CN110101729A - 人参茎叶有效部位及其提取方法和降血糖应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人参茎叶有效部位及其提取方法和降血糖应用,属于药剂领域。其活性成分包括人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd,其中,Rg1含量为1%~30%,Re含量为10%~40%,Rb2含量为1%~20%,Rd含量为1%~30%,所述的百分比为各成分占人参皂苷有效部位的质量百分比;本发明还公开了人参茎叶有效部位的提取方法及其在治疗糖尿病中的应用。本发明可纠正糖代谢紊乱,降低空腹血糖,减低糖耐量受损,改善胰岛素抵抗和增加胰岛素敏感性,具有治疗或预防糖尿病及其并发症的功效。
Description
技术领域
本发明属于药剂领域,具体涉及一种人参茎叶有效部位及其提取方法和降血糖应用。
背景技术
根据IDF的最新统计,截至2018年,中国成年人糖尿病发病率11.6%,人数已达1.14亿人,居世界第一位,其中2型糖尿病占比90%,1型糖尿病占比5%。潜在糖尿病和糖耐量减低患者高达50%,约5亿人群。近年来糖尿病呈现出年轻化、高增长、高发病率、死亡率上升等趋势,必将给社会带来沉重的经济负担。目前对于糖尿病患者的药物治疗,1型糖尿病是胰岛素分泌绝对不足,患者只能用胰岛素替代治疗。而从目前临床所应用的治疗2型糖尿病的降糖药物来看,各种西药如双胍类、磺脲类、噻唑烷二酮类、格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、DPP-4抑制剂、SGLT-2抑制剂、GLP-1受体激动剂等都有一定的局限性和不良反应,甚至是很严重的不良反应,如导致低血糖、乳酸性酸中毒等。
治疗糖尿病一直是临床医学研究和新药开发的热点,鉴于西药治疗在取得疗效的同时往往给患者带来较大的毒副反应,而且在糖尿病并发症治疗方面,西药亦无优势。依据中医理论配伍的传统降糖药物如消渴丸、参芪降糖颗粒、金芪降糖片等,在治疗糖尿病并发症方面较西药有明显优势,但直接降糖效果弱于西药,且服用剂量大。因此开发安全有效、稳定可控、具有特殊临床价值的降糖新药仍具有广阔的市场前景。
CN201510481693.5——一种治疗糖尿病肾病的中药组合物及其制备方法。该中药组合物包括以下制备原料:辣木叶总黄酮、二苯乙烯苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、银杏内酯、山奈酚和槲皮素。该组合物具有协同作用,可为治疗糖尿病肾病的药物配伍使用。但该药物组方组分复杂,药效物质基础不够清晰明确。
CN201510481693.5——一种人参茎叶有效部位及其制备方法和用途。该人参茎叶有效部位的活性成分为人参皂苷Rg1和人参皂苷Re。具有有效成分明确、组分简单、质量可控性强等优点。但经我们更全面研究后发现除Rg1和Re外,Rb2和Rd同样具有良好的降糖效果,因此我们将Rg1、Re、Rb2和Rd作为人参茎叶有效部位中的降糖活性成分。
CN201510481693.5——一种丙二酰基人参皂苷的提取方法和治疗糖尿病肾病中的应用。以鲜人参或西洋参为原料,经纤维素酶酶解处理后,超声提取,提取液再经NKA-12吸附树脂分离,解吸液经葡聚糖凝胶除盐后得到丙二酰基人参皂苷。具有操作简单、快速、成本低廉等特点。动物实验证明丙二酰基人参皂苷对2型糖尿病肾病有着显著的预防和治疗作用。该专利与上述专利(CN201510481693.5)存在同样的技术问题即只验证了丙二酰基人参皂苷有效部位这个整体的降糖活性即对2型糖尿病肾病有着显著的预防和治疗作用,但并不清楚具体活性成分,存在质控不严和批次间质量不稳定的风险。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中人参茎叶在降血糖方面活性成分不清、降糖机理不明、效果一般等问题。我们利用已大规模成熟应用的超滤分离技术和柱层析纯化技术将人参茎叶有效部位内的单体分离纯化后进行动物药效试验,以确定活性成分,从而为后续在提取分离有效部位时富集活性成分提供了科学依据,这样得到的有效部位可以提高药效、降低副作用。本发明提供了一种人参茎叶有效部位及其提取方法和降血糖应用,具体公开了如下技术方案:
一种人参茎叶有效部位,其活性成分包括人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd,其中,所述Rg1、Re、Rb2和Rd各成分占人参茎叶有效部位的质量百分比分别为1%~30%、10%~40%、1%~20%和1%~30%;Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占人参茎叶有效部位的质量百分比≥80%;Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占人参茎叶提取物的质量百分比≥60%。
作为优选方案,所述Rg1、Re、Rb2和Rd各成分占人参茎叶有效部位的质量百分比分别为5%~15%、15%~30%、5%~20%和10%~30%;Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占人参茎叶有效部位的质量百分比≥80%;Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占人参茎叶提取物的质量百分比≥60%。
一种人参茎叶有效部位的提取方法,包括如下步骤:
a)提取:以鲜人参茎叶或人参茎叶干燥品为原料,切碎,用低级醇水溶液在50-90℃下回流提取1-3次,每次1-3h,每次加入10-40倍体积的提取溶剂(质量与体积比),合并提取液,提取液在50-80℃下减压回流,浓缩液即为人参茎叶提取液;所述人参茎叶提取液除了可通过人参茎叶提取得到外,也可以采用常规市售的人参茎叶提取液或市售的人参茎叶提取物溶解得到。
b)分离:将步骤a)所得的人参茎叶提取液用大孔吸附树脂分离提取,依次采用3-5倍柱体积的纯化水水洗和3-5倍柱体积的低级醇水溶液梯度洗脱,得到含人参皂苷的解吸液,然后将解吸液减压浓缩为水溶液;
c)超滤:将步骤b)所得的水溶液用高速离心机离心,取上清液用分子量截留为10-100KDa的超滤膜除杂,取透过液;
d)纯化:将步骤c)所得的超滤透过液用加压色谱层析填料进行各成分的纯化,依次采用不同浓度梯度的低级醇水溶液洗脱,以HPLC跟踪监测,收集含目标成分的解吸液;
或,
将步骤c)所得的超滤透过液用加压色谱层析填料进行各成分的纯化,采用含盐低级醇水溶液洗脱,将含活性皂苷部分的解吸液在加压色谱柱中除盐,解吸液减压浓缩,冷冻干燥得到含人参茎叶有效部位的提取物,其中Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占有效部位质量百分比≥80%;Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占提取物质量百分比≥60%。
本发明也可以采用常规手段制备得到具备如上所述特征的人参茎叶有效部位,或者采用市售人参茎叶提取物通过常规手段制备得到如上所述的人参茎叶有效部位,或者采用纯的人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd按比例混合得到。本发明人参茎叶有效部位中活性成分为人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd,四者相辅相成,具有协同增效作用,可以用于制备治疗和/或预防糖尿病及糖尿病并发症药物或保健品。
作为优选方案,步骤a)、b)和d)中,所述低级醇为碳原子≤5的醇,包括但不限于乙醇、乙二醇、异丙醇、丙酮、乙腈,该低级醇溶液浓度为30%-90%,所述百分比为质量百分比。
作为优选方案,所述步骤a)中优选以人参茎叶干燥品为原料,加入75%乙醇水溶液,在85℃加热回流提取2次,第一次提取2h,第二次提取1h,第一次和第二次乙醇水溶液量分别为人参茎叶质量的30倍和15倍,合并两次提取液,65℃减压浓缩得人参茎叶提取液。
