CN101231270A - 清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法或其它分析方法测定其中各指标成分的含量，采用紫外分光光度法对稀释后的样品进行全波长扫描；将样品分为两部分：校正集和验证集，根据校正集样品的紫外光谱数据及含量，采用化学计量学方法对数据进行处理，利用TQAnalyst软件和Matlab6.5软件建立数学模型，将验证集样品的紫外光谱数据代入数学模型，比较预测值与真值，验证该技术的准确可靠。本发明的方法可用于银黄液中绿原酸及黄芩苷的含量测定，四混液中栀子苷和总氮的含量测定，可用于对以上成分含量的快速在线检测；可用于清开灵注射液中间体及成品的含量测定及快速在线检测。

Description

清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法

技术领域

本发明涉及清开灵注射液生产过程中间体及成品中指标成分含量的快速测定方法，更具体地说，涉及银黄液中绿原酸和黄芩苷含量的紫外光谱测定方法，四混液中栀子苷和总氮的含量的紫外光谱测定方法，涉及到对清开灵注射液生产过程中间体-银黄液中绿原酸及黄芩苷含量的测定方法或对该中间体银黄液中绿原酸及黄芩苷含量的在线检测方法，涉及到对清开灵注射液生产过程中间体四混液中栀子苷和总氮的含量的在线检测方法。

背景技术

清开灵注射液是由古方安宫牛黄丸经拆方研制而成的一种现代中药注射剂，其处方由胆酸、猪去氧胆酸、珍珠母、板蓝根、水牛角、黄芩苷、栀子、金银花八味药组成，具有清热解毒、清营凉血、泻火除烦、化痰通络、镇惊安神、醒神开窍的功能。清开灵注射液中间体及成品中的指标成分包括总氮、黄芩苷、栀子苷、胆酸、猪去氧胆酸和绿原酸。银黄液是清开灵注射液生产过程中间体之一，是由金银花提取液与黄芩苷水溶液按照一定比例混合而成。目前，相关规定及报导中多采用凯氏定氮法测定清开灵注射液成品中的总氮含量，采用高效液相色谱法测定成品中其它指标成分：例如绿原酸和黄芩苷的含量，但未见对生产过程中间体中的指标成分：绿原酸和黄芩苷进行检测，并且这些方法检测时间长，不适于中药制剂生产过程的在线质量控制。

发明内容

为了克服现有的检测方法费时的缺点，实现清开灵注射液生产过程中间体及成品中的指标成分的在线检测，本发明采用紫外光谱法结合化学计量学例如偏最小二乘法进行分析和数据处理，不仅快速方便，而且准确可靠。

本发明的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法，通过下述技术方案予以实现：

清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法及其它分析方法(如凯氏定氮法)测定清开灵注射液中间体及成品中指标成分的含量，并采用紫外分光光度法对稀释后的样品进行全波长扫描；将样品分为两部分，即校正集和验证集，根据校正集样品的紫外光谱数据及含量，采用化学计量学方法对数据进行处理，并利用TQ Analyst软件和Matlab6.5软件建立数学模型，再将验证集样品的紫外光谱数据代入数学模型，比较预测值与真值，验证该技术的准确可靠。

如以上所述的方法，其特征在于：所述的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法是指：

银黄液中绿原酸及黄芩苷的含量的测定方法，是采用反相高效液相色谱法测定银黄液样品中绿原酸和黄芩苷的含量，并采用紫外光谱-化学计量学方法中的偏最小二乘法进行分析和数据处理；

上述银黄液紫外光谱的测定是指：采用HP-8453紫外-可见分光光度仪，将银黄液样品稀释2000倍，在190～400nm进行扫描，扫描间隔1nm；

上述采用紫外光谱-偏最小二乘法进行分析和数据处理是指：

采用紫外分光光度法对稀释2000倍的银黄液样品进行全波长扫描，将银黄液样品分为两部分，即校正集和验证集，根据校正集样品的紫外光谱数据及含量，采用偏最小二乘并利用TQ Analyst软件和Matlab 6.5软件建立数学模型，再将验证集样品的紫外光谱数据代入数学模型，比较预测值与真值，验证该技术的准确可靠；

上述运用TQ Analyst软件是指，分别采用逐步多元线形回归、主成分回归和偏最小二乘法进行数据处理，建立UV预测模型，并对模型进行检验，比较结果。

如以上所述的方法，其中上述采用TQ Analyst软件进行数据处理，是以偏最小二乘PLS为例，说明以下数据处理过程的：

打开TQ Analyst软件，看操作界面，在标签栏可以看到：“Description”、“Pathlength”、“Component”等标签；

在“Description”标签下，选择定量方法为PLS，并为该分析方法加标题及相关信息；

在“Pathlength”标签下，选择光程类型constant，固体样品则选择MSC或SNV；

在“component”标签下，填写样品中待测组分信息，包括组分名称、缩写、单位、测量精度；

待测组分为绿原酸和黄芩苷，含量单位为mg·mL^-1，测量精度到小数点后4位，并定义分析范围，绿原酸含量范围是0～1mg·mL^-1，黄芩苷含量范围是20～45mg·mL^-1；

在“Standards”标签下，点击“Open Standard”，选择用于建模的样品的UV光谱，常见文件格式有.spa和.csv，填写各样品中组分含量；

通过点击“Usage”下拉框可以为样品选择类别：Calibration或Validation；

将“Allow spectral processing”选中，则在“Standard”标签后出现新标签“Spectra”；

在“Spectra”标签下，选择光谱预处理方法：包括是否需要背景校正、导数变换或平滑处理；

在“Regions”标签下，选择用于建模的光谱范围，并根据模型预测结果对光谱范围进行优化；筛选的波长范围为271～346nm；

在“Other”标签下，选择数据是否进行标准化处理及方法；调整因子数，因子数由校正集交叉验证均方差(RMSECV)或预报残差平方和(PRESS)来确定；

点击标签栏上方的“Calibrate”按钮，即可出现绿原酸含量建模结果的界面；

界面中的左图为模型计算值与HPLC测定结果的相关图，图中的两个数据分别是校正集样品绿原酸含量的计算值与真值的相关系数(R)和均方根误差(RMSEC)，R越大，RMSEC越小，模型拟合能力越好；右图为偏差图，图下方的两个数据分别是验证集样品绿原酸含量的计算值与真值的均方根误差(RMSEP)和因子数，RMSEP越小，模型预测能力越强；

