CN110088266A - 检测生物样品中的遗传物质的方法及其实施设备 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是检测生物样品中遗传物质的方法，其中在将反应盒(6)置于控制设备中之后或之前，将生物样品加载至反应盒(6)中，将收集的生物样品带至取分离室(7)中，通过加热分离室(7)从测试样品中分离生物材料，将经分离的遗传物质移入多个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，通过加热反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)来扩增遗传物质，用于遗传物质扩增的冻干的试剂连同嵌入遗传物质的冻干的荧光标签存在于反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)中，以及与遗传物质扩增阶段一起进行来自荧光标签的信号检测。

Description

检测生物样品中的遗传物质的方法及其实施设备
本发明的目的是检测生物材料样品中的遗传物质(包括DNA和RNA)的方法，尤其是使用用于扩增遗传物质的LAMP技术(环介导等温扩增)及其实施设备。本发明的目的是用于快速且移动检测所获得的生物材料中的细菌、病毒和真菌病原体。
目前，需要快速、廉价和有效的诊断方法来鉴定可能是如食品的微生物污染物中的细菌、病毒和真菌病原体。
美国专利申请US2009061450A1公开了用于诊断和测定呼吸病原体的设备，包括鼻采样设备、用于靶核酸扩增的单入口一次性微流体盒以及具有机载测定控制平台和靶标检测装置的仪器。用于采样的设备是将样品载体放置在微流体盒中的适当插座中，使得它们彼此密封地且流体地连接。在微流体盒中可以区分许多腔室，其中进行病原体测定方法的后续步骤，其中第一阶段包括从测试样品中分离遗传物质，然后将经分离的材料扩增并进行检测。在引用的解决方案的一个实施方案种，遗传物质的扩增使用LAMP方法实现。在其中发生扩增的反应室中，有必要提供经设定且稳定的温度，其在所呈现的解决方案中通过印刷在微流体设备上的ITO加热元件实现。在进行遗传物质扩增之后添加嵌入遗传物质的荧光标签，从而进行实时光学检测。
而美国专利申请US2012264132A1公开了处理样品的设备和方法，包括基本上等温扩增的核酸。根据所引用的发明的设备包括具有第一群体区域的第一基板(所述第一群体的至少一个区域具有至少一个设置在至少一个区域附近的卫星区域)，和至少一个适于保留来自第一区域的材料的卫星区域。设备另外包括其中形成有第二群体区域的第二基板，所述第一和第二基板彼此啮合使得第一和第二基板之间的相对运动将第一群体区域中的至少一些与第二群体区域中的至少一些对齐，使得它们彼此流体连通。使用所提及的设备扩增遗传物质包括使设置在多个第一区域中的样品材料(所述样品材料包含核酸靶标并且第一区域中的至少一个含有一个核酸靶分子)与设置在多个第二区域中的反应物材料接触，所述接触通过将至少一些第一区域和至少一些第二区域成对放置成彼此直接流体连通来实现。所述材料的接触实现了核酸靶分子的扩增。
美国专利申请US20140335527A1公开了用于移动分析核酸和蛋白质的系统和方法。移动分析系统是一种小型无线设备，经由显示器和键盘与使用的设备进行通信。移动分析系统使用连接模块从样品中提取、扩增和检测核酸。整个过程与数据处理一起通常费时不超过20分钟。在遗传物质的分析方法的第一阶段中，将生物样品加载至集成芯片上。生物样品的加载可以通过样品进入口或通过自动采样手动完成。在集成芯片中，将样品输送到提取模块，在该提取模块中进行从生物样品中提取遗传物质的过程。然后将经分离的核酸输送至扩增模块，其中在一个实施方案中使用LAMP方法进行扩增。提取和扩增方法含有进行它们所需的所有试剂。扩增需要保持设定的温度升高，这可以通过红外线加热元件来实现。经扩增的遗传物质进入检测模块，在所述检测模块中例如通过来源于附接至经检测的DNA的适当标签的荧光信号来检测它。因此，遗传物质扩增的腔室中的一个可预加载有如荧光标记的LAMP主混合物。整个集成芯片是透明的，允许光束传输以加热各个模块并检测荧光信号。
要解决的技术问题是提供检测生物材料样品中的遗传物质(尤其是DNA和/或RNA)的方法及其实施设备，其允许快速检测优选的病原体，同时，设备将易于制造、完整、可移动、制造相对便宜并且将允许反应盒长时间存储且不会与特定的储存条件如非常低的温度相关。对于作为用于检测生物材料样品中的病原体的设备的一部分的反应盒也优选的是适用于处理并且设备本身具有有限的能量消耗。此外，优选的是，所开发的病原体检测方法减少了所需的步骤数，使得实施更简单和更快，并且用于其实施的设备的构造提供了降低的生物材料样品污染风险。令人惊讶的是，上述问题已通过所示发明解决。