作为优选方案,所述步骤b)中大孔吸附树脂是以苯乙烯和/或二乙烯苯为原料,以苯乙烯和/或丙酸酯为聚合单体,以乙烯苯和/或二乙烯苯为交联剂,甲苯、二甲苯为致孔剂相互交联聚合形成的具有多孔骨架结构的树脂,该大孔吸附树脂粒径为20~100目。所述大孔吸附树脂包含但不限于D101、X-5、AB-8、NK-2、NKA-2、NK-9、D3520、WLD等型号的大孔吸附树脂。
作为优选方案,所述步骤c)超滤膜元件结构采用卷式、管式、中空式、平板式;超滤膜片材质采用聚丙烯腈、聚砜、醋酸纤维、聚醚砜、磺化聚砜、聚酰亚胺、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚砜、氧化铝、氧化锆;超滤膜片截留分子量范围为10-100KDa。
作为优选方案,所述步骤d)中加压色谱层析填料以聚合物或硅胶为基质,优选的,该加压色谱层析填料为粒径为5-300μm的聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物,所述加压色谱层析填料包括但不限于UniPS、UniPMN、UniPSN、UniPSA、PS100、SKP、NM等聚合物反相填料。
作为优选方案,所述步骤d)中含盐醇水洗脱液所用缓冲盐为乙酸铵或乙酸钠或磷酸氢钠或氯化铵或碳酸氢钠中的一种或多种。
作为优选方案,本发明人参茎叶有效部位可以单独使用,也可以与其他类似活性成分结合,添加一种或多种药学上可接受的辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、甘露醇、葡萄糖、β-环糊精等混合制成各种剂型。例如可以制备成片剂、口服液、胶囊剂、丸剂、散剂、注射剂、颗粒剂、粉针剂等,优选剂型为经胃肠道给药的剂型如胶囊剂、片剂。
一种人参茎叶有效部位在制备用于治疗或预防糖尿病及糖尿病并发症药剂中的应用,所述糖尿病为非胰岛素依赖糖尿病即2型糖尿病。
一种人参茎叶有效部位在制备用于治疗或预防糖尿病并发症药剂中的应用,所述糖尿病并发症为伴随糖尿病直接或间接发生的全身性或局部疾病:所述糖尿病并发症为糖尿病酸中毒、糖尿病性黄瘤、糖尿病性肌萎缩、糖尿病性酮症、糖尿病性昏迷、糖尿病性胃病、糖尿病性坏疽、糖尿病性溃疡、糖尿病性腹泻、糖尿病性微血管病变、糖尿病性子宫体硬化、糖尿病性心肌病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性大疱症、糖尿病性白内障、糖尿病性皮肤病、糖尿病性硬肿症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性类脂质渐进性坏死、糖尿病性血液循环障碍。
人参(Panaxginseng)又名亚洲参,五加科(Araliaceae)人参属(Panax)多年生草本植物,主产我国东北三省和国外朝鲜半岛、日本福岛、前苏联东西伯利亚等地。人参根是我国传统的名贵中药,有“百草药王”之美称,其性平、味甘、微苦,有安精神、定魂魄、止惊悸、复脉固脱、补脾益肺、生津止渴之功效。人参根应用于中医临床已有2000多年历史,由于其具有广泛药理作用和医疗用途而受到国内外众多学者的重视。人参的主要有效成分为人参皂苷,近年来,化学、药理学和临床研究证明,人参茎叶所含人参皂苷的药理作用与人参根皂苷基本相同,且总皂苷含量明显高于人参根,约为6~12%。目前,已经从人参茎叶中先后得到近60个皂苷类化合物,主要包括人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rd2、Re、F1、F2、F3、F4、Rg1、Rg2、Rg3、Rg4、Rg7、Rh1、Rh3、Rh4、Rh5、Rh7等。人参皂苷具有多种药理活性,如抗心脑血管系统疾病、抗老年痴呆、抗糖尿病、增强免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抑制细胞凋亡等药理作用。
