CN110150150A - 一种牡丹分子育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种牡丹分子育种方法，首先将牡丹种子去皮，用次氯酸钠脱毒，用无菌赤霉素溶液浸泡24h后接种于MS培养基上，暗培养诱导3天再光照/黑暗交替培养30天。待子叶长出后，将子叶切碎后与含有外源基因的根癌农杆菌LBA4404共培养2天后洗去农杆菌，再经过诱导转基因抗性愈伤组织、分化，获得转基因苗，利用GUS染色进一步鉴定转基因苗，将阳性转基因苗放入壮芽培养基进行壮芽，最后经过生根，牡丹育种完成。本发明的方法显著缩短了种子萌发的时间，提高了转基因效果，并且为牡丹的分子育种提供了一种新技术、新方法。

Description

一种牡丹分子育种方法
技术领域
本发明涉及植物栽培技术领域，具体是一种牡丹分子育种方法。
背景技术
牡丹属于芍药科芍药属牡丹组，为多年生落叶小灌木，是中国传统名花。牡丹不仅具有观赏价值和药用价值，而且具有重要的食用价值。但是自然条件下，大部分观赏牡丹都是不可育的，需要通过扦插、嫁接的方式进行无性繁殖；油用牡丹是可育的，但是从种子播种到成苗，生长缓慢，导致牡丹育种周期较长。目前，国内外还没有一套完整高效的牡丹转基因分子育种方法。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种牡丹分子育种方法，该方法操作简便、无污染，显著缩短了种子萌发的时间，缩短了获取外植体的时间，提高了转基因效果，为牡丹的分子育种提供了一种新技术、新方法。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的，依据本发明提出的一种牡丹分子育种方法，包括牡丹种子的预处理和萌发、农杆菌的转化及共培养，诱导转基因抗性愈伤组织、诱导转基因抗性芽、壮芽、生根，具体步骤如下：
(1)牡丹种子的预处理和萌发
牡丹种子去皮后用NaClO处理8～10min，处理过程中不停地搅拌，使消毒完全，用无菌水洗涤5～6次；然后放于摇床上每隔20min换一次水，重复三次；
将脱毒的种子浸泡在含300mg/L赤霉素的无菌溶液中24h；将赤霉素浸泡后的种子均匀放到MS培养基上，于22℃条件下暗培养三天，然后放在光照培养箱中光照/黑暗交替培养30天；交替培养时光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，光强为3000Lux，湿度为70％；培养30天后牡丹种子长出子叶；
(2)农杆菌的转化及共培养
将含有重组载体p3301的农杆菌LBA4404接种于含有卡那霉素的YEP液体培养基中放于28℃、180r/min的摇床上培养到OD600＝0.5～0.6，然后在4℃、6000r/min条件下离心10min，弃上清液，用诱导液重悬菌体得到菌悬液用于下一步浸染；
在超净工作台中将步骤(1)MS培养基中的牡丹子叶取出，将其切碎后放入装有菌悬液的培养皿中浸染10min，再用灭菌滤纸吸干表面水分后将子叶碎片转入配置好的共培养基中于黑暗条件下共培养2天；子叶碎片转入共培养基时将子叶碎片反着放，子叶正面靠着培养基；
(3)诱导转基因抗性愈伤组织
在超净工作台中，将15μL灭菌的吐温和240μL、500mg/L的头孢霉素加到120mL灭菌的蒸馏水中，然后将共培养的子叶叶片取出放在里面浸泡洗涤5min，再用灭菌的蒸馏水洗5～9遍；最后用无菌滤纸吸干子叶叶片表面水分，放入诱导愈伤培养基上暗培养筛选并诱导抗性愈伤，每两周继代一次，培养20～30天；
(4)诱导转基因抗性芽
将长出抗性愈伤的牡丹叶片转入分化芽筛选培养基上，诱导其产生抗性芽，培养条件：光照/黑暗交替培养25～30天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux；
(5)壮芽
出芽后采用GUS染色鉴定阳性转基因芽，经GUS染色为蓝色的是阳性转基因芽，否则为阴性转基因芽；将阳性转基因芽切下，放入壮芽培养基中光照/黑暗交替培养7～10天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，培养条件：温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux；
(6)生根
将长壮的芽切下放入生根培养基中培养15～20天，如果生根效果不明显，培养基中可以不加草铵膦；培养条件为光照/黑暗交替培养，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux。
优选地，步骤(1)中NaClO的质量浓度为2％。
优选地，步骤(2)所述的诱导液配方为：MS+1.5mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.05mg/L吲哚丁酸+200μmol/L乙酰丁香酮+10μmol/L噻苯隆+30g/L蔗糖，诱导液pH值为5.2。
优选地，步骤(2)所述的共培养基配方：MS+1.5mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+200μmol/L乙酰丁香酮(AS)+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，共培养基pH值为5.5。
优选地，步骤(2)YEP液体培养基中卡那霉素的含量为50μg/mL，所述农杆菌为根癌农杆菌。
优选地，步骤(3)培养后50～52％的子叶叶片能筛选并诱导出抗性愈伤；步骤(4)培养后27～30％的牡丹愈伤能产生抗性芽；步骤(6)培养后生根率为56～57％。