本发明的第一个目的是检测生物样品中遗传物质的方法，其包括以下阶段：
a)在将反应盒置于测量设备中之后或之前，将生物样品加载至反应盒中
b)将收集的生物样品带至取分离室中，
c)通过加热分离室从测试样品中分离生物材料，
d)将经分离的遗传物质移入多个反应室，
e)通过加热反应室来扩增遗传物质，
其特征在于在至少一个反应室内部存在用于遗传物质扩增的冻干试剂连同荧光染料，其包括能结合待检测的遗传物质的荧光染料或量子点，而与遗传物质扩增阶段同时记录来自发光标记物的发光信号的检测。
在本发明的优选的实施方案中，生物样品取自采样系统，并且通过将采样系统加载至反应盒(6)中来进行阶段a)。
在本发明的另一个优选的实施方案中，加热分离室和/或反应室通过具有温度检测器的LED上的多个加热单元进行，优选发射波长范围在350nm至530nm内的电磁辐射。
在本发明的另一个优选的实施方案中，具有温度检测器的LED的加热单元包括光学温度检测器，其检测波长范围为4μm至12μm的电磁辐射。在本发明的另一个优选的实施方案中，使用采样系统中的毛细管的毛细力获取生物样品。
优选地，用于遗传物质扩增的冻干的试剂包括脱氧核苷酸、特异性引物序列、反应缓冲液、镁离子Mg2+(优选呈MgSO4的形式)、能够进行扩增反应的聚合酶(优选Bst 3.0聚合酶)。
同样优选地，嵌入所检测的遗传物质的冻干的荧光标签是SYBR Green。
对于检测，根据本发明的第一方面和第二方面，实时检测在5'端附接有量子点分子和在3'端附接有猝灭剂的核酸扩增产物以及终点技术寡核苷酸。所使用的寡核苷酸的序列与位于所设计的引物F1和B1c之间的脱氧核糖核酸片段的扩增区域部分互补，并且对于位于所设计的引物F1c和B1之间的核酸片段的扩增区域部分是互补的。在扩增反应期间，使用具有链置换活性和5'>3'外切核酸酶活性的聚合酶，如全长Bst DNA聚合酶。
在脱氧核糖核酸扩增反应期间，探针与经扩增的DNA片段中的互补片段结合，在扩增子延伸期间，由于聚合酶的外切核酸酶性质，附接的寡核苷酸被降解，导致猝灭剂与量子点分离。作为量子点与猝灭剂分离的结果，在用对生成量子点的材料有特异性的辐射波长来激发量子点之后，电磁辐射在UV、IR或VIS范围内发射。发射的信号由光敏元件记录。
量子点的使用导致检测阈值的显著降低，这是由于使用具有更高功率的激发光源的可能性，由此可能记录来自小得多的量的释放的量子点的电磁辐射的发射。此外，使用量子点来标记寡核苷酸片段允许激发波长与其中发生电磁辐射检测的发射信号的波长更好地分离。更重要的是，与传统的荧光染料相比，量子点具有提高的漂白耐久性，这有利于在整个扩增反应期间进行检测。更优选地，反应盒包括三个反应室，包括包含针对测试的遗传物质的特异性引物的测试室、含有对生物材料样品来源的遗传物质的特定部分有特异性的引物的阳性对照室、和含有反应组分且无引物的阴性对照室。
在本发明的优选实施方案中，在俯视图中的反应室是圆形的，互补的并在中间用阀或隔膜相互连接。
在本发明的另一个优选的实施方案中，在阶段c)，将分离室加热至95℃持续5分钟至10分钟。
在本发明的又一个优选的实施方案中，在阶段e)，将分离室加热至65℃持续15分钟至60分钟。
优选地，阶段b)通过第一泵完成，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的水箱形式或活塞和波纹管的第一泵完成。
同样优选地，步骤d)通过第二泵完成，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的中空室形式的第二泵完成。
更优选地，该方法另外包括将反应盒加热至高于100℃的温度的阶段，优选通过具有温度检测器的LED上的多个加热单元来加热。
本发明的第二个目的是用于检测生物样品中的遗传物质的设备，其包括反应盒和测量设备，所述测量设备包括测量室，所述测量室具有容纳反应盒的插座，其中反应盒包括用于分离遗传物质的分离室，所述分离室通过通道与用于扩增分离的遗传物质的反应室连接，其特征在于，在至少一个反应室内部存在用于扩增遗传物质的冻干试剂连同发光染料，其包括能结合待检测的遗传物质的荧光染料或量子点，而与遗传物质的扩增阶段同时记录来自发光标记物的发光信号的检测。
在本发明的优选实施方案中，设备包括可拆卸的采样系统和反应盒，所述可拆卸的采样系统包括插头，并且反应盒包括适合插头并提供采样系统与反应盒之间的稳定且紧密的流体连通的插座。
在本发明的另一个优选的实施方案中，设备还包括用于成像控制和分析的测量模块、通信模块、电源模块和显示器模块。
