CN110106231A - 一种利用dUTP或dTTP检测核酸中腺嘌呤N6或N1位发生甲基化修饰的方法 - Google Patents

一种利用dUTP或dTTP检测核酸中腺嘌呤N6或N1位发生甲基化修饰的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用dUTP或dTTP检测核酸中腺嘌呤N6或N1位发生甲基化修饰的方法。该检测方法主要由两部分组成：第一部分是通过延伸反应将三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸（dUTP）或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）掺入DNA序列。第二部分是通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析得到含有不同位点的链的延伸百分比，处理后可判断含有不同位点的链的延伸速率从而达到识别检测N6‑甲基腺嘌呤和N1‑甲基腺嘌呤的目的。该方法克服了现有检测方法设备需求高、原料昂贵、操作繁琐等不足，灵敏度高、适应范围广。

Description

一种利用dUTP或dTTP检测核酸中腺嘌呤N6或N1位发生甲基化 修饰的方法
技术领域
本发明属于分子生物学、核酸化学和表观遗传学(Epigenetic)领域，具体涉及一种基因组中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine)或N1-甲基腺嘌呤的识别检测方法。
背景技术
表观遗传学作为遗传学的一门重要分支学科，主要研究基于非基因序列改变所引起的基因表达的可遗传的变化。其作用机制主要包括：DNA甲基化、染色质重塑、非编码RNA调控、组蛋白修饰等。表观遗传学与众多生命功能有关，例如基因组印记、X-染色体失活等。同时研究表明，表观遗传学与癌症、免疫系统疾病、数种遗传性的智力迟钝疾病等疾病的发生存在重要关联。
表观遗传学中，RNA的修饰十分丰富，大约有上百种。研究表明，在“中心法则”中，mRNA并不仅仅只是简单地作为传递者将遗传信息从DNA传递至蛋白，它本身也参与多种生物学过程。其中，N6-甲基腺嘌呤是哺乳动物mRNA中的一种含量最丰富同时也极为重要的表观遗传修饰。研究发现N6-甲基腺嘌呤可能会影响mRNA诱导的转录本降解及翻译抑制，同时发现N6-甲基腺嘌呤的基因很多还与RNA代谢、细胞间信号传递、及神经系统疾病等相关。N6-甲基腺嘌呤作用于哺乳动物多种生物学过捏，包括基因的调控表达化及RNA代谢，具有十分重要的研究价值，逐渐成为表观遗传学研究的热点。
DNA的表观遗传学修饰主要分为两大类，一是胞嘧啶上C5位的甲基化修饰，称之为5-甲基胞嘧啶(5mC)；第二类为腺嘌呤上N6位发生甲基化修饰，我们把它称之为N6-甲基腺嘌呤。这两种不同的表观遗传修饰不仅存在着生物体分布位置和含量的差异，同时他们所承担的生物学功能也完全不同。例如，5-甲基胞嘧啶主要分布于哺乳动物以及其他真核生物中，对于基因的选择性表达、基因的稳定性、个体发育及疾病的发生都起着至关重要的作用。然而在原核生物和一些低等的真核生物中，N6-甲基腺嘌呤则取代5-甲基胞嘧啶成为主要的表观遗传学修饰，并执行其特定的生物学功能。在过去很长的一段时间里，由于检测手段的限制，N6-甲基腺嘌呤—直被认为只分布于细菌的DNA中。
随着检测技术的发展，研究人员发现N6-甲基腺嘌呤也存在于一些真核生物中，同时其潜在的表观遗传学功能也逐步被揭示。例如，可能也携带有重要的表观遗传学信息，并且能够在子代中进行遗传传递等。逐渐深入的研究表明，DNA与RNA中的N6-甲基腺嘌呤具有不可替代的研究价值，而其检测方法的便捷高效性对其功能特点、作用机理等的进一步研究的影响就愈发关键。
现有的N6-甲基腺嘌呤主要检测方法包括超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra-High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS)、光交联测序(Optical crosslinking sequencing)、单细胞实时测序(Single moleculereal time sequencing，SMRT)等方法。尽管这些方法能够达到检测N6-甲基腺嘌呤的目的，但是它们仍存在一些局限性。例如单细胞实时测序法难以识别N6-甲基腺嘌呤和N1-甲基腺嘌呤这些结构相似的修饰类型；而其他方法步骤繁琐或者设备昂贵。
而对于近期兴起的m1A的研究，Dunn在58年前(1961年)就首次将N1-甲基腺嘌呤鉴定出来，并且在不久后，已可以从RNA中纯化出N1-甲基腺苷单核苷酸。在酵母中纯化并测序tRNA后，首次证明了tRNA中的N1-甲基腺苷的存在。近四十年后，研究发现已知具有m1A的tRNA的数量为564个。tRNA中m1A的位置分别为9,14,22和58位，其中264个tRNA的主要部分含有m1A，位于TΨC环的第58位。在大多数酵母tRNA中，在第58位催化形成N1-甲基腺苷修饰(m1A58)的酶对于酵母细胞活力是必需的，这使得探索这种单一修饰对tRNA结构和功能的作用成为可能。由于m1A在生命的三个领域(细菌，古细菌和真核生物)中的tRNA均有出现，故这一修饰具有突出的重要性。由此可以做出假设：m1A是原始RNA修饰，其在tRNA功能和或结构中起重要作用。从m1A结构也可以证明，m1A是具有正静电荷的少数甲基化核苷中的一种(此外还有7-甲基鸟苷和3-甲基胞苷)，表明它可以通过电子对tRNA结构稳定性做出显着贡献。
