CN103937811A

CN103937811A - 牡丹PsSVP基因及其应用

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Publication number: CN103937811A
Application number: CN201410128359.7A
Authority: CN
Inventors: 张玉喜; 盖树鹏; 张扬
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2014-04-01
Filing date: 2014-04-01
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-04-01
Also published as: CN103937811B

Abstract

本发明从牡丹中分离到PsSVP基因序列。该基因所编码的蛋白能有效解除花芽内休眠，该基因可作为功能基因用于人为调控花期，保证反季节催花的植物的培育。

Description

牡丹PsSVP基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种来源于牡丹的PsSVP基因，该基因的编码产物能有效解除芽内休眠，从而达到人为调控花期，保证反季节催花的效果。

背景技术

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）属于芍药科、芍药属的落叶灌木，是原产于我国的特有名贵花卉，原为野生，经过世人长期的人工培育才被驯化为著名的观赏花卉，不仅得到国人的推崇和珍爱，而且受到世界各国人民的关注和喜爱。牡丹自然花期较短，一朵花期为3～5d，单株花期仅为6～10d，群体花期为7～15d，牡丹独特的魅力使其成为观赏花中的佼佼者，然而花期的短暂和开花季节的限制却达不到人们赏花的要求，因此牡丹的促成栽培已发展成为盆花和切花生产的重要形式之一。牡丹的生物学特性决定了牡丹必须经历内休眠这一特殊的生命过程才能正常开花展叶，所以解除花芽休眠成为牡丹促成栽培的重要内容和关键技术之一。

植物芽休眠的解除过程是非常复杂的，涉及到新陈代谢，激素调控，营养物质合成及转运，细胞信号转导，细胞分裂分化等多个方面，是多基因共同作用的结果。牡丹花芽的休眠属于典型的内休眠，迄今为止，对牡丹内休眠调控的分子机理还知之甚少。以牡丹为材料，分离芽休眠调控的相关基因，研究其分子功能，对于揭示芽内休眠机理，人为调控花期，保证反季节催花的成功，具有重要的理论意义和实践价值。植物内休眠这一看似静止的生命过程伴随着形态变化和复杂的代谢变化。近年来，高通量分析技术的应用，使全基因组范围内分析休眠解除相关基因和相关代谢活动成为可能。科学家通过SSH、基因芯片、Macroarray、2-D电泳等技术筛选，克隆了大量差异表达基因及蛋白，但多集中在功能基因上。近年来的研究结果发现一系列与休眠相关的MADS-box基因家族DAM(Dormancy Associated MADS-box)编码的转录因子表达变化较明显，超表达MADS-box基因拟南芥中开花相关基因的表达分析结果表明，MADS-box基因通过调控开花促进基因和开花抑制基因的表达显著的影响开花时间早晚。利用转录组测序结合Macroarray技术，筛选出了9个MADS-box基因的EST，其中包含类SVP基因的部分EST，经BlastP分析为MIKC型。本研究拟以此为切入点，解析MADS-box基因在低温处理条件下的表达规律和超表达MADS-box基因拟南芥的春化时间的调控，对于理解内休眠解除相关基因MADS-box家族成员对开花时间调控作用，进一步解析MADS-box家族成员的相互作用和筛选下游相关的未知蛋白，深入理解花芽内休眠的分子机理具有重要的理论价值。研究结果也为牡丹冬季反季节栽培提供理论指导，为牡丹催花品种的分子育种提供候选基因。

类SVP基因属于MADS-box基因家族中的一种，具有高度保守的MADS-box结构域和半保守的能形成卷曲螺旋的K区，在植物中广泛存在，被认为是其最重要最基本的功能是参与花器官发育的调控，很多实验研究证实了MADS-box通过调控开花促进基因和开花抑制基因的表达显著的影响开花时间早晚。

本发明的主要目的是克隆牡丹中的PsSVP基因，使其能够作为优秀的调控基因转化到植物中，有效解除芽内休眠，从而达到人为调控花期，保证反季节催花的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种对解除芽内休眠、调控花期的来源于牡丹的PsSVP基因。

本发明提供的牡丹PsSVP基因，是下列核苷酸序列之一：

序列表中的SEQ ID NO：1所示的第1位至1366位的核苷酸序列；

与序列表中SEQ ID NO：1所示的第1位至1366位的核苷酸序列具有超过90%同源性，并同时具有相同功能的DNA类似物。

本发明的再一个目的是提供一种牡丹PsSVP基因编码的具有解除芽内休眠功能的蛋白质，是具有序列SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，或将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个、几个或一些氨基酸残基的取代、缺失或添加，具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同活性且同源性超过90%的由序列SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

含有上述核苷酸序列的表达载体、重组宿主菌，及将表达载体或重组宿主菌导入植物细胞核植物所获得的重组植物细胞系和转基因植株，均属于本发明的保护范围。

可以将本发明提供的牡丹PsSVP基因或同源性超过90%并具有相同功能的DNA类似物导入观赏性花期植物，以期达到人为调控花期，保证反季节催花的效果。为冬季反季节栽培提供前提，促进花卉产业发展。

