CN110170045B - 抗菌肽Lchamp2-3在抗肿瘤细胞增殖药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌肽Lchamp2‑3在抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。通过体外细胞实验表明，源于大黄鱼的抗菌肽Lchamp2‑3对癌细胞的增殖、凋亡及细胞集落形成具有显著的抑制作用。能够被应用于抗肿瘤细胞增殖药物中，开发新型防治肿瘤候选药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及抗菌肽Lchamp2-3在抗肿瘤增殖药物中的应用。
背景技术
抗癌药物目前是研究的热点之一。从天然产物或合成化学中开发出的基因组毒性和细胞毒性药物，旨在遏制癌细胞的不可控制的生长，虽然这类化疗药物杀死循环细胞的策略显著提高了癌症患者的存活率，但细胞毒性的不分青红皂白的性质也给患者带来了严重的不良副作用，增加了继发性癌症的风险。
抗菌肽(AMPs)是小分子量寡肽，一般由5-40 个氨基酸残基组成，是一类具有广谱抗菌活性的蛋白质，被认为是对抗多种病原体的有效药物。真核生物和原核生物都能产生抗菌肽，在人体内，抗菌肽存在于各种组织中，包括皮肤的上皮细胞、呼吸系统、胃肠道以及免疫系统。
以前的研究报道AMPs有利于促进人体健康，降低癌症风险。此外，AMPs在调节先天系统，血管生成和抗癌过程中起着至关重要的作用。AMPs可特异性靶向癌细胞膜上的某些蛋白质并诱导癌细胞死亡，因此在靶向癌细胞中表现出强效毒性。因此，他们有潜力应用于抗肿瘤治疗。
目前，对抗菌肽的抗癌特性研究，包括抗肿瘤增殖和抗转移能力、增强抗肿瘤免疫、对耐多药癌细胞的活性以及对癌细胞而非正常细胞的选择性。抗菌肽才刚刚开始进入肿瘤领域，因此疗效数据相对有限，然而，传染病实验中的安全数据，尽管是间接的，也能说明患者对抗菌肽可以很好地耐受。
在通过一系列的筛选研究后，我们获得了一种对肿瘤细胞增殖具有抑制作用的鱼源抗菌肽。
发明内容
本发明的目的在于提供抗菌肽Lchamp2-3在抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。
通过检测肿瘤细胞的体外活性发现，抗菌肽Lchamp2-3能显著抑制肿瘤的增殖效果，能够被应用于抗肿瘤细胞增殖药物中，开发新型防治肿瘤候选药物。
抗菌肽Lchamp2-3在抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。
上述抗菌肽Lchamp2-3，从大黄鱼体内研究发现，其成熟肽对应的氨基酸序列为：GSPARCRFCCRCCPGMRGCGICCRF。
上述抗菌肽Lchamp2-3对肿瘤细胞的增殖有显著抑制作用。
上述抗菌肽 Lchamp2-3的浓度为15μg/mL时，肿瘤细胞的凋亡呈现时间依赖性。
上述抗菌肽Lchamp2-3对肿瘤细胞集落形成具有显著的抑制作用。
上述肿瘤细胞包括但不限于以下细胞：MDA-MB-231、HLE HepG2、HelaPc-3 DU-145。
一种应用抗菌肽Lchamp2-3制备所得的抗肿瘤细胞增殖药物。
本发明的优点在于：
本发明提供一种抗菌肽Lchamp2-3在抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。所述抗菌肽Lchamp2-3源于大黄鱼体内，其对肿瘤细胞的增殖和肿瘤细胞集落形成有显著抑制作用。肿瘤细胞的凋亡对抗菌肽Lchamp2-3呈现时间依赖性。抗菌肽Lchamp2-3能够应用于抗肿瘤增殖药物中，开发新型抗防治肿瘤候选药物。
附图说明
图1为不同浓度的抗菌肽Lchamp2-3作用24,48,72小时，乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长增殖情况。
图2为浓度为25μg/mL的抗菌肽Lchamp2-3，作用24,48,72小时后，乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡情况。
图3为不同浓度抗菌肽Lchamp2-3对乳腺癌细胞MDA-MB-231集落形成的影响。
具体实施方式
以下通过具体实例对本发明进行说明。以下实例用来说明本发明，但不限制本发明的实施范围。
实施例1
抗菌肽Lchamp2-3的从大黄鱼体内研究发现，其成熟肽对应的氨基酸序列为：GSPARCRFCCRCCPGMRGCGICCRF。其具体获得方法参照文献：Mu Yinnan,Huo Jieying,GuanYanyun,Fan Dingding,Xiao Xiaoqiang,Wei Jingguang,Li Qiuhua,Mu Pengfei,AoJingqun,Chen Xinhua. An improved genome assembly for Larimichthys croceareveals hepcidin gene expansion with diversified regulation and function.[J].Communications biology,2018,1.