五加科植物为中国人参(Panaxginseng)、高丽参(P.SinensisJ.Wen)、西洋参(P.quiquefolius)、日本人参(P.japonicus)、越南人参(P.vientnamensis)、假人参(P.pseudoginseng)和三七(P.notoginseng)中的一种或多种。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果:
1.利用超滤分离技术和柱层析纯化技术将人参茎叶单体皂苷进行了分离纯化,并经动物实验验证,从而明确了降糖活性成分。
2.将人参茎叶中的活性皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd富集后形成新的降糖有效部位,其中Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占有效部位质量百分比≥80%;Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占提取物质量百分比≥60%,质量标准清晰、稳定、可控。
3.将所得含人参茎叶有效部位为主要成分的提取物进行动物药效实验,结果发现人参皂苷有效部位可降低空腹血糖和减低糖耐量,并有改善胰岛素抵抗和增加胰岛素敏感性的作用,从而证明人参皂苷为人参茎叶降血糖的物质基础。
4.本发明将人参茎叶降糖有效部位中的活性成分Rg1、Re、Rb2和Rd作为一个整体进行分离提取,所得有效部位性质稳定,质量可控性强,并且在降血糖方面具有协同增效作用,显著提高了产品蕴含的技术水平。
5.本发明人参茎叶有效部位具有活性成分明确、组分简单、产品稳定性好、服用量小、药效活性优等特点。生产工艺均采用业界已大规模成熟应用地现代工业化分离提取技术,具有较大的推广应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例4制备得到的人参茎叶有效部位HPLC图谱。
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步说明本发明的内容,但应该理解,具体实施例并不以任何方式限制本发明。
实施例1
(1)取切好的人参茎叶干燥品2kg(从药材批发市场采购),分别用60L和20L、浓度为30%的乙醇水溶液在50℃条件下提取2次,第一次1h,第二次1h,提取结束合并两次提取液用滤纸过滤,收集滤液,在50℃下减压浓缩成5L人参茎叶提取液。所述滤纸型号不限定。
(2)取步骤(1)中所得人参茎叶提取液,离心取上清液,上预处理好的D101大孔吸附树脂,树脂柱体积9L,先用水洗5个柱体积,再用70%乙醇水溶液解吸人参皂苷得解吸液27L,在65℃减压浓缩成6L水溶液。
(3)取步骤(2)所得6L浓缩水溶液12000rpm离心取上清液,用分子量截留为10KDa的管式聚醚砜超滤膜过滤除杂,并加纯化水顶洗得总计7.5L透过液。
(4)取步骤(3)所得7.5L透过液,上预处理好的UniPS40-300型聚合物色谱层析柱(甲基丙烯酸酯基质,苏州纳微科技有限公司)纯化,树脂柱体积5L,依次采用纯化水、45%乙醇水溶液洗脱,丢弃纯水洗脱下来的鞣质类杂质,以HPLC跟踪监测收集富含人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd的解吸液10L,解吸液减压浓缩冻干得人参茎叶提取物,以人参皂苷有效部位计,Rg1含量为28.1%、Re含量为15.1%、Rb2含量为18.7%、Rd含量为20.3%,总含量为82.2%;以提取物计,Rg1、Re、Rb2和Rd总含量为61.6%。
实施例2
(1)取切好的人参茎叶干燥品1.5kg(从药材批发市场采购),分别用60L和45L乙醇浓度90%的水溶液在90℃条件下提取2次,第一次3h,第二次3h,提取结束合并两次提取液用滤纸过滤,收集滤液,在65℃下减压浓缩成5L人参茎叶提取液。
(2)取步骤(1)中所得人参茎叶提取液,离心取上清液,上预处理好的AB-8大孔吸附树脂,树脂柱体积7L,先用水洗5个柱体积,再用70%乙醇水溶液解吸人参皂苷得解吸液21L,在65℃减压浓缩成4L水溶液。