附图说明

图1EASYspin法提取牡丹总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果；

图2PsSVP的5'-RACE PCR产物电泳图；

图3PsSVP推定的氨基酸序列与其它来源的PsSVP蛋白的同源性比对（clustalW），*号代表相同的氨基酸位点；

图4PsSVP与其它物种的系统进化树分析；

图5PsSVP基因实时定量引物PCR扩增电泳图；

图6PsSVP基因在低温处理不同时间的牡丹花芽中的表达；

图7PsSVP基因在牡丹不同组织中的表达；

图8PsSVP PCR扩增电泳图；

图9PsSVP3’UTR目的片段菌落PCR检测电泳图；

图10PsSVP基因编码区分析；

图11PsSVP基因氨基酸序列分析；

图12PsSVP基因3’UTR分析；

图13PsSVP-pBI121表达载体构建流程图；

图14PsSVP完整开放阅读框的PCR产物电泳图；

图15PsSVP目的片段的菌液PCR检测电泳图；

图16pMD-PsSVP重组质粒的XbaI/SacI双酶切检测电泳图；

图17pBI121质粒载体的XbaI和SacI双酶切电泳图；

图18转基因拟南芥的抗生素筛选对比图；

图19转基因拟南芥的PCR鉴定电泳图；

图20转基因拟南芥的表型观察图。

图21下游开花基因FT、SOC1、LFY的表达电泳图。

具体实施方式

下文通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

牡丹PsSVP基因全长cDNA的获得，表达分析及家族成员的确定

试验材料来自山东省菏泽市的牡丹研究所，一般为4-5年生的牡丹品种“鲁荷红”（Paeonia suffruticosa）的健壮植株。花芽形态大小要求在（纵径×横径）1.60cm×0.6cm以上，每株有6-8枝，每个枝条上都有1-2个正常发育的花芽。

大肠杆菌菌株为DH5α，载体为pMD18-T simple（TaKaRa）。

材料处理与取样

2011年9月28日‘鲁荷红’起苗，单株栽植于直径33厘米、高22厘米盆内，浇足水，将盆埋入大田。

第一组处理：根据（Uath）模型，待日最低气温达10℃时（大约为11月10日），此时低温处理0d，作为对照T0，取样，选取一定数量刚刚进入休眠期的4-5年生‘鲁荷红’健壮植株转移至18-25℃的温室中，直至12月18日，期间每隔7d取样，将几盆植株转温室，一共5个不同低温处理。

（1）对照（T0）：4℃下处理0d。

（2）处理一（T1）：4℃条件下处理7d后转至18-22℃条件下生长。

（3）处理二（T2）：4℃条件下处理14d后转至18-22℃条件下生长。

（4）处理三（T3）：4℃条件下处理21d后转至18-22℃条件下生长。

（5）处理四（T4）：4℃条件下处理28d后转至18-22℃条件下生长。

各处理入温室前，随机选取健壮顶芽64个，剥去鳞片后，液氮速冻，-80℃保存，其余搬入温室。

第二组处理：低温处理后在室温下处理。

（1）4℃下处理7d，移入温室后1d，3d，5d后，分别随机选取健壮顶芽若干个，剥去鳞片后，液氮速冻，-80℃保存。

（2）4℃下处理21d，移入温室后1d，3d，5d后，分别随机选取健壮顶芽若干个，剥去鳞片后，液氮速冻，-80℃保存。

第三组处理：GA3激素处理。

（1）4℃下处理0d，移入温室后注射GA3激素，待12h，24h，48h，5d后，分别随机选取健壮顶芽若干个，剥去鳞片后，液氮速冻，-80℃保存。

（2）4℃下处理7d，移入温室后注射GA3激素，待12h，24h，48h，5d后，分别随机选取健壮顶芽若干个，剥去鳞片后，液氮速冻，-80℃保存。

第四组处理：未经低温处理萌动后始花期的牡丹各组织：根、茎、叶、萼片、花瓣、雄蕊和心皮，液氮速冻，-80℃保存。

实验用试剂：EASYspin植物RNA快速提取试剂盒、RNaseA（50μg/μL）（上海生工）、Taq DNA聚合酶（TaKaRa）、SMART RACE cDNA合成试剂盒（Clontech）、限制性内切酶BamH I、Hind III、EcoR I、EcoRV、Kpn I、Xba I（NEB，北京）、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（Roche）、Agarose Gel DNA Purification（TaKaRa）、无水乙醇、苯酚/氯仿/异戊醇、琼脂糖、LB Medium、DEPC。

1、牡丹花芽总RNA的提取及检测

EASYspin植物RNA快速提取按原平皓生物公司的试剂盒说明书进行。

（1）室温下，研钵中加入2mL RLT，100μL PLANTaid，20μLβ-巯基乙醇。

（2）称取200mg牡丹花芽放入研钵，室温下研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让花芽和裂解液RLT完全混合从而抑制RNA酶的活性。