在本发明的另一个优选的实施方案中，测量设备包括具有温度检测器的LED上的多个加热单元，其优选发射波长在350nm至530nm范围内的电磁辐射，与分离室和反应室基本上相对地排列，使得由所述多个LED发射的光束照亮所述分离室和反应室。
在本发明的另一个优选的实施方案中，具有温度检测器的LED的加热单元包括光学温度检测器，其检测波长范围为4μm至12μm的电磁辐射。
优选地，在俯视图中的反应室是圆形的，互补的并在中间用阀或隔膜相互连接。
同样优选地，采样系统包括采集生物样品的毛细管，所述毛细管与第一泵连接，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的水箱形式或活塞和波纹管的第一泵连接。
更优选地，用于遗传物质扩增的冻干试剂包括脱氧核苷酸、特异性引物序列、反应缓冲液、镁离子Mg2+，优选呈MgSO4形式、能够进行扩增反应的聚合酶，优选Bst 3.0聚合酶。
在本发明的优选的实施方案中，嵌入所检测的遗传物质的冻干的荧光剂是SYBRGreen。
在本发明的另一个优选的实施方案中，反应盒包括三个反应室，其包括包含针对所测试的遗传物质的特异性引物的测试室，含有对生物材料样品所来源的遗传物质的特定部分有特异性的引物的阳性对照室，和含有反应组分但没有引物的阴性对照室。
在本发明的又一个优选的实施方案中，反应盒包括第二泵，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的中空室形式的第二泵，引起分离的遗传物质从分离室移动至反应室。优选地，反应盒和/或采样系统由疏水性聚合物制成并且是完全被动系统。
同样优选地，反应盒中的分离室和反应室以及第二泵分别包括在入口通道和出口通道的阀、优选光学阀。更优选地，在连接分离室与第二泵的通道中，存在液体检测器，优选反射红外液体检测器。
在本发明的优选的实施方案中，液体检测器，优选反射红外液体检测器，位于来自反应室的出口通道中。
在本发明的另一个优选的实施方案中，测量室具有范围为4℃至40℃的受控等温温度，其由加热系统，优选Peltier组件形式的加热系统实现。
在本发明的另一个优选的实施方案中，加热系统包括连接的风扇和散热器，并且空气混合轮位于测量室中。
优选地，测量室用热绝缘进行绝缘。同样优选地，设备包括反应盒的定位机构。
更优选地，设备包括对反应盒中的泵施加压力的压力设定机构和反向设定的压力传感器。
在本发明的优选的实施方案中，设备包括照亮检测区的另外的UV LED。
在本发明的另一个优选的实施方案中，设备包括用于操作液体检测器和阀的另外的LED。
在本发明的另一个优选的实施方案中，在分离室和/或反应室的底部存在吸收光子能的吸收层，所述吸收层优选由用氧化物(优选染黑的Al2O3)涂覆的Cu或Al制成。
根据本发明的检测生物样品中的遗传物质的方法允许通过将生物材料样品放置在设备中来避免需要修饰生物材料样品，降低污染的可能性并且允许用户(仅由最终用户)进行测试。此外，完成测试不需要另外的实验室设备或无菌反应制备条件。另外，在反应组分的生产过程中，冻干提供了反应盒的有用性的显著增加(甚至从制造日期起超过一年)，并且不必将反应盒冷藏储存。将对扩增的核酸片段有特异性的引物放置在反应室内额外降低了步骤对污染的易感性，并进一步促进了最终用户的研究。此外，将染料放置在反应室中使得能够立即检测所得反应产物而无需最终用户采取行动，并且通过减少所需步骤的数量而显著简化整个检测过程。反应盒以及采样系统由一种聚合物材料制成完全被动组件，使它们能够被环境安全地处理，有利于环境。此外，用于加热控制设备中使用的分离室和反应室的LED减少了整个过程的能量消耗。
本发明的示例性实施方案示于附图的图中，其中图1、图6显示了根据本发明的一个实施方案的采样系统和反应盒的示意图，图2、图7显示了根据本发明的另一个实施方案的反应盒，图3显示了根据本发明的又一个实施方案的反应盒，图4显示了用于反应盒的不同实施方案中的阀的各种实施方案，而图5显示了根据本发明的一个实施方案的测量设备的方框图。
实施例1
根据本发明的实施方案的用于检测生物样品中的遗传物质的设备部分地在图1中示意性地示出(没有测量设备)，并且在图6中示出其变型。通过体积不超过1ml的毛细管力(在图1所示的实施方案中，体积为10μl)，将使用采样系统1取得的生物材料样品(如毛细血管血液、全血、唾液、体腔液)引入由涂覆有抗凝剂层的亲水性聚合物(如柠檬酸钠、EDTA)制成的反应盒6中。在填充毛细管2之后，通过通道末端的标签(未示出)，例如通过观察填满控制窗口的通道或通过光和/或声音信号向终端用户发信号，生物材料由离开含有旨在用于分子诊断的水的室的流体的压力进行输送。