(3)取步骤(2)所得4L浓缩水溶液12000rpm离心取上清液,用分子量截留为100KDa的管式聚偏二氟乙烯超滤膜过滤除杂,并加纯化水顶洗得总计5.2L透过液。
(4)取步骤(3)所得5.2L超滤透过液,上预处理好的PS100型聚合物色谱层析柱(苯乙烯基质,苏州纳微科技有限公司)纯化,树脂柱体积3L,依次采用纯水、45%乙醇3%乙酸钠水溶液洗脱,丢弃纯水洗脱下来的鞣质类杂质,以HPLC跟踪监测收集富含人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd的解吸液6L。
(5)将步骤(4)所得6L解吸液上预处理好的PS100型聚合物色谱层析柱(苯乙烯基质,苏州纳微科技有限公司),柱体积2L,10%乙醇溶液预洗除盐,80%乙醇水溶液解吸得富含人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd的解吸液2L,解吸液减压浓缩冻干得人参茎叶提取物,以人参皂苷有效部位计,Rg1含量为7.7%、Re含量为37.8%、Rb2含量为8.4%、Rd含量为27.3%,总含量为81.2%;以提取物计,Rg1、Re、Rb2和Rd总含量为60.9%。
实施例3
(1)取切好的人参茎叶干燥品2kg(从药材批发市场采购),分别用60L和20L、浓度为75%的乙醇水溶液在75℃条件下提取2次,第一次3h,第二次2h,提取结束合并两次提取液用滤纸过滤,收集滤液,在65℃下减压浓缩成3L人参茎叶提取液。
(2)取步骤(1)中所得人参茎叶提取液,离心取上清液,上预处理好的D101大孔吸附树脂,树脂柱体积9L,先用水洗5个柱体积,再用70%乙醇水溶液解吸人参皂苷得解吸液27L,在65℃减压浓缩成6.3L水溶液。
(3)取步骤(2)所得6.3L水溶液12000rpm离心取上清液,用分子量截留为50KDa的管式聚偏二氟乙烯超滤膜过滤除杂,并加纯化水顶洗得总计7.6L透过液。
(4)取步骤(3)所得7.6L超滤透过液,上预处理好的UniPS40-300型聚合物色谱层析柱(甲基丙烯酸酯基质,苏州纳微科技有限公司)纯化,树脂柱体积5L,依次采用纯化水、45%乙醇水溶液洗脱,丢弃纯化水洗脱下来的鞣质类杂质,以HPLC跟踪监测收集含人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd的解吸液,解吸液分别减压浓缩冻干得人参茎叶皂苷单体,以HPLC检测Rg1、Re、Rb2和Rd各单体纯度均大于90%。
实施例4
(1)取切好的人参茎叶干燥品1.5kg(从药材批发市场采购),分别用60L和45L乙醇浓度70%的水溶液在70℃条件下提取2次,第一次3h,第二次2h,提取结束合并两次提取液用滤纸过滤,收集滤液,在65℃下减压浓缩成5L人参茎叶提取液。
(2)取步骤(1)中所得人参茎叶提取液,离心取上清液,上预处理好的AB-8大孔吸附树脂,树脂柱体积7L,先用水洗5个柱体积,再用70%乙醇水溶液解吸人参皂苷得解吸液21L,在65℃减压浓缩成4.5L水溶液。
(3)取步骤(2)所得4.5L水溶液12000rpm离心取上清液,用分子量截留为50KDa的管式聚醚砜超滤膜过滤除杂,并加纯化水顶洗得总计5.6L透过液。
(4)取步骤(3)所得5.6L超滤透过液,上预处理好的PS100型聚合物色谱层析柱(苯乙烯基质,苏州纳微科技有限公司)纯化,树脂柱体积3L,依次采用纯化水、45%乙醇3%乙酸钠水溶液洗脱,丢弃纯化水洗脱下来的鞣质类杂质,以HPLC跟踪监测收集富含人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd的解吸液6L。
(5)将步骤(4)所得6L解吸液上预处理好的PS100型聚合物色谱层析柱(苯乙烯基质,苏州纳微科技有限公司),柱体积2L,10%乙醇水溶液预洗除盐,80%乙醇水溶液解吸得富含人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd的解吸液2L,解吸液减压浓缩冻干得人参茎叶提取物,以人参皂苷有效部位计,Rg1含量为15.0%、Re含量为29.9%、Rb2含量为17.6%、Rd含量为21.6%,总含量为84.1%;以提取物计,Rg1、Re、Rb2和Rd总含量为63.1%,其HPLC图谱如图1。