（3）将裂解物转入1.5mL离心管中，剧烈摇晃振荡15s，13000rpm离心5-10min，沉淀一些无法裂解碎片及PLANTaid（结合有多糖多酚），取450μL裂解物上清液转移到一个新的离心管中。

（4）加入二分之一上清体积的无水乙醇，沉淀有可能会出现，但其不影响此实验进程，立即用枪吹打、混匀，不要离心。

（5）将混合物分两次加入到一个提前放好收集管的吸附柱RA中，13000rpm离心60s，弃掉废液。

（6）加700μL去蛋白液RW1，室温放置5min，12000rpm离心30s，弃掉废液。

（7）加500μL漂洗液RW（RW:无水乙醇=1:4），12000rpm离心30s，弃掉废液。重复一次。

（8）将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

（9）取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜中间部位加100μL RNase free water（事先在70-90℃水浴中加热效果更好），室温放置1min，12000rpm离心1min。

（10）使用第一次的洗脱液加到吸附柱重复步骤一遍。

（11）琼脂糖凝胶电泳检测。

总RNA中基因组DNA的酶解

（1）每100μLRNA溶液中加入如表1中的试剂：

表1

37℃，水浴30min。

（2）加同体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），13000rpm，15min，4℃离心。

（3）取上清，加入相同体积的氯仿再抽提一次。

（4）取上清，加入1/10体积的3M NaAc（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃，沉淀1h。

（5）4℃，13000rpm，离心25min，弃上清，沉淀先用500μL70%乙醇清洗，再用500μL无水乙醇清洗一次，干燥后，加入100μLRNase-free ddH₂O溶解沉淀。

（6）取2μL RNA在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测基因组DNA是否去除干净。

2、PsSVP基因全长cDNA的扩增（RACE-PCR）

（1）RACE扩增PsSVP全长cDNA特异性引物的设计：

按照SMART RACE cDNA synthesis Kit说明书中对PCR引物的要求（23-28nt，50-70%GC，Tm≥65℃），根据筛选出的MADS-box基因的EST，设计特异性引物，序列如SEQ ID NO：3所示。

（2）RACE-Ready-cDNA的合成

1）在两个200μL离心管中分别加入10μL不同低温处理的牡丹花芽的总RNA，混匀，核酸定量测定RNA浓度。

2）在其中一个离心管中加入1μL的5'-CDS Primer A和2.75μL总RNA，用于制备5'-RACE-Ready-cDNA，混匀。

3）在另一个离心管中加入1μL的3'-CDS Primer A和3.75μL总RNA，用于制备3'-RACE-Ready-cDNA，混匀。

4）将两支离心管于72℃加热3min，然后取出，迅速在42℃加热2min，14000g，10s，离心。

5）在5'-RACE-Ready-cDNA中，加入1μL SMARTer II A oligo。

6）两支离心管分别加入如表2中的试剂：

表2

7）轻轻混匀，快速离心收集。

8）42℃加热90min，70℃加热10min

9）分别加入100μL Tricine-EDTA Buffer，得到的两种cDNA第一链，可以保存在-20℃下备用。

（3）RACE扩增全长cDNA

1）Master Mix的成分如表3所示：

表3

2）RACE反应体系如表4所示：（50μL体系）

表4

（3）RACE扩增反应条件：

（4）RACE产物的检测和回收

50μL的RACE产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（Takara），按照其说明书提供的方法进行纯化。

1）将切下的凝胶放入称好的小离心管中，称重，记录胶块的重量。

2）加入Buffer B2,一般为胶块重量的3-6倍，56℃水浴加热5-15min融化胶块。

3）（选做）对于小于500bp的片段，加入1∕3Buffer B2体积的异丙醇。

4）把溶胶液转移到吸附柱中，10000rpm离心30s，弃去上清液。

5）加入500μL Wash Solution，10000rpm离心30s，弃去上清液。

6）重复操作步骤（5）。

7）空管10000rpm离心1分钟。

8）取一干净的1.5mL的离心管，将吸附柱放入其中，在吸附膜的中央加入15-40μL的Elution Buffer，室温静置一分钟后，10000rpm离心1分钟收集管中DNA溶液。

9）重复一次（8）步骤，提高回收率。

（5）RACE目的片段的连接和转化

按照pMD18-T simple（TaKaRa）载体的使用说明书进行连接反应实验。

1）稍微离心pMD18-T vector，收集到管底。

2）在冰上待SolutionI融化。

3）在200μL PCR管中加入以下成分，如表5：

表5

将回收产物按摩尔比3:1的比例与pMD18-T simple（TaKaRa）载体连接，加入灭菌水至总体积10μL。

4）16℃，连接过夜，使其转化效率达到最高。

（6）CaCl₂法制备大肠杆菌DH5α感受态

1）取于-80℃中保存的大肠杆菌DH5α菌种200μL，加入3mLLB液体培养基，于37℃振荡培养箱中过夜。

2）取2mL过夜培养的菌液加入到50mLLB液体培养基中，37℃振荡培养2-4h，至OD600=0.4-0.6。

3）将50mL菌液置于离心管内，4℃，4500rpm，离心5min，弃上清。

4）加入30mL100mM的冰冷的CaCl₂溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30min。

