CN107976413A - 一种玉米须多糖中糖醛酸含量的测定方法及其抗氧化作用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于间羟基联苯法测定玉米须多糖中糖醛酸含量的测定方法，步骤如下：精密称取玉米须多糖0.0500 g，于50 mL容量瓶中，以蒸馏水溶解稀释至刻度，摇匀，配成1 mg/mL的多糖溶液。称取0.477 g硼砂加入浓硫酸100 mL超声溶解。称取间羟基联苯0.15 g，用0.5%氢氧化钠溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。精密移取1 mg/mL玉米须多糖溶液0.5 mL至10 mL容量瓶中，缓慢加入5 mL硫酸‑硼砂溶液，摇匀后，至沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温后，加入0.15%间羟基联苯溶液80 μL，混匀，静置30min。用蒸馏水做空白液调零，用紫外分光光度仪于528nm处测定其吸收值；以半乳糖醛酸溶液为标准液，绘制标准曲线，将多糖的吸收值代入标准曲线中计算糖醛酸含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖中糖醛酸含量的测定方法，具体涉及一种基于间羟基联苯法测定多糖中糖醛酸含量的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
糖醛酸又名透明质酸，是一种酸性粘多糖，它是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，广泛分布于人体各部位，其中皮肤也含有大量的糖醛酸，人类皮肤成熟和老化过程也随着糖醛酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。
多糖中糖醛酸的测定方法有两种：一种是咔唑-硫酸法；另一种是间羟基联苯法。
在硫酸咔唑比色法中，由于待测溶液中一般也存在中性单糖、戊糖和己糖与糖醛酸的吸收波长相同，会使糖醛酸的测定值偏离实际含量，会对测量结果造成较大的误差。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多糖中糖醛酸含量的测定方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案，其特征在于，包括以下步骤：
（1）精密称取玉米须多糖（含量91.86ug/mg）0.0500 g，于50 mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀，离心，配成1 mg/mL的多糖溶液；
（2）称取0.477 g硼砂加入浓硫酸100 mL超声溶解；
（3）称取间羟基联苯0.15 g，用0.5%氢氧化钠溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中；
（4）精密移取1 mg/mL玉米须多糖溶液0.5 mL至于10 mL容量瓶中，缓慢加入5 mL硫酸-硼砂溶液，摇匀后，至沸水浴中煮沸5min，冷却5min至室温后，加入0.15%间羟基联苯溶液80μL，混匀，静置20 min。用蒸馏水做空白液调零，在紫外分光光度仪中于528nm出测定其吸收值；
（5）以半乳糖醛酸溶液为标准液，绘制标准曲线；
（6）将多糖的吸收值代入标准曲线中计算糖醛酸含量。
根据上述的基于玉米须多糖中糖醛酸含量测定的方法，其特征在于，所述浓硫酸浓度为98%。
根据上述的基于玉米须多糖中糖醛酸含量测定的方法，其特征在于，在步骤（1）中，多糖离心速度为3000 r/min，离心时间为10 min。
根据上述的基于玉米须多糖中糖醛酸含量测定的方法，其特征在于，在步骤（4）中，沸水浴时间为5 min，冷却5min至室温后，反应完成后再进行20min冷却处理。
本发明的有益之处在于：本发明基于间羟基联苯定量测定多糖中糖醛酸含量的原理，多聚己糖醛酸与含四硼酸钠的硫酸溶液在高温作用下水解，水解产物进一步与糖醛酸含量呈线性关系，可通过比色法对糖醛酸含量进行计算。
采用本发明的测定方法可以很快的测出多糖中糖醛酸的含量，省去很多麻烦，该方法具有简便易行、准确性高、重现性好、测定误差小的特点，可用于其他种类多糖中的糖醛酸含量测定。
附图说明
图1是半乳糖醛酸和玉米须多糖的紫外扫描图谱；图2是不同浓度玉米须多糖、木耳多糖和Vc对羟基自由基的清除率图；图3是Vc的总还原力图；图4是玉米须多糖和木耳多糖的总还原力图；图5是玉米须多糖和木耳多糖对DPPH自由基的清除率图；图6是Vc对DPPH自由基的清除率图；图7是超氧阴离子自由基的清除率图。
具体实施方式
以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍。
精密称取70℃干燥至恒重的半乳糖醛酸对照品4mg置于50mL容量瓶中，以蒸馏水溶解定容，配成80μg/mL的对照品溶液。
精密称取同样条件下的玉米须多糖0.0500g，置于50mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀，离心（10 min，3000r/min），配成1mg/mL的多糖溶液；用同样的方法配制1 mg/mL的木耳多糖溶液。
称取0.477 g硼砂加入浓硫酸100 mL超声溶解，备用。
称取间羟基联苯0.15 g，用0.5%氢氧化钠溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。
精密移取80 μg/mL半乳糖醛酸0.5 mL至于10 mL容量瓶中，缓慢加入5 mL硫酸-硼砂溶液，摇匀后，至沸水浴中煮沸5 min，冷却5min至室温后，加入0.15%间羟基联苯溶液80μL，混匀，静置20 min；蒸馏水同上操作制得空白液调零，在400-800 nm波长扫描，结果如说明书附图1所示。