生物材料和水的混合物在其末端从毛细管2穿过进入分离室7。在分离室7中，存在Chelex 100固定的离子交换树脂或其他能够结合遗传物质扩增反应的抑制剂的材料。在混合物穿过后，将分离室7的内含物加热至70℃或更高超过5分钟。此时，存在细胞的热裂解，并且在一些情况下，还存在包含在生物材料中的病毒核衣壳的热裂解，从而从其内部释放遗传物质。根据病原体的类型，温度可以增加至98℃。在加热过程结束时，将混合物冷却(被动地或主动地，如通过流过风扇的空气流)并且以至少0.1μl的体积移动至至少一个反应室8.1、8.2、8.3、8.4(在图1和图6所示的实施方案中，反应室8.1、8.2、8.3、8.4具有20μl的体积)，含有进行特异性等温扩增反应并检测在反应期间扩增的选定遗传物质片段所必需的适当量的物质的冻干物位于其中。在反应组分的产生过程中，冻干使反应盒的有用性显著增加(甚至从制造日期起超过一年)，并且不必将反应盒冷藏储存。反应室8.1、8.2、8.3、8.4还容纳了嵌入DNA的冻干染料。将染料放置在反应室中能够立即检测所得的反应产物而无需最终用户采取行动。根据所使用的荧光染料，引起嵌入染料的光的长度是不同的。用于标记的染料产生可见光。嵌入DNA的荧光染料(例如，SYBR Green、EvaGreen、PikoGreen、溴化乙锭、钙黄绿素、吖啶橙、原黄素、吖啶黄和其他)用于检测扩增反应产物。
对于检测，根据本发明的第一和第二方面，实时检测在5'端附接有量子点分子和在3'端附接有猝灭剂的核酸扩增产物以及终点技术寡核苷酸。所使用的寡核苷酸的序列与位于设计的引物F1和B1c之间的脱氧核糖核酸片段的扩增区域的部分互补，并且对于位于设计的引物F1c和B1之间的核酸片段的扩增区域的部分是互补的。在扩增反应期间，使用具有链置换活性和5'>3'外切核酸酶活性的聚合酶，如全长Bst DNA聚合酶。
在脱氧核糖核酸扩增反应期间，探针结合至扩增的DNA区段中的互补片段，在扩增子延伸期间，由于聚合酶的外切核酸酶性质，附接的寡核苷酸被降解，导致猝灭剂与量子点分离。作为量子点与猝灭剂分离的结果，在用对生成量子点的材料有特异性的辐射波长来激发量子点之后在UV、IR或VIS范围内发射电磁辐射。发射的信号由光敏元件记录。
量子点的使用导致检测阈值显著降低，这是由于使用具有更高功率的激发光源的可能性，由此可能记录来自小得多的量的释放的量子点的电磁辐射的发射。此外，使用量子点来标记寡核苷酸片段允许激发波长与其中发生电磁辐射检测的发射信号的波长更好地分离。更重要的是，与传统的荧光染料相比，量子点具有增加的漂白耐久性，这有利于在整个扩增反应期间进行检测。
为了扩增特异性反应产物，可以使用以下等温扩增技术：环介导的等温扩增(LAMP)；链置换扩增(SDA)；解旋酶依赖性扩增(HDA)；切口酶扩增反应(NEAR)。冻干物包含实验量的脱氧核苷酸(dNTP)，特异性引物序列，反应缓冲液组分，镁离子Mg2+；能够进行扩增反应的聚合酶，在一些情况下，以及逆转录酶和扩增遗传物质的选定序列所必需的其他组分。具有对给定病原体的基因组具有特异性的独特序列的一组引物(至少一对引物)决定了反应的特异性。将来自分离室7的水连同溶解在其中的材料一起加载至反应室8.1、8.2、8.3、8.4中。
选定核酸片段的扩增过程在反应室8.1、8.2、8.3、8.4中在至少40℃的恒定温度下进行最少5分钟。特异性引物序列结合至源自生物材料中存在的各种病原体的模板DNA(在分离前室7中分离)。如果生物材料是RNA，则使用所谓的随机引物在扩增过程之前进行逆转录，得到cDNA。一旦由引物确定了特异性，DNA聚合酶就合成了互补链。在LAMP过程中，接收约30μg/μl的DNA。通过嵌入遗传物质的染料显示出如此大量的双链DNA。通过向冻干物中加入荧光染料，染料与DNA结合，与其在反应期间的扩增同时发生。完成反应后，将反应混合物用激发以荧光为基础的嵌入DNA的染料的特定波长的光照亮。通过使用光电导体单元记录由染料和对所用染料有特异性的双链DNA复合物发射的波长来实现反应产物的检测。反应盒6的构成和制造它的材料(即透明聚合物)允许光的透射既发出染料-DNA复合物，又发出该复合物发射的光。结果则基于光的存在或不存在来进行解释(阳性结果-当前有光，阴性-无光)。
实施例2
在本实施方案中，用于检测生物样品中的遗传物质的设备通常包括三个主要元件，即测量设备(以图5中以方框图的形式示出)、反应盒6和采样系统1。图1示意性地显示了反应盒6和采样系统1的一个非限制性实施方案的构造。连接的采样系统1和反应室6排列在测量设备中，其经设计以引导和控制遗传物质分析的整个过程。测量设备采用小型移动设备的形式，如移动电话，其包括容纳反应盒6的插座。