5）4℃，4000rpm，离心5min，弃上清，沉淀用2mL冷的无菌100mM CaCl₂轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即制成感受态细胞悬液。

6）200μL分装，含15-20%甘油，-80℃保存。

（7）热激法转化大肠杆菌感受态

1）准备LB固体培养基：每100mL LB液体培养基中加入0.8g琼脂，121℃，20min，高压灭菌后，待温度降低后，加入50μL Amp，混匀，倒平板，正面向上，室温下凝固。

2）取200μL大肠杆菌DH5α感受态细胞放在冰上待融化，加入连接产物10μL，轻轻混匀（不要摇动），然后置于冰上30min。

3）42℃水浴，热休克90s，不要摇动。

4）快速冰浴，静置2min。

5）加800μL LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1-1.5h，50-100rpm。

6）室温，4000rpm，离心10min，弃除上清，加入100μL LB液体培养基。

7）将菌液吹打悬浮混匀，均匀涂布在上述平板上。

8）倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养过夜，第二天观察转化效率。

（8）菌落PCR检测

将超净工作台紫外杀毒灭菌半小时，取出涂于加Amp的LB平板，从菌落中挑取单个菌斑，转到装有7～8mL LB液体培养基（含有Amp）的离心管中，37℃摇菌3h，将菌液作为模版，兼并引物进行PCR反应。反应体系如表6：

表6

反应条件同RACE扩增条件

（9）质粒DNA的提取

按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明进行质粒DNA的提取。

1）挑单菌落于5mL加有Amp的液体培养基中（每100mL液体培养基加Amp50μL）300rpm，37℃，过夜培养。

2）取过夜培养的1.5mL菌液至1.5mL离心管中，12000rpm离心1min，彻底去除上清。重复一次。

3）加入250μL SolutionI，用枪头吹打2min，混匀至充分悬浮细菌。

4）加入250μL SolutionII，立刻轻轻翻转5-10次，温和混匀。室温放置2-4min。整个过程不超过5min。

5）加入350μL SolutionIII，立刻轻轻翻转5-10次，温和混匀。室温放置2-4min。

6）室温，12000rpm，离心10min。

7）将步骤（6）中的上清液转移到套放于2mL收集管内的吸附柱中，10000rpm室温离心1min。

8）弃收集管中的废液，吸取500μL Wash Solution到吸附柱中，10000rpm室温离心1min。

9）重复步骤（8）。

10）弃收集管中的废液，10000rpm室温离心2min，彻底去除WashSolution。室温下干燥10min。

11）将吸附柱放入新的干净的1.5mL离心管中，加50μL ElutionBuffer至吸附膜中央，室温放置1min，10000rpm室温离心1min。离心管中收集的溶液即为所抽提的质粒DNA。

（10）序列测定

将培养阳性克隆的菌液送至上海博尚生物技术有限公司用特异引物进行测序。

PsSVP基因的生物信息学分析

（1）NCBI数据库中的blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）和geneLaser软件进行序列比对和同源性分析。

（2）NCBI数据库中的ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf）和Interproscan（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan）等工具分别预测读码框和功能域。

（3）用ProtParam程序（http://expasy.org/cgi-bin/protparam）预测蛋白质的分子量和等电点及性质；PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/form2.htmL）进行亚细胞定位。

（4）http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.htmL预测蛋白质的跨膜结构域。

（5）用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行蛋白质的信号肽分析。

（6）用ClustalW软件进行同源序列比对，系统发生树采用MEGA5.0软件中的邻接法（Neighbor-joining）方法构建，通过自举分析（Bootstrap）作置信度检，1000次重复检验。

（7）Sopma软件的抗原性预测、亲水性与疏水性分析和二级结构的预测（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）。

实时荧光定量PCR进行基因表达分析

实时荧光定量RT-PCR技术(real-time fluorescent quantitativereverse transcription-polymerase chain reaction，FQ RT-PCR)是检测低丰度mRNA的有效方法，为了去除样品标本中在RNA的质量、产量以及逆转录效率上可能存在的差异而获得目标基因特异性表达的真正差异，一般选择一定的内参基因进行校正和标准化。

在常规PCR结合电泳分析中只能对终产物进行分析，无法对起始模板进行准确定量，而且只能在扩增反应结束后进行电泳分析，无法对扩增反应进行实时检测，费时费力，并且许多核酸染色剂如EB等是强致癌剂。相比这些以终点法进行定量的技术，荧光实时定量PCR方法更为快速有效，准确、高通量，并且具有很高的灵敏性，重复性和特异性，其次是可以准确的对DNA原始拷贝数的定量检测，更为重要的是，在封闭的系统中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性而且无须进行扩增后操作。