由说明书附图1可知对照品和供试品溶液在528 nm处有最大吸收波长；玉米须多糖溶液稀释到0.2 mg/mL时，目测出最低检测限。
分别精密吸取半乳糖醛酸对照品溶液 2、4、6、8、10 mL于5个10mL容量瓶中，加蒸馏水定容；取系列浓度半乳糖醛酸标准溶液1 mL，缓慢加入5mL硫酸-硼砂溶液，摇匀后，至沸水浴中煮沸5min，冷却5min至室温后，加入0.15%间羟基联苯溶液80μL，混匀，静置20min；在528nm处测定其吸光度值。
以半乳糖醛酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y =0.009x + 0.0761，R2 =0.9991。
精密度试验
取对照溶液在相同的操作条件下，连续操作6次，结果如表1：
表1 精密度实验数据表
表1 精密度实验数据表
| 实验编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD（%） |
| 吸光度 | 0.623 | 0.614 | 0.599 | 0.607 | 0.591 | 0.610 | 0.607 | 1.86 |
RSD为1.86%<3.0%，符合测定紫外分光光度计的要求，表明仪器精密度良好。
稳定性考察
为使分析方法可用于常规检验所规定得时间，以确保方法可行，在2.5操作条件下，进行一系列稳定性实验，结果如表2:
表2 稳定性实验数据表
| 时间min | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 80 | 平均值 | RSD（%） |
| 吸光度 | 0.586 | 0.604 | 0.615 | 0.601 | 0.596 | 0.589 | 0.598 | 1.77 |
RSD为1.77%<3.0%，表明溶液在80 min内显色稳定，可进行测定。
重复性试验
用规定的方法平行测定样本5份，结果如表3:
表3 重复性实验数据表
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD（%） |
| 吸光度 | 0.523 | 0.514 | 0.532 | 0.542 | 0.534 | 0.529 | 1.90 |
RSD为1.90%<3.0%，符合重现性的要求范围。
加样回收率试验
为考察其它成分对测定的干扰，分别用硫酸-咔唑法与间羟基联苯法测定其加样回收率，结果见表4:
表4 硫酸-咔唑法和间羟基联苯法加样回收率试验(n=5)
从结果可以看出，间羟基联苯法的测定结果与半乳糖醛酸的理论值基本一致，而硫酸咔唑法的测定结果明显高于理论值，误差较大，因此选择采用间羟基联苯法测定玉米须多糖中糖醛酸的的含量。
测定玉米须多糖中糖醛酸的含量
吸取1mg/mL的玉米须多糖溶液1mL，缓慢加入5 mL硫酸-硼砂溶液，摇匀后，至沸水浴中煮沸5min，冷却5min至室温后，加入0.15%间羟基联苯溶液80μL，混匀，静置20min。在528nm处测定其吸光度值0.609，根据标准曲线的得出待测多糖溶液中的糖醛酸浓度为59.21μg/mL。
结果计算，待测多糖溶液中的糖醛酸含量，计算公式如下：
X=（C*N1*V1）/(m1*1000)*100%
式中，X代表待测中多糖的含量；
C代表待测液中多糖的质量浓度，单位mg/mL；
N1代表测定多糖含量时对样品溶液的稀释倍数；
V1代表样品溶液的体积，单位mL；
m1代表玉米须多糖的取样质量，单位g。
计算得出玉米须多糖中糖醛酸含量为5.92%。
清除羟基自由基能力的测定
取2.0 mmol/L 邻二氮菲40 μL 于酶标仪板中，依次加入PBS（pH 7.40）40 μL，蒸馏水20 μL，充分混匀后，加入0.75 mmol/L 硫酸亚铁20 μL，混匀，加质量分数为0.12%的H2O2 20μL，于37 ℃恒温箱中保存60 min，在505 nm 处测定其吸光度A p 值；用蒸馏水代替H2O2，测定其吸光度A b 值；取0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的玉米须多糖和木耳多糖溶液代替蒸馏水20 μL，测定其吸光度A s值，并用同浓度梯度的Vc代替多糖溶液作阳性对照，清除率（%）=（As-Ap）/（Ab-Ap）×100% 。
由公式计算出不同浓度玉米须多糖、木耳多糖和Vc对羟基自由基的清除率，结果如说明书附图2所示。
由说明书附图2可以看出，三者对羟基自由基清除率随着浓度的增加而升高，但在同浓度下玉米须多糖的清除率要高于木耳多糖的清除率；计算得出玉米须多糖对羟基自由基的IC50为0.99 mg/mL，木耳多糖对羟基自由基的IC50为1.11 mg/mL，Vc对羟基自由基的IC50为0.26 mg/mL。
总还原能力的测定
依次在10支10 mL 试管中加入0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0 mg/mL的玉米须多糖和木耳多糖溶液1.0 mL，磷酸盐缓冲溶液（pH=6.6）2.5 mL 和1%铁氰化钾2.5 mL，置于50 ℃水浴中反应20 min，加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混匀后以3000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化铁溶液0.5 mL和2.5 mL 的蒸馏水，摇匀后在700 nm 处测定吸光值，平行测定3次取平均值，并用0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL的Vc代替多糖溶液作阳性对照。
试验结果如说明书附图3，4所示。
由说明书附图3，4可以看出，三者的总还原力随着浓度的增加而逐渐升高，且玉米须多糖的还原力要高于木耳多糖，但两种多糖的还原力都比Vc的要低。
清除DPPH自由基能力测定