采样系统1包括连接至水室的血液收集毛细管2，所述水室是通过连接至压力产生室的隔膜封闭的水箱。此类系统用作从水室通过具有采样的生物材料的毛细管2来产生压力施加水的第一泵1。采样系统1的适当操作提供了通气口3，其形成了毛细管2和共同控制阀Z1和Z2的分支。在使用期间，采样系统1与液体生物材料(如血液)接触，其中毛细管2在毛细管力的作用下填充。当用生物材料填充毛细管2时，阀Z1打开和阀门Z2关闭以确保系统正常运行。在用生物材料填充毛细管2之后，将采样系统1放置在反应盒6中。通过匹配采样系统1中的插头4和反应盒6中的插座5来提供了这些元件的紧密且稳定的连接。这个插头4与插座5的连接提供了采样系统1和反应盒6之间稳定且密封的流体连通。在将采样系统1放置于反应盒6中之后，阀Z1关闭，阀Z2打开，并且第一泵P1的激活(即用连接至压力产生室的隔膜关闭的水箱)。通过室的机械压缩发生第一泵P1的激活。在这种情况下，第一泵P1的激活方法是非限制性的，并且现有技术中已知的任何方法都可以用于输送液体，如用LED加热具有高热膨胀系数的物质。该操作将来自毛细管2的生物材料与来自水室的水一起除去。水和生物材料的混合物通过适合的通道输送至分离室7。在分离室7中，存在能够结合遗传物质的扩增反应的抑制剂的材料，并且分离室7可以进入水室。收集的生物材料被提供到该分离室7中。这一分离室的容量为约100μl。存在用连接至压力产生室的隔膜封闭的中空室的连接通道，其形成从分离室7延伸的第二压力产生泵P2。分离室7通过反射红外液体检测器D1和常开阀Z3连接至第二泵P2。第二P2泵继而通过常开阀Z4与位于反应盒6的末端处的通风口9(与插座5相对)连接。阀Z3和阀Z4的此类构造允许生物材料和水的混合物通过分离室7进一步朝向第二泵P2引入。当测试混合物到达液体检测器D1时，分离室7发出其填充信号并且Z11和Z3阀关闭。然后，将分离室7中的生物材料加热至适合的温度持续特定的时间段，这导致包封在细胞/蛋白包膜中的遗传物质释放。
在完成从分离遗传物质与收集的样品阶段之后，打开阀Z3、Z5、Z6和Z7并激活第二泵P2。阀Z5、Z6和Z7位于将分离室7连接到相应的反应室8.1、8.2、8.3、8.4的单独通道上。每个反应室8.1、8.2、8.3、8.4继而分别经由液体检测器D1、D2、D3并且分别经由常开阀Z8、Z9、Z10与位于反应盒6边缘的相应的通气口9连接。第二泵P2的激活连同阀Z5、Z6、Z7和Z8、Z9、Z10的构造允许将分离的遗传物质移动至反应室8.1、8.2、8.3、8.4中。从D1、D2、D3液体检测器收到信号后，阀Z8、Z9、Z10关闭。然后，阀Z5、Z6和Z7接下来关闭。以这种方式，反应室8.1、8.2、8.3、8.4填充有分离的遗传物质。反应室8.1、8.2、8.3、8.4在其体积中含有冻干的试剂，其含有扩增遗传物质所必需的所有必要成分。反应室8.1、8.2、8.3、8.4中的主混合物也包含嵌入遗传物质的冻干的荧光染料。反应室8.1、8.2、8.3、8.4的容量为20μl至25μl。在本实施方案中，提供了三个反应室8.1、8.2、8.3、8.4，包括包含针对所测试的遗传物质的特异性引物的测试室8.1，含有对生物材料样品所来源的遗传物质的特定部分有特异性的引物的阳性对照室8.2，和不含有引物但含有其他反应组分的阴性对照室8.3。阳性对照室8.2经设计用于控制聚合酶、温度条件和遗传物质的分离。阴性对照室8.3允许控制冻干过程(如无菌性)和控制阀行为，这可能导致这些反应室的内含物混合。当然，所使用的室的数量不是对本发明的限制，并且本领域技术人员将例如使用室8.1、8.2、8.3、8.4的数量同时增加来同时分析不同的病原体。
为了扩增遗传物质，然后将反应室8.1、8.2、8.3、8.4加热至扩增遗传物质的适当温度。与扩增同时(或随后)，从所使用的荧光标签检测到的荧光信号附着于扩增的遗传物质。产品增量等于所用荧光标签产生的光强度的增加。
在整个过程并且用具有照相机28的光学系统读取结果之后，将含有生物材料的区域用发射波长范围为350nm至450nm(或激光)的辐射的UV LED 29加热至150℃持续2至3秒，以中和生物危害。在较低的UV功率下，这些UV LED 29同时用于激发荧光(照亮反应盒6)。UV暴露导致生物材料破坏和反应室材料6的解聚，这降低了生物危害并使聚合物崩解，从而有利地保护环境并确保适当的处理。在整个生物材料分析过程中，液体生物材料的热处理在分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4中进行。加热分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4所需的能量在没有接触的情况下连通。能量来源是LED发光二极管，其发射来自UV-VIS范围的光辐射。