（1）四组不同处理的牡丹花芽RNA的提取

提取方法同上述中的EASYspin植物RNA快速提取。DNA的去除同上。

（2）cDNA第一链的合成（M-MLV Reverse Transcriptase，NEB）

按照TaKaRa的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）试剂盒说明书操作。

1）Microtube管中分别配制下列范本及引物的混合液，全量5μL，试剂如表7所示：

表7

2）70℃保温10min后迅速在置于冰上2min以上。

3）简单离心，使范本RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

4）在上述Microtube管中配制一下反转录所需反应液，所用试剂如表8所示

表8

5）42℃保温1h。

6）70℃保温15min后，冰上冷却，合成的cDNA第一链可直接用于Real-time PCR，也可先放于-20℃储存备用。

（3）Real-time PCR引物的设计

引物设计软件使用primer5.0，设计产物不要太长，大都设计在100-200bp左右。用软件处理分析RNA退火后可能形成的二级结构和进行blast查询特异性后，利用软件自动分析出符合要求的引物，从中分析择优设计。所用引物序列如SEQ ID NO：4-7所示。

（4）Real-time PCR反应

摸索Real-time PCR最佳的退火温度

1）Real-time PCR反应体系如下：

按下列组份配制PCR反应液：

2）看家基因的反应程序

预变性 95℃30s

PCR反应（45个循环）

95℃ 5s

57℃ 30s

72℃ 30s

目的基因的实时定量PCR扩增

1）PCR范本的准备

牡丹花芽的总RNA进行反转录。分别取反转录得到的四组处理的cDNA第一链反应液，使用Easy dilution将上述模板稀释10倍，分别设定3个重复。

2）Real-time PCR反应体系同上述的Real-time PCR反应体系。

3）目的基因反应程序与筛选后的看家基因程序应当一致。

4）利用统计分析的方法得到实验结果并进行分析。

PsSVP家族成员的确定

PsSVP基因cDNA序列的多态性

（1）引物的设计如SEQ ID NO：8所示，

（2）实验方法和反应程序同上述PsSVP基因全长cDNA的扩增（RACE-PCR）的方法。

（3）序列测定：将培养阳性克隆的菌液15个送至上海博尚生物技术有限公司进行测序。

上述实验结果与分析

1牡丹花芽总RNA的提取及检测

取低温处理0d、7d、14d、21d、28d的牡丹‘鲁荷红’花芽RNA各2μL进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明，28S、18S、5S条带明亮清晰，并且条带之间无弥散现象，如图1所示，图中M表示DL2000Marker；1：低温0d的牡丹花芽总RNA；2：低温7d的牡丹花芽总RNA；3：低温14d的牡丹花芽总RNA；4：低温21d的牡丹花芽总RNA；5：低温28d的牡丹花芽总RNA，说明总RNA提取质量及浓度较高。

2总RNA完整性和纯度检测

去除DNA污染后的总RNA取3μL加入97uL DEPC-H₂O混匀，蛋白质核酸定量分光光度计确定RNA样品在260nm、280nm的吸光值，测定RNA的产量和纯度。

在260nm、280nm下的吸光值分别代表了核酸、蛋白等有机物和溶液浑浊度的值。A₂₆₀/A₂₈₀在1.8-2.1时，总RNA中蛋白或者其它的有机物污染在接受范围之内；A₂₆₀/A₂₈₀为2.0左右表明RNA纯度较好；小于1.8表明蛋白杂质较多，大于2.2说明RNA降解严重。由表2.4可以看出所提RNA样品纯度较好，浓度较高，可用于后续实验。

3.PsSVP基因全长cDNA序列和氨基酸序列的获得

从筛选出的MADS-box基因的EST分析，可知此片段的3'末端具有poly(A)尾，含有多聚腺苷酸加尾信号（polyadenylation signalsite）信号，因此可以断定该末端完整。因此该实验只需扩增其5'末端的丢失部分。

以5'-RACE-cDNA文库为模板，5'-RACE扩增得到约500bp的末端片段如图2所示，图中：M：DL2000Maker;1：SpSVP基因的5'-RACEPCR产物；连接到pMD18-T simple载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，阳性克隆送上海博尚生物技术有限公司测序。测序结果经过http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上的vecscreen进行去载体处理，得到扩增产物。

对RACE产物测序结果和已知的序列进行拼接，去掉重复序列，得到拼接后的SpSVP基因cDNA全长序列，如SEQ ID NO：1所示，按标准密码子翻译后的氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示。PsSVP基因全长cDNA1366bp，5'非编码区（UTR）为546bp，3'UTR为133bp，含有大约26个碱基的poly(A)尾，并且含有一个完整的开放阅读框（open reading frame，ORF）为684bp，编码228个氨基酸的多肽。根据Gray等（2009）对转录因子的命名方法，该序列被命名为PsSVP。