优选地，步骤(3)中诱导愈伤培养基上配方为：MS+1mg/L激动素+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+500mg/L头孢霉素(Cef)+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，诱导愈伤培养基的pH值为5.8。
优选地，步骤(4)中分化芽筛选培养基配方为：MS+1mg/L激动素+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.5mg/L赤霉素(GA3)+500mg/L头孢霉素+30g/L蔗糖+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，分化芽筛选培养基的pH值为5.8。
优选地，步骤(5)中壮芽培养基配方为：MS+0.3mg/L激动素+500mg/L头孢霉素+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，壮芽培养基的pH值为5.8。
优选地，步骤(6)中生根培养基配方为：MS+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.05mg/L萘乙酸(NAA)+500mg/L(Cef)+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，生根培养基的pH值为5.8。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明操作简单、快速，用300mg/L赤霉素(GA3)的溶液浸泡脱毒种子24h可以促进种子萌发，缩短种子生长出子叶的时间，加快转基因操作的进程。利用脱毒种生苗子叶作为外植体，可以将具有优良农艺性状的调控基因连接到p3301载体上，然后通过携带载体的农杆菌对牡丹子叶侵染进行转基因，通过此方法可以把各种优良农艺性状的调控基因转到牡丹中，育种出具有不同优良农艺性状的牡丹。本发明的育种方法可以加快牡丹分子育种进程，为牡丹分子育种提供了一种新技术、新方法，为牡丹分子育种奠定基础。
具体实施方式
为进一步阐述本发明采取的技术手段和技术效果，以下结合实施例，对本发明一种牡丹分子育种方法进行详细说明。
实施例1：
于2018年8月下旬，将采收的牡丹新种子种皮去掉，在超净工作台用质量浓度为2％的NaClO处理8min，再用无菌水洗5次，然后放于摇床(约100rpm)上，每隔20min换一次水，重复三次，得到脱毒的牡丹种子。将脱毒牡丹种子浸泡在含有300mg/L赤霉素(GA3)的无菌溶液中24h，然后均匀放到MS培养基上，封好保鲜膜，于22℃人工气候箱中暗培养三天，然后放在光照培养箱中光照/黑暗交替培养30天，交替培养时光照、黑暗培养时间分别为16h、8h，光强3000Lux，湿度70％。培养30天后牡丹种子长出子叶。
将含有p3301重组载体的农杆菌LBA4404接种于含有50μg/mL Kan(卡那霉素)的YEP液体培养基中，放于28℃、180r/min摇床上培养到OD600＝0.5～0.6，然后在4℃、6000r/min条件下离心10min，弃上清液，用诱导液重悬菌体得到菌悬液用于下一步浸染。
在超净工作台中将MS培养基中的牡丹子叶取出，将其切碎(0.4mm左右)放入装有菌悬液的培养皿浸染10min，再用灭菌滤纸吸干表面水分，将子叶碎片转入配置好的共培养基中，暗培养2天，子叶碎片转入共培养基时将子叶碎片反着放，子叶正面靠着培养基。
在超净工作台中，将15μL灭菌的吐温和240μL、500mg/L的头孢霉素Cef加到120mL灭菌的蒸馏水中，然后将共培养的子叶叶片取出放在里面，浸泡洗涤5min，再用灭菌的蒸馏水洗7遍。最后用无菌滤纸吸干子叶叶片表面水分，放入诱导愈伤筛选培养基上暗培养，筛选并诱导抗性愈伤，每两周继代一次，培养20～30天。培养后52％的子叶叶片能筛选并诱导出抗性愈伤。
将长出抗性愈伤的牡丹叶片转入分化芽的筛选培养基上诱导其产生抗性芽。培养条件：光照/黑暗交替培养25～30天，光周期：光照16h/黑暗8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux。培养后27％的牡丹愈伤能产生抗性芽。
出芽后即可采用GUS染色鉴定阳性转基因芽。经GUS染色为蓝色的是阳性转基因芽，否则为阴性转基因芽；将阳性转基因芽切下，放入壮芽培养基中光照/黑暗交替培养7～10天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，培养条件：温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux。
待芽长壮后将长壮的芽切下放入生根培养基中培养15～20天，如果生根效果不明显，培养基中不加草铵膦(PPT)。培养条件为光照/黑暗交替培养，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux。培养后生根率为56％。
实施例2：于2019年2月下旬，将在4℃冰箱存放的种子通过浸泡1h后分级筛选，选择沉淀在底部的种子进行后面的实验。将种皮去掉，在超净工作台用质量浓度为2％的NaClO处理10min，再用无菌水洗6次，然后放于摇床(约100rpm)上，每隔20min换一次水，重复三次，得到脱毒的牡丹种子。将脱毒牡丹种子浸泡在含有300mg/L GA3的无菌溶液中24h，然后均匀放到MS培养基上，封好保鲜膜，于22℃条件下于人工气候箱中暗培养三天，然后放在光照培养箱中光照/黑暗交替培养30天，交替培养时光照、黑暗培养时间分别为16h、8h，光强3000Lux，湿度70％。培养30天后牡丹种子长出子叶。