表格中显示了每个样品中绿原酸含量的计算值、真值及偏差；

点击表右侧的“next”或“back”按钮，则会翻到黄芩苷含量建模结果的界面；

点击菜单栏中的“Diagnostics”，选择该菜单中的“PRESS”项：对校正集采用交叉验证法，通常选择留一法，计算不同因子数时的PRESS和RMSECV；

当因子数为6时，绿原酸含量的RMSECV最小，因此在建立绿原酸含量的UV-PLS模型时因子数取6；

点击“nest”或“back”按钮，翻到黄芩苷含量的PRESS界面，同理选择了建立黄芩苷含量的UV-PLS模型时的因子数6。

如以上所述的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法，所述的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法是指四混液中栀子苷和总氮的含量的测定方法，上述四混液中栀子苷和总氮的含量测定方法，

所用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱仪，包括：四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器、HP数据处理工作站，KDY型定氮仪；

所用试药为：栀子苷对照品购自中国药品生物制品鉴定所，四混液由指定药厂提供，乙腈为色谱纯；

所用方法为：色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(13∶87)；流速1.0mL·min^-1；检测波长238nm；柱温30℃，其中总氮的含量测定按常规方法进行；

其中四混液紫外光谱的测定方法如下：

所用仪器为：HP-8453紫外-可见分光光度仪；

具体步骤为：将四混液样品稀释500倍，在190～400nm进行扫描，扫描间隔1nm，得到四混液紫外光谱图；

接着进行数据处理：

运用TQ Analyst软件，分别采用逐步多元线性回归、主成分回归和偏最小二乘法对四混液的高效液相色谱及凯氏定氮测定结果和紫外光谱数据进行分析，筛选最佳建模方法；

运用Matlab 6.5软件，计算模型中的参数，建立紫外光谱法含量预测模型，并对模型进行检验，比较结果；将四混液样品：样本数为32，分为校正集：样本数为24，和验证集：样本数为8两部分，并使校正集和验证集样品中的总氮和栀子苷含量较均匀的分布，并且验证集的含量范围应涵盖在校正集的含量范围内。

如以上所述的方法，其特征在于：对清开灵注射液中间体之一：四混液中的栀子苷和总氮含量进行快速测定，是先将待测四混液样品稀释500倍，测定样品的紫外光谱，接着对光谱数据进行7点三次平滑处理，将平滑处理后的数据代入栀子苷和总氮的UV-SMLR定量模型。

如以上所述的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法，所述的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法是指四混液中栀子苷和总氮的含量的测定方法，上述四混液中栀子苷和总氮的含量测定方法：

所用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱仪，包括：四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器、HP数据处理工作站，KDY型定氮仪；

所用试药为：栀子苷对照品购自中国药品生物制品鉴定所，四混液由指定药厂提供，乙腈为色谱纯；

所用方法为：色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(13∶87)；流速1.0mL·min^-1；检测波长238nm；柱温30℃，其中总氮的含量测定按常规方法进行；

其中四混液紫外光谱的测定方法如下：

所用仪器为：HP-8453紫外-可见分光光度仪；

具体步骤为：将四混液样品稀释500倍，在190～400nm进行扫描，扫描间隔1nm，得到四混液紫外光谱图；

接着进行数据处理：

运用TQ Analyst软件，分别采用逐步多元线性回归、主成分回归和偏最小二乘法对四混液的高效液相色谱及凯氏定氮测定结果和紫外光谱数据进行分析，筛选最佳建模方法；

运用Matlab 6.5软件，计算模型中的参数，建立紫外光谱法含量预测模型，并对模型进行检验，比较结果；将四混液样品：样本数为32，分为校正集：样本数为24，和验证集：样本数为8两部分，并使校正集和验证集样品中的总氮和栀子苷含量较均匀的分布，并且验证集的含量范围应涵盖在校正集的含量范围内。

如以上所述的方法，其特征在于：对清开灵注射液中间体之一：四混液中的栀子苷和总氮含量进行快速测定，是先将待测四混液样品稀释500倍，测定样品的紫外光谱，接着对光谱数据进行7点三次平滑处理，将平滑处理后的数据代入栀子苷和总氮的UV-SMLR定量模型，计算该样品中栀子苷和总氮的含量。

如以上所述的方法，其特征在于：该方法用于清开灵注射液生产过程中银黄液样品中的绿原酸和黄芩苷的含量的测定。

如以上所述的方法，其特征在于：该方法用于清开灵注射液生产过程中银黄液样品中的绿原酸和黄芩苷的含量的在线检测。

如以上所述的方法，其特征在于：该方法用于清开灵注射液生产过程中四混液中栀子苷和总氮的含量的在线检测。

如以上所述的方法，其特征在于：Matlab 6.5软件建立数学模型是指：运用Matlab 6.5软件，将校正集样品紫外原始光谱数据与高效液相色谱数据代入偏最小二乘PLS程序，计算得到建模参数P、Q和B，从而建立了银黄液的UV-PLS定量模型。

如以上所述的方法，其特征在于：运用Matlab 6.5软件建立数学模型是指：将校正集样品筛选波长下的紫外原始光谱数据与高效液相色谱及凯氏定氮测试数据代入多元线性回归程序，计算得到建模参数，包括偏回归系数β₁，β₂，β₃和常数项β₀，从而建立了四混液的UV-SLMR定量模型。

如以上所述的方法，其特征在于：采用反相高效液相色谱法测定银黄液样品中绿原酸和黄芩苷的含量，是指：

1)采用高效液相色谱仪，上述高效液相色谱仪包括：四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器、HP数据处理工作站；

2)色谱条件：

绿原酸：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱：4.6×250mm，5μm；流动相：甲醇：0.1％甲酸的混合体积比＝25∶75；流速1.0mL·min^-1；检测波长330nm；柱温30℃；

黄芩苷：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱：4.6×250mm，5μm；流动相：甲醇：0.1％甲酸的混合体积比＝60∶40；流速1.0mL·mi^-1；检测波长280nm；柱温30℃；测定银黄液样品中绿原酸和黄芩苷的含量。

如以上所述的方法，其特征在于：银黄液紫外光谱的测定是指：采用HP-8453紫外-可见分光光度仪，该仪器由美国Agilent公司生产，将银黄液样品稀释2000倍，在190～400nm进行扫描，扫描间隔1nm。