为了全面探索转录体中的m1A甲基化，需要开发m1A检测方法。但之前开发的方法也都有一定的问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的缺陷与不足，本发明的目的是提供一种无需使用昂贵仪器、无繁琐步骤、环境友好、实用性强且能高效、特异并灵敏地识别检测N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的方法。
本发明通过如下技术方案完成：
本发明提供了一种利用三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸识别带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸的方法，具体包括：
(1)以三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUTP)或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)作为DNA合成的原料，在紧邻疑为N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的位点上游根据模板链序列设计一条长度为17-20bp的引物，在DNA聚合酶或逆转录酶作用下与核酸共孵育进行延伸反应，以将三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUTP)或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)掺入序列，所述核酸为疑为含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的位点的待测核酸或对照核酸，所述对照核酸为对应位点不含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤、序列与待测核酸相近且其他位点含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤水平与待测核酸相同的核酸；
(2)步骤(1)延伸产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析，经凝胶成像仪测定被延伸的底物浓度和未被延伸的底物浓度，得到延伸百分比，所述延伸百分比为：延伸百分比＝被延伸的底物浓度/(被延伸的底物浓度+未被延伸的底物浓度)；
(3)结果判定：如果待测核酸的延伸百分比小于对照核酸的延伸百分比，即可识别待测核酸为带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸；同时通过进一步用含N6-甲基腺嘌呤的核酸替代步骤(1)的对照核酸成为新的对照核酸进行实验，若二十分钟后待测核酸的延伸百分比远小于新的对照核酸的延伸百分比，即可识别待测核酸为带有N1-甲基腺嘌呤的核酸，若反应半分钟至两分钟内待测核酸的延伸百分比小于新的对照核酸的延伸百分比，两分钟后延伸百分比接近，即可识别待测核酸为带有N6-甲基腺嘌呤的核酸。
优选地，步骤(1)所述的引物的5’端修饰有FAM。
优选地，步骤(1)所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
优选地，步骤(1)所述逆转录酶为M-MuLV逆转录酶。
第二方面，提供一种利用三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸识别带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸的方法，具体包括：
(1)以三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUTP)或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)作为DNA合成的原料，在紧邻疑为N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的位点上游根据模板链序列设计一条长度为17-20bp的引物，加入精胺，在DNA聚合酶或逆转录酶作用下与核酸共孵育进行延伸反应，以将三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUTP)或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)掺入序列，所述核酸为疑为含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的位点的待测核酸或对照核酸，所述对照核酸为对应位点不含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤、序列与待测核酸相近且其他位点含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤水平与待测核酸相同的核酸；