将含有p3301重组载体的农杆菌LBA4404接种于含有50μg/mL Kan(卡那霉素)的YEP液体培养基中，放于28℃180r/min摇床上培养到OD600＝0.5～0.6。然后在4℃、6000r/min条件下离心10min，弃上清，用诱导液重悬菌体得到菌悬液用于下一步浸染。
在超净工作台中将MS培养基中的牡丹子叶取出，将其切碎(0.4mm左右)放入装有农杆菌菌液的培养皿浸染10min，再用灭菌滤纸吸干表面水分后将子叶碎片转入配置好的共培养基中，暗培养3天；子叶碎片转入共培养基时将子叶碎片反着放，子叶正面靠着培养基。
在超净工作台中，将15μL灭菌的吐温和240μL、500mg/L的头孢霉素Cef加到120mL灭菌的蒸馏水中，然后将共培养的子叶叶片取出放在里面浸泡洗涤5min，再用灭菌的蒸馏水洗7遍。最后用无菌滤纸吸干子叶叶片表面水分，放入诱导愈伤筛选培养基上暗培养，筛选并诱导抗性愈伤，每两周继代一次，培养20～30天。培养后50％的子叶叶片能筛选并诱导出抗性愈伤。
将长出抗性愈伤的牡丹叶片转入分化芽的筛选培养基上，诱导其产生抗性芽。培养条件：光照/黑暗交替培养25～30天，光周期：光照16h/黑暗8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux。培养后30％的牡丹愈伤能产生抗性芽。
出芽后即可采用GUS染色鉴定阳性转基因芽，经GUS染色为蓝色的是阳性转基因芽，否则为阴性转基因芽。将阳性转基因芽切下，放入壮芽培养基中光照/黑暗交替培养7～10天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，培养条件：温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux；
待芽长壮后将长壮的芽切下放入生根培养基中，如果生根效果不明显，培养基中不加草铵膦(PPT)。培养条件为光照/黑暗交替培养15～20天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux。培养后生根率为57％。
上述实施例1和实施例2中，所述的诱导液配方为：MS+1.5mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+200μmol/L乙酰丁香酮(AS)+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖，诱导液pH值为5.2。
所述的共培养基配方：MS+1.5mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+200μmol/L乙酰丁香酮(AS)+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，共培养基pH值为5.5。
所述的农杆菌为根癌农杆菌。
所述的诱导愈伤培养基配方为：MS+1mg/L激动素(KT)+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+500mg/L头孢霉素(Cef)+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，诱导愈伤培养基的pH值为5.8。
所述的分化芽筛选培养基配方为：MS+1mg/L激动素(KT)+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.5mg/L赤霉素(GA3)+500mg/L头孢霉素(Cef)+30g/L蔗糖+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，分化芽筛选培养基的pH值为5.8。
所述的壮芽培养基配方为：MS+0.3mg/L激动素(KT)+500mg/L头孢霉素(Cef)+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，壮芽培养基的pH值为5.8。
所述的生根培养基配方为：MS+0.05mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.05mg/L萘乙酸(NAA)+500mg/L头孢霉素(Cef)+10μmol/L噻苯隆(TDZ)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，生根培养基的pH值为5.8。
以上所述仅是本发明的实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，本发明还可以根据以上结构和功能具有其它形式的实施例，不再一一列举。因此，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种牡丹分子育种方法，其特征在于包括牡丹种子的预处理和萌发、农杆菌的转化及共培养，诱导转基因抗性愈伤组织、诱导转基因抗性芽、壮芽、生根，具体步骤如下：
(1)牡丹种子的预处理和萌发
牡丹种子去皮后用NaClO处理8～10min，处理过程中不停地搅拌，使消毒完全，用无菌水洗涤5～6次；然后放于摇床上每隔20min换一次水，重复三次；
将脱毒的种子浸泡在含300mg/L赤霉素的无菌溶液中24h；将赤霉素浸泡后的种子均匀放到MS培养基上，于22℃条件下暗培养三天，然后放在光照培养箱中光照/黑暗交替培养30天；交替培养时光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，光强为3000Lux，湿度为70％；培养30天后牡丹种子长出子叶；