如以上所述的方法，其特征在于：上述数据处理是指：运用TQ Analyst软件(美国Thermo Nicolet公司)，分别采用逐步多元线形回归、主成分回归和偏最小二乘法对银黄液的高效液相色谱测定结果和紫外光谱数据进行分析，筛选最佳建模方法；运用Matlab 6.5软件(美国The Math Works公司)计算模型中的参数，建立紫外光谱法含量预测模型，并对模型进行检验，比较结果。

如以上所述的方法，其特征在于：采用TQ Analyst软件进行数据处理，是以PLS为例，说明以下数据处理过程的：

打开TQ Analyst软件，看操作界面，在标签栏可以看到：“Description”、“Pathlength”、“Component”等标签；

在“Description”标签下，选择定量方法为PLS，并为该分析方法加标题及相关信息；

在“Pathlength”标签下，选择光程类型cons tant，固体样品则选择MSC或SNV；

在“component”标签下，填写样品中待测组分信息，包括组分名称、缩写、单位、测量精度；本例中待测组分为绿原酸和黄芩苷，含量单位为mg·mL^-1，测量精度到小数点后4位，并定义分析范围，本例中绿原酸含量范围是0～1mg·mL^-1，黄芩苷含量范围是20～45mg·mL^-1；

在“Standards”标签下，点击“Open Standard”，选择用于建模的样品的UV光谱，常见文件格式有.spa和.csv，填写各样品中组分含量；通过点击“Usage”下拉框为样品选择类别：Calibration或Validation；将“Allowspectral processing”选中，则在“Standard”标签后出现新标签“Spectra”；

在“Spectra”标签下，选择光谱预处理方法：包括是否需要背景校正、导数变换或平滑处理；本例中未对光谱进行背景校正、导数变换和平滑处理；

在“Regions”标签下，选择用于建模的光谱范围，并根据模型预测结果对光谱范围进行优化；筛选的波长范围为271～346nm；

在“Other”标签下，选择数据是否进行标准化处理及处理方法；调整因子数，因子数由校正集交叉验证均方差(RMSECV)或预报残差平方和(PRESS)来确定；

点击标签栏上方的“Calibrate”按钮，即可出现绿原酸含量建模结果的界面；界面中的左图为模型计算值与HPLC测定结果的相关图，图中的两个数据分别是校正集样品绿原酸含量的计算值与真值的相关系数(R)和均方根误差(RMSEC)，R越大，RMSEC越小，模型拟合能力越好；右图为偏差图，图下方的两个数据分别是验证集样品绿原酸含量的计算值与真值的均方根误差(RMSEP)和因子数，RMSEP越小，模型预测能力越强；表格中显示了每个样品中绿原酸含量的计算值、真值及偏差；点击表右侧的“next”或“back”按钮，则会翻到黄芩苷含量建模结果的界面；

点击菜单栏中的“Diagnostics”，选择该菜单中的“PRESS”项：对校正集采用交叉验证法，通常选择留一法，计算不同因子数时的PRESS和RMSECV；当因子数为6时，绿原酸含量的RMSECV最小，因此在建立绿原酸含量的UV-PLS模型时因子数取6；点击“nest”或“back”按钮，翻到如图14所示的黄芩苷含量的PRESS界面，同理选择了建立黄芩苷含量的UV-PLS相应的自变量，选择了建立黄芩苷含量的UV-PLS模型时的因子数6。

如以上所述的方法，其特征在于：PLS模型结果最佳，采用PLS建模。

本发明的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法和银黄液中绿原酸和黄芩苷的含量的测定方法，四混液中栀子苷和总氮的含量的紫外光谱测定方法，及对以上各种成分的在线检测方法与现有技术相比较有如下有益效果：

1、该方法能快速、准确地的测定清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量，银黄液中绿原酸和黄芩苷的含量，四混液中栀子苷和总氮的含量；

2、该方法能为实现清开灵注射液生产过程中银黄液中绿原酸和黄芩苷的含量和四混液中栀子苷和总氮的含量的在线检测提供方法学依据。

附图说明

图1银黄液中绿原酸的高效液相色谱图(A绿原酸对照品，B银黄液；峰1为绿原酸)；

图2银黄液中黄芩苷的高效液相色谱图(A黄芩苷对照品，B银黄液；峰1为黄芩苷)；

图3绿原酸(0.007mg·mL^-1)、黄芩苷(0.0068mg·mL^-1)和银黄液(稀释2000倍)的紫外光谱图(光谱1为银黄液，光谱2为黄芩液，光谱3为绿原酸)；

图4 TQ Analyst软件银黄液分析“Description”标签界面；

图5 TQ Analyst软件银黄液分析“Pathlength”标签界面；

图6 TQ Analyst软件银黄液分析“Components”标签界面；

图7 TQ Analyst软件银黄液分析“Standards”标签界面；

图8 TQ Analyst软件银黄液分析“Spectra”标签界面；

图9 TQ Analyst软件银黄液分析“Regions”标签界面；

图10 TQ Analyst软件银黄液分析“Other”标签界面；

图11银黄液中绿原酸定量模型结果；

图12银黄液中黄芩苷定量模型结果；

图13银黄液校正集绿原酸含量的RMSECV随因子数增加的变化情况；

图14银黄液校正集黄芩苷含量的RMSECV随因子数增加的变化情况；

图15银黄液验证集绿原酸含量的预测值与真值的相关图；

图16银黄液验证集黄芩苷含量的预测值与真值的相关图；

图17四混液中栀子苷的高效液相色谱图(A栀子苷对照品，B四混液；峰1为栀子苷)；

图18稀释500倍的四混液紫外光谱图；

图19 TQ Analyst软件四混液分析“Components”标签界面；

图20 TQ Analyst软件四混液分析“Regions”标签界面；

图21 TQ Analyst软件四混液分析“Other”标签界面；

图22四混液中栀子苷定量模型结果；

图23四混液中总氮定量模型结果；

图24四混液校正集栀子苷RMSECV结果；

图25 Matlab 6.5软件线性回归参数计算窗口；

图26四混液验证集栀子苷含量的预测值与真值的相关图；

图27四混液验证集总氮苷含量的预测值与真值的相关图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1：紫外光谱法测定银黄液中绿原酸和黄芩苷的含量的方法

银黄液是清开灵注射液生产过程中间体之一，由金银花水提取液和黄芩苷水溶液按一定比例混合而成，其中的质量指标成分是绿原酸和黄芩苷。

1银黄液中绿原酸和黄芩苷的含量测定方法。

1.1仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括：四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器、HP数据处理工作站；