取0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的玉米须多糖和木耳多糖溶液100 μL于酶标仪板中，加入等体积浓度为0.5 mmol/L的DPPH溶液（用无水乙醇配制），混匀后在室温下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度Ai。取上述浓度梯度的玉米须多糖溶液100 μL加上等体积无水乙醇，在517 nm处测定吸光度Aj，平行测定3次取平均值。空白对照组为100 μL DPPH溶液加上等体积无水乙醇，在517 nm处测定吸光值为Ao，并用0.02mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的Vc代替多糖溶液作阳性对照，清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/Ao]×100%。
由公式计算出不同浓度三者对DPPH自由基的清除率，结果如说明书附图5、6所示。
由说明书附图5，6可以看出，三者对DPPH自由基清除率随着浓度的增加而升高，但在同浓度下玉米须多糖的清除率要高于木耳多糖的清除率；计算得出玉米须多糖对DPPH自由基的IC50为0.44 mg/mL，木耳多糖对DPPH自由基的IC50为1.85 mg/mL，Vc对DPPH自由基的IC50为0.044 mg/mL。
清除超氧阴离子自由基能力的测定
取50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液200 μL于25℃恒温箱中预热20 min后，分别加20 μL浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的玉米须多糖和木耳多糖溶液和20μL邻苯三酚，在25℃条件下反应5 min，在325 nm处测定其Ai；取50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液200 μL于25℃恒温箱中预热20 min后，加20μL玉米须多糖和木耳多糖溶液和20 μL 10 mmol/L盐酸，在25℃条件下反应5 min，在325 nm处测定其Aj；取50 mmol/LTris-HCl缓冲溶液200 μL与25℃恒温箱中预热20 min后，加20 μL蒸馏水和20 μL邻苯三酚，在25℃条件下反应5 min，在325 nm处测定其Ao，并用同浓度梯度的Vc代替多糖溶液作阳性对照，清除率（%）=[Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100%。
由公式计算出不同浓度三者对超氧阴离子自由基的清除率，结果如说明书附图7所示。由说明书附图7可以看出，三者对超氧阴离子自由基清除率随着浓度的增加而升高，但在同浓度下玉米须多糖的清除率要高于木耳多糖的清除率；计算得出玉米须多糖对超氧阴离子自由基的IC50为6.05 mg/mL，木耳多糖对超氧阴离子自由基的IC50为6.20 mg/mL，Vc对超氧阴离子自由基的IC50为0.54 mg/mL。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.基于玉米须多糖中糖醛酸含量测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）精密称取玉米须多糖0.0500 g，于50 mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀，离心，配成1 mg/mL的多糖溶液；
（2）称取0.477 g硼砂加入浓硫酸100 mL超声溶解；
（3）称取间羟基联苯0.15 g，用0.5%氢氧化钠溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中；
（4）精密移取1 mg/mL玉米须多糖溶液0.5 mL至于10 mL容量瓶中，缓慢加入5 mL硫酸-硼砂溶液，摇匀后，至沸水浴中煮沸，冷却至室温后，加入0.15%间羟基联苯溶液80 μL，混匀，静置30 min；
用蒸馏水做空白液调零，在紫外分光光度仪中于528nm出测定其吸收值；
（5）以半乳糖醛酸溶液为标准液，绘制标准曲线；
（6）将多糖的吸收值代入标准曲线中计算糖醛酸含量。
2.根据权利要求1所述的基于玉米须多糖中糖醛酸含量测定的方法，其特征在于，所述浓硫酸浓度为98%。
3.根据权利要求2所述的基于玉米须多糖中糖醛酸含量测定的方法，其特征在于，在步骤（1）中，多糖离心速度为3000 r/min，离心时间为10 min。
4.根据权利要求3所述的基于玉米须多糖中糖醛酸含量测定的方法，其特征在于，在步骤（4）中，沸水浴时间为5 min，反应完成后再进行5 min冷却处理。
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| CN201710947006.3A CN107976413A (zh) | 2017-10-12 | 2017-10-12 | 一种玉米须多糖中糖醛酸含量的测定方法及其抗氧化作用 |
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| CN110174362A (zh) * | 2019-05-05 | 2019-08-27 | 贵州中烟工业有限责任公司 | 一种检测中性糖和酸性糖含量的方法 |
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Non-Patent Citations (2)
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN110174362B (zh) * | 2019-05-05 | 2024-05-03 | 贵州中烟工业有限责任公司 | 一种检测中性糖和酸性糖含量的方法 |
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