PsSVP基因生物信息学分析

PsSVP基因全长cDNA序列与氨基酸序列的生物化学特性分析

PsSVP的开放阅读框（open reading frame，ORF）为684bp，编码228个氨基酸的多肽。PsSVP蛋白分子式为C₄₁₉₂H₇₀₂₀N₁₃₆₆O₁₇₄₂S₂₈₇，其分子量为26043D，理论等电点pI为6.86；不稳定指数为41.42，推测该蛋白稳定；脂溶指数为30.97；负电荷残基总数（Asp+Glu）：0；正电荷残基总数（Arg+Lys）：0；总平均疏水指数为0.808，表明其为亲水性蛋白。DNAMAN预测其二级结构包括α-螺旋48.16%、β-折叠11.89%、β-转角39.95%。从结果可以看出在PsSVP基因推导的氨基酸序列中，丙氨酸的含量最高为31%，其次是苏氨酸占27.5%，半胱氨酸占21%，甘氨酸占20.6%。

PsSVP蛋白序列的同源性分析与构建进化树

利用MEGA4.1软件，将PsSVP编码的蛋白与Genbank上登陆的不同物种SVP基因编码蛋白进行分析，结果表明如图3所示，图中：葡萄[Vitis viniferal]|XP_002277773.1|；毛果杨[Populustrichocarpa]|XP_002320747.1|；大豆[Glycine max]|NP_001236377.1|；甘薯[Ipomoea batatas]|AAK27150.1|；牡丹[Paeonia suffruticosa]|KC847164|；拟南芥[Arabidopsis thaliana]|NP_182090.1|；玉米[Zea mays]|NP_001105154.1|；苹果[Malus x domestica]|ABD66219|；荠菜[Brassicajuncea]|AFM77905|；枳[Citrus trifolists]|ACJ09169|，PsSVP基因编码蛋白与其他植物的相似性在58.7%-80.1%，其中与葡萄（Vitisviniferal）同源性最近，相似度为80.1%，与苹果、大豆、毛果杨的相似性次之，分别为78.9%、78.8%、78.3%，与玉米（Zea mays）同源性最远，相似度为58.7%。利用MEGA4.1构建系统进化树，从图4中可以看出牡丹PsSVP蛋白先与葡萄、杨树、大豆、甘薯形成分支，再与苹果、枳形成分支。

PsSVP基因的实时定量PCR检测

引物质量评估

实时定量引物PCR扩增电泳结果如图5所示，图中M：DL2000Maker;1表示PsSVP基因的实时定量PCR产物，其片段大小符合所设计引物PCR扩增产物的大小，PsSVP基因扩增大小为270bp。并且引物的特异性良好，可用于后续定量实验。

PsSVP基因在低温解除牡丹休眠花芽中的差异表达分析

低温处理不同时间后PsSVP基因的表达

采用人工低温分别处理牡丹0d、7d、14d、21d和28d，利用引物对PsSVPRealF和PsSVPRealR检测PsSVP在低温解除休眠过程中的表达谱，如图6所示。随着感受低温天数的增加，在牡丹花芽休眠解除前期，PsSVP基因的表达量呈上调表达趋势，低温28d时，该基因的表达水平上升到最高。

不同组织中PsSVP基因的表达

分别取牡丹的根、茎、叶、萼片、花瓣、雄蕊和心皮作为实验材料，利用引物对PsSVPRealF和PsSVPRealR来检测PsSVP在不同组织中的表达特性，如图7所示。在牡丹的七种不同组织中，PsSVP基因的表达量在茎中最高，其次为叶、萼片、根、心皮和雄蕊，在花瓣中的表达量最低。

PsSVP基因cDNA序列的多态性

利用在PsSVP基因靠近起始密码子处设计的引物进行PCR扩增，所得扩增结果进行1%琼脂糖凝胶电泳，实验结果如图8所示，图中M：DL2000Maker;1：PsSVP基因的3’UTR PCR扩增：

将目的片段进行回收，并转化大肠杆菌，以转化所得大肠杆菌作为模板，RACE引物进行PCR，所得PCR扩增结果进行1%琼脂糖凝胶电泳，随机挑取15个单克隆菌液于上海博尚测序部进行测序。

菌落PCR结果如图9所示：图中，M：DL2000；1-24：菌落PCR扩增的目的片段，测序后多序列比对结果表明，PsSVP基因在编码区和3’UTR区均存在变异位点。其中在684个编码区核苷酸中，有6个位点发生了核苷酸颠换，分别发生在第213(G/A)，269(C/T)，419(C/G)，585(C/T)，600(T/C)，630(A/G)如图10所示，其中，269(C/T)，419(C/G)两个位置的颠换导致了氨基酸突变，如图11所示。在3’UTR区有一个位点发生了核苷酸的颠换：681（T/G），其中靠近3’末端的插入突变导致polyA尾巴的延后，如图12所示，而产生了3条不同的核苷酸序列，可以推测其在染色体上至少有两个不同的位点。