(2)步骤(1)延伸产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析，经凝胶成像仪测定被延伸的底物浓度和未被延伸的底物浓度，得到延伸百分比，所述延伸百分比为：延伸百分比＝被延伸的底物浓度/(被延伸的底物浓度+未被延伸的底物浓度)；
(3)结果判定：如果待测核酸的延伸百分比小于对照核酸的延伸百分比，即可识别待测核酸为带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸；同时通过进一步在待测核酸中不加精胺，重复上述步骤(1)和(2)获得的延伸百分比与步骤(2)中获得的待测核酸的延伸百分比进行比较，差异明显，且加入精胺的延伸百分比大于未加精胺的延伸百分比的待测样本，即可识别待测核酸为带有N1-甲基腺嘌呤的核酸。
优选地，步骤(1)所述的引物的5’端修饰有FAM。
优选地，步骤(1)所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
优选地，步骤(1)所述逆转录酶为M-MuLV逆转录酶。
优选地，所述精胺的浓度为100μM-40mM。
第三方面，提供三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸在制备识别带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸的检测试剂中的应用。
本发明技术方案的原理是：当以dUTP或dTTP为合成原料时，利用含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸链与含未修饰的腺嘌呤的核酸链在DNA聚合酶或逆转录酶催化下的延伸反应速率的显著差别，获得甲基化修饰位点的准确信息；同时，利用N1-甲基腺嘌呤和N6-甲基腺嘌呤延伸反应速率的差异即可判断修饰的类型。另外，本发明通过加入一定量的精胺促进带有N1-甲基腺嘌呤的核酸延伸速率加快，提高检测效率，同时，由于精胺对含N6-甲基腺嘌呤的核酸延伸速率促进效果没有或者说不明显，对N-1促进效果显著，通过对比加入前后延伸百分比，使不同种类的甲基化修饰能清晰地体现。
本发明的优点和有益效果
1.本发明是对现有方法检测手段的优化：本发明提供了一种灵敏、便捷的识别检测N6-甲基腺嘌呤和N1-甲基腺嘌呤的方法。现有的N6-甲基腺嘌呤主要检测方法包括超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra-High Performance Liquid Chromatography-tandem MassSpectrometry，UHPLC-MS/MS)、单细胞实时测序(Single molecule real timesequencing，SMRT)等方法，但是这些方法或难以达到单碱基分辨率、或存在设备昂贵、实验条件要求较高等劣势。因而与本方法相比应用潜力受到了很大的限制。
2.有效解决了含有N1-甲基腺嘌呤修饰位点导致延伸过慢的问题：该发明通过加入一定量的精胺促进延伸反应使不同种类的甲基化修饰能清晰地体现，并探究出了精胺的最适浓度。尤其在对N1-甲基腺嘌呤延伸反应速率的测定中，可能因延伸速率过慢导致耗时几小时，对实验效率的影响很大。
3.本发明的检测方法可以有效区分不同的类型的甲基化修饰：传统检测过程中识别N6-甲基腺嘌呤和N1-甲基腺嘌呤这些结构相似的修饰类型存在困难，且当实验条件苛刻时还会发生两种结构之间的重排，因而是传统方法的主要问题之一。本发明实验条件温和，仅需要采用M-MuLV逆转录酶或BstDNA聚合酶催化，不需要采用PCR技术，仅利用N1-甲基腺嘌呤和N6-甲基腺嘌呤延伸反应速率的差异即可判断是否存在修饰位点以及修饰的类型。
4.本发明的检测方法可以产生可视化和可量化的检测效果：通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析，延伸百分比可通过灰度体现，产生可视化结果。经过对数据的处理与分析，可以得到延伸的百分比，得到可量化的结果。为检测的可行性提供了重要保证。
5.本发明具有低检出限与不受待测序列长度限制的特点：在DNA聚合酶或逆转录酶催化下的延伸反应速率极快，使得本发明能适应较大长度范围的核酸链样本检测，在全基因组可能存在的修饰位点处，可进一步完善对腺嘌呤甲基化类型的探究，方便研究相关的致病机理以及进行相关药物研发。
6.本发明对于癌症的早期诊断具有重要意义：许多癌症患者的早期诊断常常难以进行，主要是由于受限于检测试剂成本高昂，步骤繁琐，结果分析间隔时间长，而且对于不同时期的初期癌症检测效果存在不确定性等。本发明通过健康个体与患癌个体检测结果的对比确认检测指标，仅需要易得的生化试剂，即可对患者的患病情况进行初判，为癌症筛查提供重要参考依据，同时降低检测开展成本，有极大潜力制成试剂盒投入一般医疗检测当中。
附图说明
图1为63℃时在相同位点含有不同修饰的DNA序列分别与25μM三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUTP)在Bst DNA聚合酶作用下进行延伸反应后的变性聚丙烯酰胺凝胶分析图。(电泳图中上面的条带为延伸片段，下面的条带为未延伸的片段，图例中1mA代表N1-甲基腺嘌呤，图例中6mA代表N6-甲基腺嘌呤)