实施例5
(1)取市售人参茎叶提取物(UV>80%,芜湖艾森格生物技术有限公司)1kg,用4.5L纯化水溶解得人参茎叶提取物水溶液。
(2)取步骤(1)所得4.5L水溶液12000rpm离心,上清液用分子量截留为30KDa的管式聚偏二氟乙烯超滤膜过滤除杂,并加纯化水顶洗得总计5.5L透过液。
(3)取步骤(2)所得5.5L超滤透过液上预处理好的UniPS40-300型聚合物色谱层析柱(甲基丙烯酸酯基质,苏州纳微科技有限公司)纯化,树脂柱体积10L,依次采用纯化水、45%乙腈水溶液洗脱,丢弃纯化水洗脱下来的鞣质类杂质,以HPLC跟踪监测收集富含人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd的解吸液20L,解吸液减压浓缩冻干得人参茎叶提取物,以人参皂苷有效部位计,Rg1含量为13.2%、Re含量为27.7%、Rb2含量为16.3%、Rd含量为24.1%,总含量81.3%;以提取物计,Rg1、Re、Rb2和Rd总含量为60.9%。
实施例6
(1)取市售人参茎叶提取物(UV>80%,芜湖艾森格生物技术有限公司)1kg,用4L纯化水溶解得人参茎叶提取物水溶液。
(2)取步骤(1)所得4L水溶液12000rpm离心,上清液用分子量截留为80KDa的管式聚醚砜超滤膜过滤除杂,并加纯化水顶洗得总计5.0L透过液。
(3)取步骤(2)所得5.0L超滤透过液,上预处理好的中压C18反相层析柱(济南博纳生物技术有限公司),柱体积10L,依次采用纯化水、30%丙酮水溶液洗脱,丢弃纯化水洗脱下来的鞣质类杂质,收集富含人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd的解吸液20L,解吸液减压浓缩冻干得人参茎叶提取物,以人参皂苷有效部位计,Rg1含量为8.1%、Re含量为36.6%、Rb2含量为8.3%、Rd含量为29.2%,总含量为82.2%;以提物计,Rg1、Re、Rb2和Rd总含量为61.6%。
实施例7
对链脲霉素致2型糖尿病小鼠血糖的影响
10只昆明(KM)小鼠正常饮食作为空白组,80只小鼠摄取高脂肪高能量饮食,动物所处环境温度22~25℃。5周后,80只小鼠禁食不禁水,以40mg/kg剂量腹腔注射STZ(STZ溶于0.1M,pH4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中)。10只正常小鼠腹腔注射等量上述缓冲液。STZ注射小鼠高脂饮食饲养一周,然后禁食不禁水12小时后,眼球后静脉丛采血,于离心机3000rpm,4℃离心10min,分离血清,用葡萄糖试剂盒测定小鼠空腹血糖(FBG)。其中FBG≧11.1mmol/L的小鼠视为2型糖尿病模型小鼠,选取造模成功小鼠70只。取实施例3制备的人参皂苷单体Rg1、Re、Rb2、Rd和实施例4制备的人参茎叶提取物,将成模小鼠随机分为模型组、人参皂苷Rg1组(60mg/kg)、人参皂苷Re组(60mg/kg)、人参皂苷Rb2组(60mg/kg)、人参皂苷Rd组(60mg/kg)、人参茎叶提取物组(60mg/kg)和二甲双胍组(200mg/kg)。各组小鼠每天可自由饮水和正常进食,每天灌胃给药一次,持续四周,每周尾静脉取血测血糖(见表1)。结果表明,与空白组比较,模型组小鼠血糖明显升高(p<0.01),灌胃4周后,与模型组比较200mg/kg二甲双胍对小鼠降血糖作用明显,标明模型成功。灌胃4周后,提取物组降糖作用明显且与模型组比较有显著性差异(p<0.01),由图1可知提取物中皂苷含量大于80%,说明人参皂苷为降血糖有效部位。人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd降血糖活性与模型组相比有显著性差异,证明Rg1、Re、Rb2和Rd为活性成分。提取物组活性优于单体皂苷,说明活性成分有协同增效作用。