实施例2：

牡丹PsSVP基因超表达载体的构建

大肠杆菌菌株为DH5α，农杆菌EHA105。载体为pMD18-T simple（TaKaRa），pBI121载体由本实验室保存。

所用试剂：EASYspin植物RNA快速提取试剂盒、RNaseA（50μg/μL）（上海生工）、Taq DNA聚合酶（TaKaRa）、限制性内切酶XbaI、SacI、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、Agarose Gel DNAPurification（TaKaRa）、无水乙醇、苯酚/氯仿/异戊醇、琼脂糖、LB Medium、MS Medium、DEPC等等。

PsSVP超表达载体的构建

（1）目的基因片段的分离，连接，鉴定及测序

PsSVP完整开放阅读框的扩增：

根据已测定的PsSVP的全长cDNA序列合成特异性引物，序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示：

以1μL牡丹花芽的RNA反转录成的cDNA为模板，PCR扩增两端分别带有XbaI和SacI酶切位点的PsSVP完整的开放阅读框，其中SEQ ID NO：9上为TCTAGA，SEQ ID NO：9上为GAGCTC，菌液PCR鉴定目的片段，PsSVP开放阅读框目的片段大小为684bp。

菌液PCR扩增体系（25μl）：

菌液PCR扩增条件：

（2）试剂盒法回收目的片段，与克隆载体pMD18-T simple连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以通用引物测序，确定目的片段扩增的准确性。步骤见同实施例1中的相应步骤。

（3）按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明分别提取克隆载体pMD-PsSVP和表达载体pBI121的质粒，用XbaI和SacI限制性内切酶进行酶切反应。步骤见同实施例1中的相应步骤。

（4）分别回收酶切产物的目的基因片段和pBI121的大片段，加入T4连接酶，4℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，用含有Kan的LB培养基培养筛选转化子。进行PCR反应及质粒的双酶切（XbaI和SacI）进行重组子的筛选。（表达载体构建流程如图13所示）

PsSVP-pBI121重组子转化农杆菌感受态EHA105

农杆菌感受态的制备

（1）挑取些许农杆菌（EHA105），接种于5mL LB培养基中，28℃，200rpm/min，培养24小时。

（2）取2mL培养物，加入到LB培养基中培养，OD600约为0.5时最佳。

（3）将培养物转入无菌离心管，冰浴30min，4℃，5000rpm/min，离心5min，弃去上清液。

（4）用10mL冷的0.1M NaCl轻轻悬浮菌液，冰上放置20min。

（5）4℃，5000rpm/min，离心5min，弃去上清液。

（6）用1mL冷的约含15%甘油的CaCl₂（0.1M）悬浮，分装成20μL1管，放于液氮中冷冻，于-80℃保存备用。

转化农杆菌感受态

（1）将感受态细胞置于冰上融化。

（2）在1.5mL离心管中加入5μL质粒DNA，再加入20μL感受态细胞，混匀，冰浴30min，-80℃冷冻10min，接着在42℃水浴中放置1min。

（3）冰浴2min后加入800μL不添加抗生素的LB培养基，28℃，200rpm/min，振荡培养3h。

（4）4000rpm/min，离心10min，倒掉上清液，用100μL LB液体培养基回溶菌体。

（5）取100μL菌液涂到LB（含50mg/L Km）的固体培养基上，28℃，倒置培养2-3d，可见单菌落。

农杆菌介导的拟南芥遗传转化

拟南芥种子的消毒与萌发

拟南芥种子，用70%酒精消毒5min，2.6%的NaClO（有效成分）消毒10min，灭菌水（灭菌前加2滴Tween-20）冲洗5-8遍。然后将种子均匀播种到MS培养基上，放到4℃冰箱中春化3-5d。置于光照培养箱（16h光照/8h黑暗，18-22℃）中培养7-10d后移入蛭石中培养。

从培养皿中移栽拟南芥

（1）在育苗盘中按1:2的比例装入基质和蛭石。

（2）在一个大的营养盆中倒入营养液，把育苗盘放在里面，使营养液浸透后即可移栽。

（3）去掉培养皿的封口膜。用镊子小心夹住子叶或下胚轴将根放到土中并压一压，上面复一层保鲜膜。

（4）移栽小苗成活后，长出4片真叶时，去掉保鲜膜增强光照。

（5）待拟南芥苗子盛花期时用于侵染。拟南芥在短日照条件下（8h光照/16h黑暗，18-20℃）生长一个月后，于4℃条件下处理6-8周，然后移入长日照条件下（16h光照/8h黑暗，20-22℃），约经过一个月可开花。