A为含有腺嘌呤位点的DNA序列，其中，从左往右条带1-13对应不同处理时间的结果；B为含有N6-甲基腺嘌呤位点的DNA序列，其中，从左往右条带1-13对应不同处理时间的结果；C为含有N1-甲基腺嘌呤位点的DNA序列，其中，从左往右条带1-13对应不同处理时间的结果。D为含有腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤和N1-甲基腺嘌呤位点的DNA序列延伸百分比-时间曲线。
图2为63℃时将含有不同位点的DNA序列与6.25μM三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)在Bst DNA聚合酶作用下进行延伸反应后的变性聚丙烯酰胺凝胶分析图。(电泳图中上面的条带为延伸片段，下面的条带为未延伸的片段，图例中图例中6mA代表N6-甲基腺嘌呤)
A为含有腺嘌呤位点的DNA序列，其中，从左往右条带1-13对应不同处理时间的结果；B为含有N6-甲基腺嘌呤位点的DNA序列，其中，从左往右条带1-13对应不同处理时间的结果；C为含有N1-甲基腺嘌呤(m1A)位点的DNA序列，其中，从左往右条带1-13对应不同处理时间的结果；D为含有腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤和N1-甲基腺嘌呤位点的DNA序列延伸百分比-时间曲线。
图3为63℃时将含有N1-甲基腺嘌呤位点的DNA序列与三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)在Bst DNA聚合酶作用下进行延伸反应的变性聚丙烯酰胺凝胶分析图。
A对应加入10mM精胺，其中，从左往右条带1-13分别为不同时间的反应结果；B对应不含精胺，其中，从左往右条带1-13分别为不同时间的反应结果；C为(a)和(b)中结果所作延伸百分比-时间曲线。
图4为63℃时将含有N1-甲基腺嘌呤位点的DNA序列与不同浓度的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)及精胺在Bst DNA聚合酶作用下进行延伸反应的变性聚丙烯酰胺凝胶分析图。
A对应加入1.95nM三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，其中，从左往右条带1-6分别为不同浓度精胺环境中处理10s的结果，从左往右条带7-12分别为不同浓度精胺环境中处理40s的结果；B对应加入3.125μM三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，其中，从左往右条带1-6分别为不同浓度精胺环境中处理10s的结果；条带7-12分别为不同浓度精胺环境中处理40s的结果；C对应加入3.125μM三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，其中，从左往右条带1-6分别为不同浓度精胺环境中处理8min的结果,条带7-12分别为不同浓度精胺环境中处理20min的结果。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。以下实施例所用到的核酸序列如下表1：
表1
Name Sequence(from5’to3’)
DNA-17mer-A1 5'-AATGCCACATGCTGCAC-3'
DNA-17mer-6mA1 5'-(N6-Me-dA)ATGCCACATGCTGCAC-3'
DNA-17mer-1mA1 5'-(N1-Me-dA)ATGCCACATGCTGCAC-3'
Primer 5'-FAM-GTGCAGCATGTGGCAT-3'
【实施例1】
本发明方法应用于25μM dUTP下的序列检测。具体步骤如下所示：
1.6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein，FAM)最大激发波长为495nm，最大吸收波长为521nm，可用于标记待测DNA引物的5’端，在凝胶成像仪中用紫外光激发下，成像时无须再染色；
2.按如下配方配置25℃下pH8.8的1μL1×ThermoPol缓冲液：20mM Tris-HCl，10mM硫酸铵，10mM氯化钾，2mM硫酸镁。加入0.1％聚乙二醇辛基苯基醚、0.2μL终浓度为2μM的双链DNA(分别在相同的位置含有腺嘌呤，N6-甲基腺嘌呤，N1-甲基腺嘌呤)DNA-17mer-A1、DNA-17mer-6mA1和DNA-17mer-1mA1、25μM dUTP、1μL Bst DNA聚合酶，及引物Primer，引物和双链DNA的浓度比例为3：5，并加入ddH2O补齐体积至10μL；
3.控制恒温63℃下孵育5min，间隔不同的时间段取样分析，分析时加入45μL停止缓冲液(95％甲酰胺，25mM EDTA，pH8.0)以终止反应。终止后立即加热到90℃并保温10min，冷却到4℃。
4.上述反应后的体系经20％变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳分离延伸与未延伸的片段，在凝胶成像仪中表征并计算延伸百分比。
结果：含有腺嘌呤或N6-甲基腺嘌呤位点的模板序列延伸速率远高于含有N1-甲基腺嘌呤的位点的模板序列延伸速率。含有腺嘌呤(A)位点的模板序列延伸速率与N6-甲基腺嘌呤位点的模板序列延伸速率十分相近。(图1)
【实施例2】
本发明方法应用于6.25μM dTTP下的序列检测，具体步骤如下所示：