表1.单体皂苷及人参茎叶提取物对STZ致2型糖尿病小鼠血糖的影响(x±s,n=10)
模型组与空白组比较#p<0.01,给药组与模型组比较*p<0.05,**p<0.01。
实施例8
对db/db2型糖尿病小鼠血糖、口服糖耐量及胰岛素抵抗的影响
10只C57BL/6J小鼠作为空白对照组,40只db/db2型糖尿病小鼠按照空腹血糖随机分为模型组、二甲双胍组、人参茎叶提取物高、中、低剂量组,共5组,每组8只小鼠,分组后空腹血糖均值差异不超过2mmol/L。
空白对照组和模型组灌胃给予蒸馏水0.1ml/10g,每天1次,二甲双胍组小鼠每天给予250mg/kg,取实施例4制备的人参茎叶提取物分成高、中、低剂量组分别每天给予200mg/kg,100mg/kg、50mg/kg,连续给药四周。
每周测体重并剪尾法测空腹血糖。给药4周后测定口服糖耐量,实验结束前10min摘眼球取血,葡萄糖氧化酶测定血糖,放射免疫法测血清胰岛素。
胰岛素抵抗指数计算公式:
表2.人参茎叶提取物对db/db小鼠血糖的影响(x±s,n=8)
模型组与空白组比较#p<0.01,给药组与模型组比较*p<0.05,**p<0.01。
表3.人参茎叶提取物对db/db小鼠糖耐量减低和胰岛素抵抗的影响(x±s,n=8)
模型组与空白组比较#p<0.01,给药组与模型组比较*p<0.05,**p<0.01,AUC为血糖曲线下面积。
由图1可知,人参茎叶提取物中人参皂苷为主要化学成分。以人参茎叶有效部位计,Rg1、Re、Rb2和Rd含量分别为15.0%、29.9%、17.6%、21.6%,总含量为84.1%,占有效部位含量大于80%;以提取物计,Rg1、Re、Rb2和Rd总含量为63.1%,大于60%,从而证明本发明制备所得提取物作为新药原料符合新药申报相关法规的要求。
由表2、表3和图1可知,本发明工艺制备所得人参茎叶皂苷有效部位能明显降低db/db动物模型鼠的空腹血糖,减低葡萄糖耐量,改善动物模型的胰岛素抵抗状态,提高机体对胰岛素的敏感性,且随着剂量的增加,其效果越明显,呈一定剂量依赖关系。
Claims (14)
1.一种人参茎叶有效部位,其特征在于,其活性成分包括人参皂苷Rg1、Re、Rb2和Rd,其中,所述Rg1含量为1%~30%,所述Re含量为10%~40%,所述Rb2含量为1%~20%,所述Rd含量为1%~30%,所述的百分比为各成分占人参茎叶有效部位的质量百分比;Rg1、Re、Rb2和Rd总含量≥80%,所述的百分比为各成分总质量占人参茎叶有效部位的质量百分比;Rg1、Re、Rb2和Rd总含量≥60%,所述的百分比为各成分总质量占人参茎叶提取物的质量百分比。
2.根据权利要求1所述的人参茎叶有效部位,其特征在于,所述Rg1含量为5%~15%,所述Re含量为15%~30%,所述Rb2含量为5%~20%,所述Rd含量为10%~30%,所述的百分比为各成分占人参茎叶有效部位的质量百分比;Rg1、Re、Rb2和Rd总含量≥80%,所述的百分比为各成分总质量占人参茎叶有效部位的质量百分比;Rg1、Re、Rb2和Rd总含量≥60%,所述的百分比为各成分总质量占人参茎叶提取物的质量百分比。
3.一种如权利要求1或2所述的人参茎叶有效部位的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)提取:以鲜人参茎叶或人参茎叶干燥品为原料,切碎,用低级醇水溶液在50-90℃下回流提取1-3次,每次1-3h,每次加入10-40倍体积的提取溶剂,合并提取液,提取液在50-80℃下减压回流,浓缩液即为人参茎叶提取液;
b)分离:将步骤a)所得的人参茎叶提取液用大孔吸附树脂分离洗脱,依次采用3-5倍柱体积水洗和3-5倍柱体积的低级醇水溶液梯度洗脱,得到含人参皂苷的解吸液,然后将解吸液减压浓缩为水溶液;
c)超滤:将步骤b)所得的水溶液高速离心,取上清液用分子量截留为10-100KDa的超滤膜除杂,取透过液;
d)纯化:将步骤c)所得的超滤透过液用加压色谱层析填料进行各成分的纯化,采用不同浓度梯度的低级醇水溶液洗脱,以HPLC跟踪监测,收集含目标成分的解吸液;