例如，由LED发射的波长可以选自350nm至500nm。发光二极管位于测量设备内部，并排列成照亮分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4的区域。通过使用特征在于高透光性的用于构造反应盒6的透明材料，可以对各个室使用节能加热方法。反应室8.1、8.2、8.3、8.4和分离室7的温度由高温计与数字处理块无接触地控制。整个系统由带有内置软件的微处理器驱动程序控制。此外，低功率UV LED用于测量设备以照亮反应器内部，这是CCD记录图像所必需的。生化反应产物的检测基于确定来自CCD检测器RGB通道的信号的量化水平。设备的设计允许连续记录颜色信号。使用照明二极管允许通过检测器连续记录图像，因为没有必要用外部光源持续照亮样品。
在图5中以框图形式示出了根据本发明的一个实施方案的测量设备的构造。通常，被构造成使得其容纳反应盒6的测量室10在测量设备中是可区分的。为了将反应盒6适当地放置在测量室10中，提供了反应盒6的定位机构11。测量室10是由外部热绝缘12覆盖的封闭结构，这有助于在内部保持设定温度。维持测量室10内的等温控制的温度(如4℃至40℃)确保加热系统13(如以Peltier组件形式)。为了将加热的空气适当地分配在测量室11内，使用风扇14和空气混合轮22。通过位于测量室10外部的散热器15也确保了加热系统13的效率。测量设备还包含设备的适当功能所必需的另外模块，诸如成像控制和分析模块16、通信模块17、电源模块18和显示器19。上述模块的功能及其构造对于本领域技术人员来说是公知的，因此省略其精确描述以简化讨论。测量设备的测量室20还提供压力设定机构10，用于激活反应盒6中的泵P1。压力传感器21位于相对的位置以控制泵P1上的设定压力。为了确保分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4中的正确温度，在测量室10中设置多个加热单元23，它们相对于反应盒6的定位使得所发射的光流分别照亮分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4。更具体地，每个加热单元23由具有散热器24的LED、温度检测器25和温度检测器稳定器26组成。分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4的加热由范围为400nm至500nm的具有可持续调整的光子能量流的LED进行，其由于高光子发射性能而是优选的，并且转化为高功率到达分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4的底部处的吸收层。为了补偿室7、8.1、8.2、8.3、8.4的底部的温度和吸收能量，以防止冻干的生物材料在室8.1、8.2、8.3、8.4中的降解，使用完全吸收光子能量的吸收层。该层由材料如涂覆有氧化物(在本实施例中为Al2O3，浸染黑)的Cu或Al和具有良好吸收性质和良好导热性的其他材料(包括改性聚合物如碳或石墨烯)制成。
在室7、8.1、8.2、8.3、8.4中温度随时间增加是通过增加光流的功率以及通过4℃至40℃的温度的等温测量室10降低来实现的。利用分离室7或反应室8.1、8.2、8.3、8.4对周围环境的恒定热阻，可以通过改变反应盒6的环境温度来控制降低温度的速率。根据所需的温度降低速率，设定设备内部(即测量室10中)的温度，并且适合的功率被施加至室7、8.1、8.2、8.3、8.4的吸收层。以这种方式，可以在25℃至100℃的范围内获得任何温度特性，其具有高的增加和降低速率。室的吸收层具有高导热率，这消除了来自LED的光流的可能的不均匀性，并且确保了工作室区域中没有温度梯度。
因为温度测量是由温度检测器诸如8μm至12μm范围内的具有内置的辐射可透过滤波器的高温计完成的，所以可能同时测量温度并向分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4供应能量。在此类情况下，没有对在分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4中的温度控制缺乏控制的时期。此外，没有与PID控制器的操作相关的温度峰值，并且不需要通过脉冲宽度调制PWM进行功率控制，这具有产生较少热噪声的优点。
此外，提供一系列LED 27以操作Z1-Z11阀和D1-D4液体检测器，所述一系列LED 27类似地布置成使得产生的光束照亮设备。光学系统具有照相机28，其可以具有CCD检测器的形式并且旨在检测由反应室8.1、8.2、8.3、8.4中的反应导致的荧光染料产生的光信号。为了允许此类情况，也提供了照亮检测区域的UV LED 29。