1.配置25℃下pH8.8的1μL1×ThermoPol缓冲液：20mM Tris-HCl，10mM硫酸铵，10mM氯化钾，2mM硫酸镁。加入0.1％聚乙二醇辛基苯基醚、0.2μL终浓度为2μM的双链DNA(分别在相同的位置含有腺嘌呤，N6-甲基腺嘌呤，N1-甲基腺嘌呤)DNA-17mer-A1、DNA-17mer-6mA1和DNA-17mer-1mA1、6.25μM dTTP、1μL Bst DNA聚合酶，及引物Primer，引物和双链DNA的浓度比例为3：5，并加入ddH2O补齐体积至10μL；
2.控制恒温63℃下孵育5min，间隔不同的时间段取样分析，分析时加入45μL停止缓冲液(95％甲酰胺，25mM EDTA，pH8.0)以终止反应。终止后立即加热到90℃并保温10min，冷却到4℃；
3.上述反应后的体系经20％变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳分离延伸与未延伸的片段，在凝胶成像仪中表征并计算延伸百分比。
结果：含有腺嘌呤或N6-甲基腺嘌呤位点的模板序列延伸速率远高于含有N1-甲基腺嘌呤的位点的模板序列延伸速率。含有腺嘌呤位点的模板序列延伸速率与N6-甲基腺嘌呤位点的模板序列延伸速率十分相近。(图2)
实施例3：
本发明方法用于探究精胺是否存在对含有N1-甲基腺嘌呤位点的序列的检测影响，具体步骤如下所示：
1.按实施例1、2相同的配方配置两组25℃下pH8.8的1μL1×ThermoPol缓冲液。均加入0.1％聚乙二醇辛基苯基醚、0.2μL终浓度为2μM的双链DNA DNA-17mer-1mA1、终浓度6.25μM dTTP、1μL Bst DNA聚合酶，及引物Primer，引物和双链DNA的浓度比例为3：5，其中一组加入终浓度100μM精胺，另外一组作为空白对照，两组体系均加入ddH2O补齐体积至10μL。
2.控制恒温63℃下孵育10min，加入45μL停止缓冲液(95％甲酰胺，25mM EDTA，pH8.0)以终止反应。终止后立即加热到90℃并保温10min，冷却到4℃；
3.上述反应后的体系经20％变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳分离延伸与未延伸的片段，在凝胶成像仪中表征并计算延伸百分比。
结果：相同时间下，有精胺存在时，含有N1-甲基腺嘌呤的位点的模板序列延伸百分比增加(图3)。
实施例4：
本发明方法用于探究不同浓度精胺对含有N1-甲基腺嘌呤位点的序列的检测的影响，具体步骤如下所示：
1.按实施例1、2相同的配方配置25℃下pH8.8的1μL1×ThermoPol缓冲液。加入0.1％聚乙二醇辛基苯基醚、0.2μL终浓度为2μM的双链DNA DNA-17mer-1mA1、终浓度1.95μM或3.125μM dTTP、1μL Bst DNA聚合酶，及引物Primer，引物和双链DNA的浓度比例为3：5，分组加入浓度梯度的精胺处理10，40s，8min或20min，并加入ddH2O补齐体积至10μL。不同组别的底物浓度如下：
浓度梯度(mM)：0，2.5，5.0，10，20，40
组别一：dTTP1.95mM处理时间10s
组别二：dTTP1.95mM处理时间40s
组别三：dTTP3.125mM处理时间10s
组别四：dTTP3.125mM处理时间40s
组别五：dTTP3.125mM处理时间8min
组别六：dTTP3.125mM处理时间20min
2.控制恒温63℃下孵育，加入45μL停止缓冲液(95％甲酰胺，25mM EDTA，pH8.0)以终止反应。终止后立即加热到90℃并保温10min，冷却到4℃；
3.上述反应后的体系经20％变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳分离延伸与未延伸的片段，在凝胶成像仪中表征并计算延伸百分比。
结果：提高精胺浓度，延长处理时间，有助于含有N1-甲基腺嘌呤的位点的模板序列的延伸(图4)。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种利用dUTP或dTTP检测核酸中腺嘌呤N6或N1位发生甲基化修饰的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgccacat gctgcac 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> N6-甲基腺嘌呤
<400> 2
aatgccacat gctgcac 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> N1-甲基腺嘌呤
<400> 3
aatgccacat gctgcac 17
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'端FAM修饰
<400> 4
gtgcagcatg tggcat 16

Claims (10)

1.一种利用三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸识别带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸的方法，其特征在于，具体包括：