(2)农杆菌的转化及共培养
将含有重组载体p3301的农杆菌LBA4404接种于含有卡那霉素的YEP液体培养基中放于28℃、180r/min的摇床上培养到OD600＝0.5～0.6，然后在4℃、6000r/min条件下离心10min，弃上清液，用诱导液重悬菌体得到菌悬液用于下一步浸染；
在超净工作台中将步骤(1)MS培养基中的牡丹子叶取出，将其切碎后放入装有菌悬液的培养皿中浸染10min，再用灭菌滤纸吸干表面水分后将子叶碎片转入配置好的共培养基中于黑暗条件下共培养2天；子叶碎片转入共培养基时将子叶碎片反着放，子叶正面靠着培养基；
(3)诱导转基因抗性愈伤组织
在超净工作台中，将15μL灭菌的吐温和240μL、500mg/L的头孢霉素加到120mL灭菌的蒸馏水中，然后将共培养的子叶叶片取出放在里面浸泡洗涤5min，再用灭菌的蒸馏水洗5～9遍；最后用无菌滤纸吸干子叶叶片表面水分，放入诱导愈伤培养基上暗培养筛选并诱导抗性愈伤，每两周继代一次，培养20～30天；
(4)诱导转基因抗性芽
将长出抗性愈伤的牡丹叶片转入分化芽筛选培养基上，诱导其产生抗性芽，培养条件：光照/黑暗交替培养25～30天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux；
(5)壮芽
出芽后采用GUS染色鉴定阳性转基因芽，经GUS染色为蓝色的是阳性转基因芽，否则为阴性转基因芽；将阳性转基因芽切下，放入壮芽培养基中光照/黑暗交替培养7～10天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，培养条件：温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux；
(6)生根
将长壮的芽切下放入生根培养基中培养15～20天，如果生根效果不明显，培养基中可以不加草铵膦；培养条件为光照/黑暗交替培养，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux。
2.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(1)中NaClO的质量浓度为2％。
3.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(2)所述的诱导液配方为：MS+1.5mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.05mg/L吲哚丁酸+200μmol/L乙酰丁香酮+10μmol/L噻苯隆+30g/L蔗糖，诱导液pH值为5.2。
4.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(2)所述的共培养基配方：MS+1.5mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.05mg/L吲哚丁酸+200μmol/L乙酰丁香酮+10μmol/L噻苯隆+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，共培养基pH值为5.5。
5.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(2)YEP液体培养基中卡那霉素的含量为50μg/mL，所述农杆菌为根癌农杆菌。
6.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(3)培养后50～52％的子叶叶片能筛选并诱导出抗性愈伤；步骤(4)培养后27～30％的牡丹愈伤能产生抗性芽；步骤(6)培养后生根率为56～57％。
7.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(3)中诱导愈伤培养基配方为：MS+1mg/L激动素+0.05mg/L吲哚丁酸+500mg/L头孢霉素+10μmol/L噻苯隆+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，诱导愈伤培养基的pH值为5.8。
8.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(4)中分化芽筛选培养基配方为：MS+1mg/L激动素+0.05mg/L吲哚丁酸+0.5mg/L赤霉素+500mg/L头孢霉素+30g/L蔗糖+10μmol/L噻苯隆+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，分化芽筛选培养基的pH值为5.8。
9.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(5)中壮芽培养基配方为：MS+0.3mg/L激动素+500mg/L头孢霉素+10μmol/L噻苯隆+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，壮芽培养基的pH值为5.8。
10.如权利要求1所述的牡丹分子育种方法，其特征在于步骤(6)中生根培养基配方为：MS+0.05mg/L吲哚丁酸+0.05mg/L萘乙酸+500mg/L头孢霉素+10μmol/L噻苯隆+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+3.0g/L活性炭，生根培养基的pH值为5.8。
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