拟南芥转化

（1）剪掉拟南芥的主花序顶端，促进侧花序生长及开花，以便于后续的转化。

（2）农杆菌准备：

转化之前，在培养液中加入5mL抗生素用来活化农杆菌。下午，取1-3mL的菌液加到500mL的培养基中培养24h，次日早晨即可进行转化拟南芥。

（3）转化：

①配侵染液（100mL）：

②收集菌体：

ⅰ转速4000rpm，离心10min，把上清倒掉。加入浸染液，使菌体悬浮。

ⅱ如果浸染液体积大于50mL，最好调pH5.7-5.8。

ⅲ把拟南芥的花序完全浸没到浸染液中保持10s，之后把拟南芥放入放到箱子中，上覆薄膜，暗培养24h。

转基因植株种子的收集

（1）收集拟南芥的种子，干燥。

（2）种子处理：使用70%酒精，消毒时间为5min，2.6%的NaClO（有效氯，加少许Tween-20）消毒10min，灭菌水（灭菌前加2滴Tween-20）冲洗5-8遍。随后将种子均匀的播种到培养基上（筛选培养基的卡那霉素浓度为50mg/L）。放到4℃冰箱中3-5d后放到培养室培养。

（3）转基因植株和对照同时移到营养钵里培养，并注意观察表型变化，能够生长并呈现绿色的即为转基因植株，生长状态同对比的野生型生长相似。

阳性植株的筛选

进行基因转化后，接下来实验需要做的是快速、有效地检测出转基因阳性植株，外源基因是否整合到植物染色体上。鉴定外源基因是否转入受体的常用方法有：报告基因、PCR检测、实时定量PCR检测、Southern杂交。

收取已成熟的T1代种子，消毒后点种于含50mg/L Kan的MS培养基中，4℃处理3d后，移入光照培养箱。8-10d后挑选转化苗，转化苗呈现出真叶深绿色，将转化苗移入土中培养，收获T2代种子。将T2代种子继续种于含有50mg/L Kan的MS选择培养基上，选择近3:1分离群体的抗性植株，种植收获T3。若T3代种子在选择性培养基中全部具抗性，则对应的T3代种子是纯合体。提取其RNA，以反转录后的cDNA为模板使用特异引物进行PCR检测。

超表达SVP基因拟南芥下游开花相关基因的表达，引物如SEQ ID NO：11-16所示，

通过PT-PCR得到超表达MADS-box基因拟南芥的下游开花相关基因（FT、SOC1、LFY）的表达差异，解析MADS-box基因对开花时间的调控。

PsSVP基因目的片段的获得

图14所示，M：DL2000；1-2：PsSVP目的片段的PCR产物，产物大小为684bp。图15为目的片段连接pMD18-T simple载体转化大肠杆菌感受态的菌液PCR检测结果，其中M：DL2000；1-7：菌落PCR扩增的目的片段。以通用引物的测序结果表示，扩增的目的片段与所得的全长cDNA序列相一致。

PsSVP-pBI121超表达载体的构建

用XbaI和SacI对目的基因连接pMD18-T simple载体的重组质粒DNA和pBI121质粒DNA进行双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，结果分别如图16M：DL2000Maker；1，2：pMD-PsSVP重组质粒的XbaI/SacI双酶切。图17为连接pBI121的目的片段的XbaI和SacI双酶切检测结果，M：DL2000Marker；2,3：pBI121载体大片段筛选成功得到转化的重组子。

PsSVP的转基因验证

PsSVP转基因植株的抗生素筛选

灭菌后的T3代移入基本培养基中培养15天后观察，结果如图18所示，图中左侧为野生型的拟南芥，右侧为PsSVP-pBI121转基因拟南芥，表明野生型的根长明显长于转PsSVP基因植株的。

PsSVP转基因植株的分子鉴定

在PsSVP基因抗性株系选取2个株系，利用超表达载体引物进行RT-PCR检测。结果如图19所示，表明所检测的2个株系中外源基因PsSVP都得到表达，其中，M：DNA marker DL2000；1：野生型拟南芥；2-3：PsSVP-pBI121转基因拟南芥。

PsSVP转基因拟南芥的表型观察

为了研究PsSVP基因对转基因拟南芥的影响，对转基因拟南芥进行了表型观察，结果如图20所示，左侧：野生型拟南芥；右侧：PsSVP-pBI121转基因拟南芥。实验结果表明野生型的株高与转基因植株相比明显较高，开花过程中观察其莲座叶的数量及大小，发现野生型植株较转基因植株的莲座叶叶片较小但数量多。

下游开花相关基因的表达

RT-PCR结果如图21所示，M：DNA marker DL2000；1：野生型拟南芥；2：转PsSVP拟南芥，表明转基因植株与野生型植株相比，下游开花基因FT、SOC1、LFY的表达量都是下降的。

Claims

1.一种来源于牡丹的解除花芽内休眠基因PsSVP的DNA序列或具有与之相同功能和相似结构的DNA类似物，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述基因的编码产物，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，或将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个、几个或一些氨基酸残基的取代、缺失或添加，具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同活性且同源性超过90%的由序列SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

3.解除花芽内休眠基因PsSVP基因的超表达载体，其特征在于带有权利要求1所述的解除花芽内休眠基因的SEQ ID NO：1核苷酸序列。

4.含有权利要求1所述解除花芽内休眠宿主菌。