1.2试药：绿原酸和黄芩苷对照品均购自中国药品生物制品鉴定所(批号分别为110753-200212和110715-200212)；银黄液由指定药厂提供；甲醇为色谱纯，购自Fisher公司(美国)；甲酸为分析纯，购自北京化学试剂厂；

1.3  色谱条件：

绿原酸：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％甲酸(25∶75)；流速1.0mL·min^-1；检测波长330nm；柱温30℃；

黄芩苷：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％甲酸(60∶40)；流速1.0mL·min^-1；检测波长280nm；柱温30℃；含量测定结果见图1和图2；

2银黄液紫外光谱的测定方法：

仪器：HP-8453紫外-可见分光光度仪(美国Agilent公司)；

将银黄液样品稀释2000倍，在190～400nm进行扫描，扫描间隔1nm；银黄液紫外光谱见图3；

3数据处理：运用TQ Analyst软件(美国Thermo Nicolet公司)，分别采用逐步多元线性回归、主成分回归和偏最小二乘法对银黄液的高效液相色谱测定结果和紫外光谱数据进行分析，筛选最佳建模方法；运用Matlab 6.5软件(美国The MathWorks公司)计算模型中的参数，建立紫外光谱法含量预测模型，并对模型进行检验，比较结果。

3.1基本原理：三种方法均是在多元线性回归基础上发展而来，首先对原始自变量进行筛选，或抽提出新自变量，然后再与因变量进行回归分析，这种降维处理能够克服由于将一些不重要的自变量引入方程或自变量间存在相关性而导致模型精度降低的缺点。

3.1.1 多元线性回归(Multiple linear regression，MLR)

对n个样品测定了因变量Y与m个自变量X₁，X₂，...X_m的数值，数据形式如表1。

多元回归分析数据格式

多元线性回归模型的一般形式：Y＝β₀+β₁X₁+β₂X₂+…+β_mX_m+e其中β₀为常数项，β₁，β₂，…，β_m称为偏回归系数，e为残差。根据样本数据求得模型参数β₁，β₂，…，β_m的估计值b₀，b₁，b₂，…，b_m，从而得到多元线性回归方程： $\hat{Y}=b_0+b_1{X}_1+b_2{X}_2+\·\·\·+b_m{X}_m,$

为Y的估计值。

复相关系数R可用来衡量因变量Y与多个自变量间的线性相关程度，即观测值Y与估计值

之间的相关系数，0≤R≤1，R愈接近1，说明模型对数据的拟合程度愈好。

3.1.2逐步多元线性回归(Stepwise multiple linear regression，SMLR)

逐步回归的基本思想：每引入一个自变量进入方程时，要对方程中的每一个自变量作基于偏回归平方和的F检验，看是否需要剔除一些退化为“不显著”的自变量，以确保每次引入新变量之前方程中只包含有“显著”作用的自变量。这一双向筛选过程反复进行，直到既没有自变量需要引入，也没有自变量需要剔除为止。

假定逐步回归进行到第1步，对自变量X_j是否被引入或剔除进行基于偏回归平方和的F检验(H₀：β_j＝0，H₁：β_j≠0)

其中，SS_回 ^(l)(X_j)为第1步时X_j的偏回归平方和，相当于从方程中剔除X_j后所引起的回归平方和的减少量；SS_残 ^(l)为第1步时的残差平方和；n为样本数；p为第1步时方程中自变量的个数。对给定的检验水平α，若F≥F_α(1.n-p-1)，则可决定引入相应的自变量。

3.1.3主成分回归(Principle component regression，PCR)

主成分回归是将主成分分析与多元线性回归分析结合使用的方法，即先对多个自变量作主成分分析，综合出少数几个主成分，然后以这几个主成分为新自变量与因变量建立回归方程。

主成分分析是在基本保留原始自变量信息的前提下，以互不相关的较少个数的综合变量来反映原变量所提供的信息。

设有m个自变量X₁，X₂，…，X_m，欲寻找可以概括这m个变量主要信息的综合变量Z₁，Z₂，…，Z_m，也就是要寻找一组常数a_i1，a_i2，a_im(i＝1，2，…，m)，使这m个变量的线性组合：

能够概括m个原变量X₁，X₂，...X_m的主要信息。如果Z₁是原变量X₁，X₂，...X_m的一切线性组合中方差最大者，则称Z₁为第一主成分，方差次大者称为第二主成分，依此类推，最多可以有m个主成分，这m个主成分反映了全部原变量所提供的信息，且各主成分之间互不相关。实际工作中，并不需要全部的主成分，而是选择前几个主成分进行分析。

主成分数的选取是根据主成分的累积贡献率来确定的。某个主成分的方差在全部主成分方差之和中所占的比值称为该主成分的贡献率，前k个主成分的贡献率之和称为前k个主成分的累积贡献率，当累积贡献率达到某一特定的值时(一般以大于70％为宜)，则保留前k个主成分。

3.1.4偏最小二乘(Partial least square，PLS)

在偏最小二乘中，因子为原变量的线性组合，所以数据矩阵的某一主成分即为一因子。与主成分回归不同，偏最小二乘不仅对自变量X矩阵进行处理，也对因变量Y中的信息作了考虑。

设有n个样品，p个自变量(X₁，X₂，…，X_p)和q个因变量(Y₁，Y₂，…，Y_q)，偏最小二乘回归分别在X和Y中提取因子T和U，即T是X₁，X₂，…，X_p的线性组合，U是Y₁，Y₂，…，Y_q的线性组合。在提取因子时，有两个要求：(1)T和U应分别尽可能的携带自变量X和因变量Y中的信息；(2)T和U的相关程度能够达到最大。偏最小二乘的基本思想用公式表示为：

X_n×p＝T_n×p P’_p×p+E

Y_n×q＝U_n×qQ’_q×q+F

U_n×h＝B_h×hT_n×h+G

其中，T、U分别为X和Y的因子得分矩阵，P、Q分别为X和Y的载荷矩阵，E、F为系统模型不能解释的随机误差矩阵，B表征U与T的内部关系，h为因子数，G为回归的残差。实际应用时，首先根据校正集样本的X和Y得到P_p×h、Q_q×h和B_h×h，因此很据未知样品数据矩阵X_n×p，可依次计算出T_n×h、U_n×h和最终结果Y_n×q。