实施例2
图2示意性地示出了用于检测根据本发明的生物样品中的遗传物质的设备中的反应盒6的另一个实施方案。本实施方案中所示的反应盒6的总体设计和操作原理与实施例1的反应盒6的构造和操作原理一致。比较性的反应盒6之间的根本区别在于，在来自实施例2的反应盒6中使用了整体采样系统1(它不是如本发明第一实施方案中那样的单独设备)。因此，反应盒6是紧凑的结构，没有可拆卸的元件。在这种情况下，将收集的生物材料引入采样系统1中，该采样系统1形成反应盒6的整体部分。同样在该实施例中，可区分毛细管2，其借助于毛细管力吸收生物材料。在毛细管2的另一端提供控制窗口30，其发出用生物材料填充毛细管2的信号。在本实施方案中，第一泵P1通过诸如活塞和波纹管的机械元件制成。在该实施方案中，应该强调的是，用于反应室6的水以胶囊的形式提供，这允许容易灭菌和在反应室6的生产中分离湿制程的可能性。水释放正好在测试之前进行，并且当泵P1开始操作时通过针注射31进行。通过从胶囊中挤出水，由泵P1提供生物材料和产物从分离室7输送至反应室8.1、8.2、8.3、8.4。这简化了设备的过程控制。加热过程中的适合压力由测量设备中的压力传感器21和阀Z5、Z8、Z9、Z10的相应控制提供。在该实施方案中，反应室8.1、8.2、8.3、8.4的构造也值得注意。俯视图中的反应室8.1、8.2、8.3、8.4中的每一个都是互补圆形。反应室8.1、8.2、8.3、8.4相互互补以形成包括所有反应室8.1、8.2、8.3、8.4的圆形区域，其通过阀或隔膜33在中间连接。在这一实施方案中，各种可以使用不影响实施方案的整体性的阀设计33。可用于反应盒6中的示例性阀33分别如图4的A)至图4的D)所示：疏水圆形阀、疏水机械圆阀、疏水机械椭圆阀、疏水机械矩形阀。所呈现的机械阀作用于制造阀门的柔性材料的变形。需要特定的力，其同时限定压力，该压力已经超过导致液体沿给定方向流动。阀的形状使得在第二方向上阻断弹性变形，从而阻断液体在该方向上的流动。疏水阀的运行原理是液体必须克服与疏水阀材料接触的表面张力(当空气自由流动时)。这允许根据阀中的开口的直径和制造阀的材料的疏水性来阻断通道中的液体流动至预定压力。在用液体同时填充三个通道的情况下，在将疏水阀放置在通道的末端之后，它们将自动填充。空气将畅通无阻地流动，并且液体将在这些阀门上连续停止，因为液体需要更大的压力才能流过阀。这两种类型的阀的组合使得易于控制反应盒6中的液体流动。
此外，在本实施方案中，没有使用另外的泵P2，并且基本上减少了使用的阀的数量(与第一实施方案的反应盒6相比)。此外，由于反应室8.1、8.2、8.3、8.4的构造，出口通道指向反应盒6的三个不同边缘，并且在通气口9之前提供有补偿室33以防止液体流出反应盒6进入测量设备。反应盒6的其他组件和操作原理与反应盒6的第一实施方案中公开的那些一致。
实施例3
图3所示的反应盒6是本发明的又一个实施方案，与图2所示的反应盒6的不同之处仅在于，在每个反应室8.1、8.2、8.3、8.4中，在反应室8.1、8.2、8.3、8.4的入口和出口处使用两个阀33，并连接通道34，其旨在通过加热反应室8.1、8.2、8.3、8.4引起压力变化在一个方向上提供稳定且受控的液体流动。在本实施方案中提出的解决方案中，与第二实施方案中提出的解决方案不同，没有Z8和Z10阀，这极大地简化了反应盒6的设计及其操作。连接通道34用于使反应室8.1、8.2、8.3、8.4通气。由于阀阻止了液体的收缩，因此在反应室8.1、8.2、8.3、8.4中没有液体的不受控制的混合。在反应室8.1、8.2、8.3、8.4中放置两个阀允许在出口处仅使用一个常开阀，以确保系统正常运行。
实施例4
使用本发明的方法和本发明的设备检测血液中的HIV。
为了分析取自患者的样品中HIV病毒的存在，在实施例1和2中详细描述了用于检测根据本发明的生物样品中的遗传物质的方法和设备。在分离室7中使用Chelex 100。DNA分离涉及细胞膜或病毒蛋白包膜的热降解和包封在病毒细胞/蛋白包膜中的遗传物质的释放。Chelex 100对于捕获可阻断聚合酶并产生假阴性结果的抑制剂是必要的。Chelex 100在不含核酸酶的去离子水中制备为5％混合物，它也可以多孔层的形式固定在分离室的底部。为了在分离室中进行分离，将血液在95℃加热5-10分钟。