将2mg Lchamp2-3冻干粉溶于1mL PBS中，作为Lchamp2-3母液备用。
实施例2
细胞毒性测试：
将2.5g的MTT粉剂溶解于50 mL的PBS溶液中，制备成10倍浓度，浓度为50 mg/ mL的MTT母液，抽滤除菌。用时将母液取出，用对应的无血清无酚红培养基稀释十倍成为MTT工作液。
将MDA-MB-231细胞消化吹打成均一的细胞悬液后用细胞计数板计算悬液中细胞浓度，并稀释至每毫升8万个细胞，之后铺入96孔板中，控制每孔铺入100μL细胞悬液，8000个细胞。37℃孵育过夜后加入Lchamp2-3母液，稀释至终浓度分别为0,10,20,30,40,50μg/mL，每个浓度设置5个孔作重复。放回至37℃恒温培养箱培养，药物作用24,48,72 h后，弃去Lchamp2-3溶液，加入MTT工作液，37℃孵育4小时。孵育结束后用移液枪顺着孔内侧壁缓缓吸出MTT工作液，并往每孔加入100 μL DMSO，放置于摇床上，室温下以60 rpm的转速避光振摇，至DMSO内紫色的结晶完全溶解形成均一透亮的溶液为止。
将96孔板脱下盖子，放到Tecan多功能酶标仪中，设置波长为490 nm，读取吸光度。根据吸光度和药物作用浓度来建立标准曲线，计算得出Lchamp2-3对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的IC50值。
结果见图1，图1结果表明：经不同浓度(0-50μg/mL)的Lchamp2-3作用24、48、72小时后，Lchamp2-3对乳腺癌细胞具有一定的毒性作用。根据吸光度和药物作用浓度来建立拟合曲线，计算得出Lchamp2-3对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的IC50值如表1：
表1 Lchamp2-3对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的IC50值
实施例3
Lchamp2-3诱导细胞凋亡，取生长状态良好的MDA-MB-231细胞，经胰蛋白酶消化后进行细胞计数。按照1.5×105cell/孔将细胞接种到6孔板中，置于培养箱中培养过夜。
待细胞完全贴壁，吸弃旧培养基，PBS清洗3次。每孔分别加入Lchamp2-3含量为25μg/mL的L-15完全培养基，分别孵育24 ,48,72h后，吸弃含药培养基，PBS清洗3次，消化收集细胞，1800 rpm离心5 min，弃上清，收集离心管底部细胞沉淀。设置两个单阳管，分别加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI，补加binding buffer缓冲液至每管总体积为500μL；设定阴性对照管，加入500 μL binding buffer缓冲液；实验组和空白对照组需要加入5 μLAnnexin V-FITC、10μL PI和485μL binding buffer缓冲液，用移液枪吹打均匀，室温下避光孵育15 min。在激发波长488 nm处用流式细胞仪来检测Lchamp2-3对乳腺癌细胞凋亡的影响，用FlowJo软件来处理分析数据。
结果见图2，图2结果表明：MDA-MB-231经25μg/mL的Lchamp2-3处理24，48，72h后，凋亡率依次为14.59%，20.48%，36.6%，由此可知，Lchamp2-3可以诱导乳腺癌细胞凋亡，并呈时间依赖性。
实施例4
Lchamp2-3对肿瘤细胞集落形成的影响：
取对数生长期状态良好的MDA-MB-231细胞，胰蛋白酶消化，细胞计数制得5×103个/mL的细胞悬液；细胞悬液加入到6孔板中，每孔500 µL，置于37℃培养箱中培养24 h；去除旧的培养基，加入不同浓度Lchamp2-3，每孔1mL，另设空白对照组，每组3个复孔。作用24h后，移除含药培养基，每孔中加入2mL新鲜的L-15完全培养基继续培养；每3天更换一次新鲜培养基，连续培养8天；去除旧培养基，PBS清洗1-2遍，结晶紫染色，相机拍照，计数克隆群落的数目。
结果见图3，图3结果表明：Lchamp2-3对乳腺癌细胞MDA-MB-231集落形成具有显著的抑制作用，当Lchamp2-3浓度升高至50μg/mL，细胞群落几乎被完全抑制。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 抗菌肽Lchamp2-3在抗肿瘤细胞增殖药物中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Lchamp2-3
<400> 1
Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg Cys Cys Pro Gly Met
1 5 10 15
Arg Gly Cys Gly Ile Cys Cys Arg Phe
20 25
Claims (3)
1.一种抗菌肽Lchamp2-3在制备抗肿瘤细胞增殖药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽Lchamp2-3，从大黄鱼体内研究发现，其成熟肽对应的氨基酸序列为：GSPARCRFCCRCCPGMRGCGICCRF。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽Lchamp2-3在制备抗肿瘤细胞增殖药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽Lchamp2-3抑制肿瘤细胞的增殖、细胞集落形成及诱导肿瘤细胞凋亡。
3.根据权利要求1所述的抗菌肽Lchamp2-3在制备抗肿瘤细胞增殖药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞包括：MDA-MB-231、HLE HepG2、HelaPc-3、DU-145。
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| An improved genome assembly for Larimichthys crocea reveals hepcidin gene expansion with diversified regulation and function;Yinnan Mu, et al.;《COMMUNICATIONS BIOLOGY》;20181116;第1卷(第195期);第5页左栏第2、3段，第10页左栏倒数第2段 * |
| Yinnan Mu, et al..An improved genome assembly for Larimichthys crocea reveals hepcidin gene expansion with diversified regulation and function.《COMMUNICATIONS BIOLOGY》.2018,第1卷(第195期),第5页左栏第2、3段，第10页左栏倒数第2段. * |
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