偏最小二乘的关键是选取因子数，通常采用交叉验证法(即留k法)计算预报残差平方和(PRESS)来确定。假设校正集样本数为n，当k取1时，每次抽出一个样品，由剩下n-1个样品建立模型并对抽出的样品进行预测，计算预报残差e_ij(i为因子数，j为被抽出的样品编号，j＝1，2，...n)，如此共轮换n次直到每个样品都被抽出过，则对应不同的因子数都可得到n个预测结果，计算因子数为i时对应的的预报残差平方和 ${\mathrm{PRESS}}_i=\underset{j=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{e}_{\mathrm{ij}},$ 选取PRESS最小或低于某一阈值时对应的因子数。也可以计算校正集交叉验证均方差(RMSECV)来确定因子数，两个指标结果是等价的，并且PRESS＝n×RMSECV²。

3.2将银黄液样品(样本数为37)分为校正集(样本数为27)和验证集(样本数为10)两部分。分配原则：使校正集和验证集样品中的绿原酸和黄芩苷含量较均匀的分布，并且验证集的含量范围应涵盖在校正集的含量范围内。

3.3采用TQ Analyst软件进行建模方法的筛选，现以PLS为例，说明方法筛选过程。

3.3.1建模方法的筛选过程

打开TQ Analyst软件，操作界面见图4。在标签栏可以看到“Description”、“Pathlength”、“Component”等标签。

在“Description”标签下，选择定量方法为PLS，还可以为该分析方法加标题及相关信息。

在“Pathlength”标签下，选择光程类型cons tant(固体样品则选择MSC或SNV)。界面见图5。

在“component”标签下，填写样品中待测组分信息，包括组分名称、缩写、单位、测量精度等。如图6，本例中待测组分为绿原酸和黄芩苷，含量单位为mg·mL^-1，测量精度到小数点后4位，另外还可以定义分析范围，本例中绿原酸含量范围是0～1mg·mL^-1，黄芩苷含量范围是20～45mg·mL^-1。

如图7，在“Standards”标签下，点击“Open Standard”，选择用于建模的样品的UV光谱(常见文件格式有.spa和.csv)，填写各样品中组分含量；通过点击“Usage”下拉框可以为样品选择类别：Calibration或Validation；将“Allow spectral processing”选中，则在“Standard”标签后出现新标签“Spectra”。

如图8，在“Spectra”标签下，可以选择光谱预处理方法，如是否需要背景校正、导数变换或平滑处理。本例中未对光谱进行背景校正和平滑处理。

在“Regions”标签下，选择用于建模的光谱范围，并根据模型预测结果对光谱范围进行优化。如图9，本例中最后筛选的波长范围为271～346nm。

如图10，在“Other”标签下，可以选择数据是否进行标准化处理及处理方法。另一个重要的作用是调整因子数，而因子数则由校正集交叉验证均方差(RMSECV)或预报残差平方和(PRESS)来确定。

点击标签栏上方的“Calibrate”按钮，即可出现如图11所示的绿原酸含量建模结果的界面。界面中的左图为模型计算值与HPLC测定结果的相关图，图中的“○”和“+”分别代表校正集样品和验证集样品，图中的两个数据依次是校正集样品绿原酸含量的计算值与真值的相关系数(R)和均方根误差(RMSEC)，R越大，RMSEC越小，模型拟合能力越好；右图为偏差图，图下方的两个数据分别是验证集样品绿原酸含量的计算值与真值的均方根误差(RMSEP)和因子数，RMSEP越小，模型预测能力越强；表格中显示了每个样品中绿原酸含量的计算值、真值及偏差。点击表右侧的“next”或“back”按钮，则会翻到如图12所示的黄芩苷含量建模结果的界面。

点击菜单栏中的“Diagnostics”，选择该菜单中的“PRESS”项，也就是对校正集采用交叉验证法(通常选择留一法)计算不同因子数时的PRESS和RMSECV。如图13所示，当因子数为6时，绿原酸含量的RMSECV最小，因此在建立绿原酸含量的UV-PLS模型时因子数取6。点击“nest”或“back”按钮，翻到如图14所示的黄芩苷含量的PRESS界面，同理选择了建立黄芩苷含量的UV-PLS模型时的因子数6。

模型建立好后，打开菜单栏中的“File”菜单，选择“Save Method As...”，选择保存路径，将该模型保存。

3.3.2建模方法的筛选结果

3.3.2.1三种方法的建模结果比较

在采用相同光谱预处理方法的前提下，比较逐步多元线性回归(SMLR)、主成分回归(PCR)和偏最小二乘(PLS)三种方法的建模结果，以校正集的计算值与真值的相关系数(R)和均方差(RMSEC)为指标评价模型的拟合能力。由表2可知，PLS模型结果最佳，因此采用PLS建模。

表2 SMLR、PCR和PLS建模结果比较

3.3.2.2光谱预处理方法的影响

采用PLS，并考察不同光谱预处理方法对模型的影响。以R和RMSEC为指标，兼顾模型的复杂程度，评价建模结果。由表3可知，采用原始光谱建立的UV-PLS模型结果最佳。

表3采用PLS和不同预处理方法的建模结果比较

3.4模型的建立

运用Matlab 6.5软件，将校正集样品紫外原始光谱数据与高效液相色谱数据代入PLS程序，计算得到建模参数P、Q和B，从而建立了银黄液的UV-PLS定量模型。

运用Matlab 6.5软件建立的PLS程序如下(程序1)：

[N，P]＝size(X_M)；

[N，Q]＝size(Y_M)；

if iter＞min(N，P)

iter＝min(N，P)；

end

％ start algrithm：PLS

for counter＝1：iter；％ extract 3 PLS components

pls_u＝Y_M(：，1)；％ get any column from Y

t_old_n＝1.0；％ the ini of t old

t_new_n＝0.0；％ the ini of t new

pls_t＝0；

while(abs(t_old_n-t_new_n)＞0.0001)

pls_t_old＝pls_t；

％ in the X block

pls_w＝(pls_u′* X_M/(pls_u′* pls_u))′；

pls_w＝pls_w/norm(pls_w)；

pls_t＝X_M * pls_w；

％ in the Y block

if(Q＞1)