或,
将步骤c)所得的超滤透过液用加压色谱层析填料进行各成分的纯化,采用含盐低级醇水溶液洗脱,将含活性皂苷部分的解吸液在加压色谱柱中除盐,解吸液减压浓缩,冷冻干燥得到含人参茎叶有效部位的提取物,其中Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占有效部位质量百分比≥80%;Rg1、Re、Rb2和Rd总质量占人参茎叶提取物的质量百分比≥60%。
4.如权利要求3所述的人参茎叶有效部位的提取方法,其特征在于,所述步骤a)、b)和d)中低级醇为碳原子≤5的醇,该低级醇水溶液浓度为30%-90%,所述百分比为质量百分比。
5.如权利要求4所述的人参茎叶有效部位的提取方法,其特征在于,所述低级醇为乙醇、丙酮和乙腈。
6.如权利要求3所述的人参茎叶有效部位的提取方法,其特征在于,所述步骤a)中优选以人参茎叶干燥品为原料,加入75%乙醇水溶液,在85℃加热回流提取2次,第一次提取2h,第二次提取1h,第一次和第二次乙醇水溶液量分别为人参茎叶质量的30倍和15倍,合并两次提取液,65℃减压浓缩得人参茎叶提取液。
7.如权利要求3所述的人参茎叶有效部位的提取方法,其特征在于,所述步骤b)中大孔吸附树脂是以苯乙烯和/或二乙烯苯为原料,以苯乙烯和/或丙酸酯为聚合单体,以乙烯苯和/或二乙烯苯为交联剂,甲苯、二甲苯为致孔剂相互交联聚合形成的具有多孔骨架结构的树脂,该大孔吸附树脂粒径为20~100目。
8.如权利要求3所述的人参茎叶有效部位的提取方法,其特征在于,所述步骤c)中超滤膜元件结构采用卷式、管式、中空式、平板式;超滤膜片材质采用聚丙烯腈、聚砜、醋酸纤维、聚醚砜、磺化聚砜、聚酰亚胺、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚砜、氧化铝、氧化锆;超滤膜片截留分子量为10-100KDa。
9.如权利要求3所述的人参茎叶有效部位的提取方法,其特征在于,所述步骤d)中加压色谱层析填料以聚合物或硅胶为基质,优选的,该加压色谱层析填料为粒径为5-300μm的聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物。
10.如权利要求3所述的人参茎叶有效部位的提取方法,其特征在于,所述步骤d)中含盐醇水洗脱液所用缓冲盐为乙酸铵或乙酸钠或磷酸氢钠或氯化铵或碳酸氢钠中的一种或多种。
11.一种如权利要求1或2所述的人参茎叶有效部位在制备用于治疗或预防糖尿病和/或糖尿病并发症药剂中的应用。
12.如权利要求11所述的人参茎叶有效部位在制备用于治疗或预防糖尿病和/或糖尿病并发症药剂中的应用,其特征在于,所述糖尿病为非胰岛素依赖糖尿病;所述糖尿病并发症为伴随糖尿病直接或间接发生的全身性或局部疾病,优选的,所述糖尿病并发症为糖尿病酸中毒、糖尿病性黄瘤、糖尿病性肌萎缩、糖尿病性酮症、糖尿病性昏迷、糖尿病性胃病、糖尿病性坏疽、糖尿病性溃疡、糖尿病性腹泻、糖尿病性微血管病变、糖尿病性子宫体硬化、糖尿病性心肌病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性大疱症、糖尿病性白内障、糖尿病性皮肤病、糖尿病性硬肿症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性类脂质渐进性坏死、糖尿病性血液循环障碍。
13.如权利要求11所述的人参茎叶有效部位在制备用于治疗或预防糖尿病和/或糖尿病并发症药剂中的应用,其特征在于,所述药剂剂型为胶囊剂或片剂。
14.如权利要求11所述的人参茎叶有效部位在制备用于治疗或预防糖尿病和/或糖尿病并发症药剂中的应用,其特征在于,所述药剂完全由人参茎叶有效部位或人参茎叶有效部位与淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、甘露醇、葡萄糖、β-环糊精一种或多种物质混合制成。
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