酸储备液待用；
②配制标准溶液：用储备液配置一系列的从20μg/mL到100μg/mL的葡萄糖标准溶液及10μg/mL到50μg/mL的葡萄糖醛酸标准溶液；
③配制混合溶液：用标准溶液配制二元混合溶液，且保证葡萄糖浓度在20-100μg/mL范围内，葡萄糖醛酸浓度在10-50μg/mL范围内；
④用紫外可见光谱仪对混合溶液进行采集，波长范围为300-700nm，每隔0.5nm采集一次，每份测试品扫描3次并求均值，得到光谱矩阵X，矩阵为m*n＝25*400；
⑤计算系数矩阵K：利用二元混合溶液Y值如表1所示，矩阵为25*2和矩阵X进行PLS拟合，推导出系数矩阵K。
10.如权利要求9所述的检测中性糖和酸性糖含量的方法，所述波长范围为300-700nm。
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