pls_q＝(pls_t′* Y_M/(pls_t′* pls_t))′；

pls_q＝pls_q/norm(pls_q)；

pls_u＝Y_M*pls_q；

else

pls_q＝1；

end

％ compare t，check for convergence

t_old_n＝norm(pls_t_old)；

t_new_n＝norm(pls_t)；

end

pls_p＝(pls_t′* X_M/(pls_t′* pls_t))′；

pls_p_n＝norm(pls_p)；

pls_p＝pls_p/pls_p_n；

pls_t＝pls_t*pls_p_n；

pls_w＝pls_w*pls_p_n；

pls_b＝pls_u′*pls_t/(pls_t′*pls_t)；

X_M＝X_M-pls_t*pls_p′；

Y_M＝Y_M-pls_b*pls_t*pls_q′；

％ pls_U(：，counter)＝pls_u；

％ pls_T(：，counter)＝pls_t；

pls_P(：，counter)＝pls_p；

pls_Q(：，counter)＝pls_q；

pls_W(：，counter)＝pls_w；

pls_B(：，counter)＝pls_b；

end

程序说明：在Matlab 6.5程序中，每行指令前都会自动出现提示符“>>”；在输入程序1前，先为X_M、Y_M和iter赋值，即输入“X_M＝[]；Y_M＝[]；iter＝6；”回车，其中两个“[]”中分别为光谱数据和含量数据，“6”为因子数；赋值后，在提示符后依次输入上述指令，程序输入完毕后回车；此时，输入“pls_P”回车，即可显示pls_P结果，同样，输入“pls_Q”回车，输入“pls_B”回车，也可显示pls_Q和pls_B结果。

当建立绿原酸PLS定量模型时，X_M为27个校正集样品271～346nm的紫外光谱数据矩阵(维数27×76)，Y M为27个校正集样品的高效液相绿原酸定量结果(维数27×1)。模型参数P_绿、Q_绿和B_绿(即程序中的pls_P、pls_Q和pls_B)的计算结果为：

Q_绿＝[1  1  1  1  1  1]

B_绿＝[0.0379  0.6801  0.5321  3.2384  9.3951  2.7689]

当建立黄苓苷PLS定量模型时，X_M为27个校正集样品271-346nm的紫外光谱数据矩阵(维数27×76)，Y_M为27个校正集样品的高效液相黄芩苷定量结果(维数27×1)。模型参数P_芩、Q_芩和B_芩(即程序中的pls_P、pls_Q和pls_B)的结果为：

Q_芩＝[1  1  1  1  1  1]

B_芩＝[4.5008  13.7258  35.4006  88.1967  220.1433  81.3024]

3.5模型的检验

将10个验证集样品的光谱数据代入模型，程序如下(程序2)，其中，X为10个验证集样品271～346nm的紫外光谱数据矩阵(维数10×76)，Y为10个验证集样品中绿原酸或黄芩苷含量的预测值。

T＝X*pls_P*inv(pls_P′*pls_P)；

U＝pls_B(ones(10，1)，：).*T；

Y＝u*pls_Q′

程序2输入完毕后回车，即可显示Y的计算结果。将计算得到的预测值与实际测量值(或称作真值)进行相关性分析，结果见图15和图16，相关系数分别为：绿原酸0.9872；黄芩苷0.9923。验证结果表明，该方法能够准确预测银黄液中绿原酸和黄芩苷的含量。

4方法的运用

欲对清开灵注射液中间体之一——银黄液中的绿原酸和黄芩苷含量进行快速测定，首先将待测银黄液样品稀释2000倍，测定样品的紫外光谱，然后采集271～346nm的原始光谱数据，运用Matlab 6.5软件，将数据代入程序2，计算该样品中绿原酸和黄芩苷的含量。

5结论

UV-PLS建立的清开灵注射液中间体——银黄液中绿原酸和黄芩苷含量的预测模型稳定可靠，而且运用快速方便，可用于清开灵注射液生产过程中银黄液的在线检测。

实施例2：紫外光谱法测定四混液中栀子苷和总氮含量的方法：

四混液是清开灵注射液生产过程中间体之一，由珍珠母和水牛角的水解液，板蓝根水提取液和栀子水提取液经一定工艺混合而成，其中的质量指标成分是栀子苷和总氮。

1四混液中栀子苷和总氮的含量测定：

1.1仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括：四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器、HP数据处理工作站；KDY型定氮仪(上海瑞正仪器设备有限公司)；

1.2试药：栀子苷对照品购自中国药品生物制品鉴定所(批号：110749-200309)，四混液由指定药厂提供；乙腈为色谱纯，购自Fisher公司(美国)；

1.3方法：

色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(13∶87)；流速1.0mL·min^-1；检测波长238nm；柱温30℃；含量测定结果见图17；

总氮的含量测定按2005版中国药典“附录IX L氮测定法”的第一法进行；

2四混液紫外光谱的测定：

仪器：HP-8453紫外-可见分光光度仪(美国Agilent公司)；

将四混液样品稀释500倍，在190～400nm进行扫描，扫描间隔1nm。四混液紫外光谱见图18；

3数据处理：运用TQ Analyst软件(美国Thermo Nicolet公司)，分别采用逐步多元线性回归、主成分回归和偏最小二乘法对四混液的高效液相色谱及凯氏定氮测定结果和紫外光谱数据进行分析，筛选最佳建模方法；运用Matlab 6.5软件(美国The MathWorks公司)计算模型中的参数，建立紫外光谱法含量预测模型，并对模型进行检验，比较结果；

3.1将四混液样品(样本数为32)分为校正集(样本数为24)和验证集(样本数为8)两部分；分配原则：使校正集和验证集样品中的总氮和栀子苷含量较均匀的分布，并且验证集的含量范围应涵盖在校正集的含量范围内；

3.2采用TQ Analyst软件进行建模方法的筛选，现以SMLR为例，说明方法筛选过程：

3.2.1建模方法的筛选过程

打开TQ Analyst软件，在“Description”标签下，选择定量方法为SMLR，还可以为该分析方法加标题及相关信息；

在“Pathlength”标签下，选择光程类型constant；

在“component”标签下，填写样品中待测组分信息，包括组分名称、缩写、单位、测量精度等。如图19，本例中待测组分为总氮和栀子苷，含量单位为mg·mL^-1，测量精度到小数点后4位，另外还可以定义分析范围，本例中总氮的含量范围是3～10mg·mL^-1，栀子苷的含量范围是0.2～2mg·mL^-1；