(1)以三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸作为DNA合成的原料，在紧邻疑为N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的位点上游根据模板链序列设计一条长度为17-20bp的引物，在DNA聚合酶或逆转录酶作用下与核酸共孵育进行延伸反应，以将三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入序列，所述核酸为疑为含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的位点的待测核酸或对照核酸，所述对照核酸为对应位点不含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤、序列与待测核酸相近且其他位点含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤水平与待测核酸相同的核酸；
(2)步骤(1)延伸产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析，经凝胶成像仪测定被延伸的底物浓度和未被延伸的底物浓度，得到延伸百分比，所述延伸百分比为：延伸百分比＝被延伸的底物浓度/(被延伸的底物浓度+未被延伸的底物浓度)；
(3)结果判定：如果待测核酸的延伸百分比小于对照核酸的延伸百分比，即可识别待测核酸为带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸；同时通过进一步用含N6-甲基腺嘌呤的核酸替代步骤(1)的对照核酸成为新的对照核酸进行实验，若二十分钟后待测核酸的延伸百分比远小于新的对照核酸的延伸百分比，即可识别待测核酸为带有N1-甲基腺嘌呤的核酸，若反应半分钟至两分钟内待测核酸的延伸百分比小于新的对照核酸的延伸百分比，两分钟后延伸百分比接近，即可识别待测核酸为带有N6-甲基腺嘌呤的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的引物的5’端修饰有FAM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述逆转录酶为M-MuLV逆转录酶。
5.一种利用三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸识别带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸的方法，其特征在于，具体包括：
(1)以三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸作为DNA合成的原料，在紧邻疑为N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的位点上游根据模板链序列设计一条长度为17-20bp的引物，加入精胺，在DNA聚合酶或逆转录酶作用下与核酸共孵育进行延伸反应，以将三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入序列，所述核酸为疑为含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的位点的待测核酸或对照核酸，所述对照核酸为对应位点不含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤、序列与待测核酸相近且其他位点含N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤水平与待测核酸相同的核酸；
(2)步骤(1)延伸产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析，经凝胶成像仪测定被延伸的底物浓度和未被延伸的底物浓度，得到延伸百分比，所述延伸百分比为：延伸百分比＝被延伸的底物浓度/(被延伸的底物浓度+未被延伸的底物浓度)；
(3)结果判定：如果待测核酸的延伸百分比小于对照核酸的延伸百分比，即可识别待测核酸为带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸；同时通过进一步在待测核酸中不加精胺，重复上述步骤(1)和(2)，获得的延伸百分比与步骤(2)中获得的待测核酸的延伸百分比进行比较，差异明显，且加入精胺的延伸百分比大于未加精胺的延伸百分比的待测样本，即可识别待测核酸为带有N1-甲基腺嘌呤的核酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的引物的5’端修饰有FAM。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述逆转录酶为M-MuLV逆转录酶。
9.权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述精胺的浓度为100μM-40mM。
10.三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸在制备识别带有N6-甲基腺嘌呤或N1-甲基腺嘌呤的核酸的检测试剂中的应用。
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