在“Standards”标签下，点击“Open Standard”，选择用于建模的样品的UV光谱，填写各样品中组分含量；通过点击“Usage”下拉框可以为样品选择类别：Calibration或Validation；将“Allow spectral processing”选中，则在“Standard”标签后出现新标签“Spectra”；

在“Spectra”标签下，可以选择光谱预处理方法，如是否需要背景校正、导数变换或平滑处理。本例对紫外光谱进行7点三次多项式平滑处理，未进行背景校正；

在“Regions”标签下，选择用于建模的波段或波长，并根据模型预测结果对光谱范围进行优化。本例中选择了SMLR方法，软件可根据数学原理自动筛选出最佳波长点，并在模型建立后显示出波长筛选结果。把建模结果界面关闭后，在“Regions”标签下显示出波长筛选结果，如图20，本例中对原始光谱筛选的总氮定量最佳波长依次为199nm、231nm和207nm，栀子苷定量最佳波长依次为271nm、285nm和233nm；

在“Other”标签下，可以选择数据是否进行标准化处理及处理方法。另一个重要的作用是调整入选回归方程的自变量个数，而自变量个数的选择可根据校正集交叉验证均方差(RMSECV)来确定。如图21，本例中对总氮和栀子苷定量方程的自变量个数均选择3，则软件会自动筛选出前三个最佳波长建立模型；

点击标签栏上方的“Calibrate”按钮，即可出现如图22所示的栀子苷含量建模结果的界面。界面中的左图为模型计算值与HPLC测定结果的相关图，图中的“○”和“+”分别代表校正集样品和验证集样品，图中的两个数据依次是校正集样品栀子苷含量的计算值与真值的相关系数(R)和均方根误差(RMSEC)，R越大，RMSEC越小，模型拟合能力越好；右图为偏差图，图下方的数据分别是验证集样品栀子苷含量的计算值与真值的均方根误差(RMSEP)，RMSEP越小，模型预测能力越强；表格中显示了每个样品中栀子苷含量的计算值、真值及偏差。点击表右侧的“next”或“back”按钮，则会翻到如图23所示的总氮含量建模结果的界面；

点击菜单栏中的“Diagnostics”，选择该菜单中的“Cross Validation”项，也就是对校正集采用交叉验证法(通常选择留一法)进行建模；如图24，左图为采用交叉验证法建模后校正集样品栀子苷含量的计算值与真值的相关系数和交叉验证均方根误差(RMSECV)，右图为偏差图；点击“nest”或“back”按钮，可翻到总氮的交叉验证结果界面；

模型建立好后，打开菜单栏中的“File”菜单，选择“Save Method As...”，选择保存路径，将该模型保存。

3.3.2建模方法的筛选结果

3.3.2.1三种方法的建模结果比较

在采用相同光谱预处理方法的前提下，比较逐步多元线性回归(SMLR)、主成分回归(PCR)和偏最小二乘(PLS)三种方法的建模结果，以校正集的计算值与真值的相关系数(R)和均方差(RMSEC)为指标评价模型的拟合能力。由表2可知，三种方法所建模型均较好，考虑到方法的简单程度和运用方便，因此采用SMLR建模。

表2 SMLR、PCR和PLS建模结果比较

3.3.2.2光谱预处理方法的影响

采用SMLR，并考察不同光谱预处理方法对模型的影响。以R和RMSEC为指标，兼顾模型的复杂程度，评价建模结果。由表3可知，光谱是否采用导数处理，对建模结果影响不显著，因此采用原始光谱建立的UV-SMLR模型作为四混液中栀子苷和总氮的定量模型。

表3采用SMLR和不同预处理方法的建模结果比较

3.4模型的建立

运用Matlab 6.5软件，将校正集样品筛选波长下的紫外原始光谱数据与高效液相色谱及凯氏定氮测试数据代入多元线性回归程序，计算得到建模参数，包括偏回归系数β₁，β₂，β₃和常数项β₀，从而建立了四混液的UV-SLMR定量模型。

以栀子苷为例，运用Matlab 6.5软件建立多元线性回归方程的步骤如下：

(1)首先输入光谱数据与含量，即输入：

x＝[]；y＝[]；

其中，矩阵“x＝[]”中的“[]”内的数据依次为24个校正集样品在271nm、285nm和233nm下的经平滑处理后的紫外光谱数据，维数是24×3；列向量“y＝[]”中的“[]”内为相对应的24个校正集样品的栀子苷高效液相色谱定量结果，维数是24×1。

以271nm为例，7点三次多项式平滑公式为：

A_s271nm＝(-2×A_268nm+3×A_269nm+6×A_270nm+7×A_271nm+6×A_272nm+3×A_273nm-2×A_274nm)/21

其中，A_s271nm为平滑后的271nm下的吸收值，A_268nm、A_269nm、A_270nm、A_271nm、A_272nm、A_273nm和A_274nm依次为以271nm为中心，前后共7个波长下的吸收值。

(2)输入线性回归模型参数计算程序：

regstats(y，x)

回车后将出现如图25所示的上方的窗口，选中“Coefficients”后，点击“Calculate Now”按钮，出现如图25所示的下方的提示窗口，点击“OK”，则程序运行。

(3)显示结果。输入：

beta

回车后，显示：

-0.012427995

-98.09065934

118.38448270

1.5327724380

其中，第一个数值为回归方程中的常数项β₀，第二至第四个数值依次对应271nm、285nm和233nm下的吸收值的偏回归系数β₁，β₂和β₃

(4)建立模型。

根据参数计算结果，得到四混液中栀子苷的UV-SMLR定量模型为：

C_栀子苷＝-98.0907×A_271nm+118.385×A_285nm+1.53277×A_233nm-0.0124280

其中，C_栀子苷为四混液中栀子苷的含量，单位为mg·mL^-1；A_271nm，A_285nm和A_233nm分别为四混液271nm、285nm和233nm下的平滑后的紫外吸收值。

当建立四混液中总氮的UV-SMLR定量模型时，只需在

中的

内输入199nm、231nm和207nm下的径平滑处理后的紫外光谱数据，同时在

中的

内输入总氮的凯氏定氮结果，其他步骤相同，得到四混液中总氮的UV-SMLR定量模型为：

C_总氮＝2.97633×A_199nm-6.89753×A_231nm+2.62943×A_207nm-0.513901

其中，C_总氮为四混液中总氮的含量，单位为mg·mL^-1；A_199nm、A_231nm和A_207nm分别为四混液199nm、231nm和207nm下的平滑后的紫外吸收值。

3.5模型的检验

将8个验证集样品的紫外光谱数据经平滑处理后代入模型，计算得到栀子苷和总氮含量的预测值。将预测值与实际测量值(或称作真值)进行相关性分析，结果见图26和图27，相关系数分别为：栀子苷0.9895；总氮0.9992。验证结果表明，该方法能够准确预测四混液中栀子苷和总氮的含量。

4方法的运用

欲对清开灵注射液中间体之一：四混液中的栀子苷和总氮含量进行快速测定，首先将待测四混液样品稀释500倍，测定样品的紫外光谱，并对光谱数据进行7点三次平滑处理，将平滑处理后的数据代入栀子苷和总氮的UV-SMLR定量模型，计算该样品中栀子苷和总氮的含量。

5结论

UV-PLS建立的清开灵注射液中间体——四混液中栀子苷和总氮含量的预测模型稳定可靠，而且运用快速方便，可用于清开灵注射液生产过程中四混液的在线检测。

应当指出的是以上的实施例只是为了对本发明作进一步的描述，不是用来限定本发明的，在不脱离本发明的精神和构思的范围的条件下，本领域普通技术人员可以进行各种改进或变化，仍然属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法及其它分析方法测定清开灵注射液中间体及成品中各指标成分的含量，并采用紫外分光光度法对稀释后的样品进行全波长扫描；将样品分为两部分，即校正集和验证集，根据校正集样品的紫外光谱数据及含量，采用化学计量学方法对数据进行处理，并利用TQ Analyst软件和Matlab 6.5软件建立数学模型，再将验证集样品的紫外光谱数据代入数学模型，比较预测值与真值，验证该技术的准确可靠。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法是指：

银黄液中绿原酸及黄芩苷的含量的测定方法，是采用反相高效液相色谱法测定银黄液样品中绿原酸和黄芩苷的含量，并采用紫外光谱-化学计量学方法中的偏最小二乘法进行分析和数据处理；

上述银黄液紫外光谱的测定是指：采用HP-8453紫外-可见分光光度仪，将银黄液样品稀释2000倍，在190～400nm进行扫描，扫描间隔1nm；

上述采用紫外光谱-偏最小二乘法进行分析和数据处理是指：

采用紫外分光光度法对稀释2000倍的银黄液样品进行全波长扫描，将银黄液样品分为两部分，即校正集和验证集，根据校正集样品的紫外光谱数据及含量，采用偏最小二乘并利用TQ Analyst软件和Matlab6.5软件建立数学模型，再将验证集样品的紫外光谱数据代入数学模型，比较预测值与真值，验证该技术的准确可靠；

上述运用TQAnalyst软件是指，分别采用逐步多元线形回归、主成分回归和偏最小二乘法进行数据处理，建立UV预测模型，并对模型进行检验，比较结果。

3.如权利要求1所述的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法，所述的清开灵注射液中间体及成品中指标成分含量的测定方法是指四混液中栀子苷和总氮的含量的测定方法，上述四混液中栀子苷和总氮的含量测定方法：

所用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱仪，包括：四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器、HP数据处理工作站；KDY型定氮仪；

所用试药为：栀子苷对照品购自中国药品生物制品鉴定所，四混液由指定药厂提供，乙腈为色谱纯；

所用方法为：色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(13∶87)；流速1.0mL·min^-1；检测波长238nm；柱温30℃；

其中总氮的含量测定按常规方法进行；

其中四混液紫外光谱的测定方法如下：

所用仪器为：HP-8453紫外-可见分光光度仪；

具体步骤为：将四混液样品稀释500倍，在190～400nm进行扫描，扫描间隔1nm，得到四混液紫外光谱图；

接着进行数据处理：

运用TQ Analyst软件，分别采用逐步多元线性回归、主成分回归和偏最小二乘法对四混液的高效液相色谱及凯氏定氮测定结果和紫外光谱数据进行分析，筛选最佳建模方法；

运用Matlab 6.5软件，计算模型中的参数，建立紫外光谱法含量预测模型，并对模型进行检验，比较结果；将四混液样品：样本数为32，分为校正集：样本数为24，和验证集：样本数为8两部分，并使校正集和验证集样品中的总氮和栀子苷含量较均匀的分布，并且验证集的含量范围应涵盖在校正集的含量范围内。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：对清开灵注射液中间体之一：四混液中的栀子苷和总氮含量进行快速测定，是先将待测四混液样品稀释500倍，测定样品的紫外光谱，接着对光谱数据进行7点三次平滑处理，将平滑处理后的数据代入栀子苷和总氮的UV-SMLR定量模型，计算该样品中栀子苷和总氮的含量。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：该方法用于清开灵注射液生产过程中银黄液样品中的绿原酸和黄芩苷的含量的测定。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：该方法用于清开灵注射液生产过程中银黄液样品中的绿原酸和黄芩苷的含量的在线检测。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：该方法用于清开灵注射液生产过程中四混液中栀子苷和总氮的含量的在线检测。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：Matlab 6.5软件建立数学模型是指：

运用Matlab 6.5软件，将校正集样品紫外原始光谱数据与高效液相色谱数据代入偏最小二乘PLS程序，计算得到建模参数P、Q和B，从而建立了银黄液的UV-PLS定量模型。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：运用Matlab 6.5软件建立数学模型是指：

将校正集样品筛选波长下的紫外原始光谱数据与高效液相色谱及凯氏定氮测试数据代入多元线性回归程序，计算得到建模参数，包括偏回归系数β₁，β₂，β₃和常数项β₀，从而建立了四混液的UV-SLMR定量模型。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于：采用反相高效液相色谱法测定银黄液样品中绿原酸和黄芩苷的含量，是指：

1)采用高效液相色谱仪，上述高效液相色谱仪包括：四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器、HP数据处理工作站；

2)色谱条件：

绿原酸：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱：4.6×250mm，5μm；流动相：甲醇∶0.1％甲酸的混合体积比＝25∶75；流速1.0mL·min^-1；检测波长330nm；柱温30℃；

黄芩苷：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱：4.6×250mm，5μm；流动相：甲醇∶0.1％甲酸的混合体积比＝60∶40；流速1.0mL·min^-1；检测波长280nm；柱温30℃；测定银黄液样品中绿原酸和黄芩苷的含量。

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