冻干的试剂，包括缓冲液、dNTP、MgSO4、Primer Mixer、Bst 3.0聚合酶、SYBRGreen，均在反应室中。遗传物质的扩增在反应室8.1、8.2、8.3、8.4中通过在65℃加热30分钟进行。测试室8.1中有特定的HIV引物。在内源性阳性对照室8.2中，存在针对人基因的特异性引物。在阴性对照室8.3中没有添加引物，但是含有反应的其他组分。LAMP反应和检测，发生在反应室8.1、8.2、8.3、8.4中，并且使用Bst 3.0聚合酶扩增给定病原体的遗传物质(和内源对照的遗传物质)组成。添加至反应中的特异性引物与测试的基因组的选定片段结合，并确定在反应中扩增的片段。在反应结束时，形成大约10-50μg/μl的扩增DNA片段。存在于反应混合物中的SYBR Green与反应产物结合，并且当与双链DNA结合时，变成荧光(当光具有足够的长度时发光)。产物增量等于来自染料的光增加。在反应结束时，当结果是阳性并且测试的片段被扩增时，光是可见的，当结果是阴性时，没有光。添加其他反应组分(缓冲液、MgSO4、dNTP)以向Bst 3.0聚合酶提供适合的工作条件。
在分离反应室中的DNA/RNA材料的过程中，病原体被中和。唯一的危险可能是反应盒6中的毛细管2或通道中的遗传物质的残留。因此，在检测之后，再循环遗传物质的残留，这通过将反应盒6(尤其是分离室7和反应室8.1、8.2、8.3、8.4)暴露至UV辐射以将各个组分加热至高于100℃的温度，从而处理遗传物质。这允许安全地处理使用过的反应盒6而无需执行复杂的处理程序。

Claims (15)

1.检测生物样品中遗传物质的方法，其包括以下阶段：
a)在将反应盒(6)置于测量设备中之后或之前，将所述生物样品加载至反应盒(6)中，
b)将收集的生物样品带至分离室(7)中，
c)通过加热所述分离室(7)，从测试样品中分离生物材料，
d)将分离的遗传物质移入多个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，
e)通过加热所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)来扩增遗传物质，
其特征在于在至少一个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)内部存在用于扩增遗传物质的冻干试剂连同荧光染料，其包括能结合待检测的遗传物质的荧光染料或量子点，而与遗传物质的扩增阶段同时记录来自荧光标记的荧光信号的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于生物样品取自采样系统(1)，并且通过将所述采样系统(1)加载至所述反应盒(6)中来进行阶段a)，其中通过具有温度检测器(23)的LED上的多个加热单元，优选发射波长范围为350nm至530nm的电磁辐射，进行分离室(7)和/或反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)的加热，并且具有温度检测器(23)的LED的加热单元包括检测波长范围为4μm至12μm的电磁辐射的光学温度检测器(25)。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于采用所述采样系统(1)中的毛细管(2)的毛细力来采集生物样品，以及用于遗传物质扩增的冻干试剂包括脱氧核苷酸、特异性引物序列、反应缓冲液、镁离子Mg2+，优选呈MgSO4形式、能够进行扩增反应的聚合酶，优选Bst3.0聚合酶，其中嵌入所检测的遗传物质的冻干的荧光标签是SYBR Green。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述反应盒(6)包括三个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，其包括测试室(8.1)、阳性对照室(8.2)以及阴性对照室(8.3)，所述测试室包含针对所测试的遗传物质的特异性引物，所述阳性对照室含有对生物材料样品所来源的遗传物质的特定部分有特异性的引物，所述阴性对照室含有反应组分但没有引物。
5.如权利要求8所述的方法，其特征在于在俯视图中的所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)是圆形的，互补的并在中间用阀或隔膜(33)相互连接。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在阶段c)将所述分离室加热至95℃持续5分钟至10分钟，其中在阶段e)将所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)加热至65℃持续15分钟至60分钟，以及阶段b)通过第一泵(P1)完成，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的水箱形式或活塞和波纹管的第一泵完成，以及步骤d)通过第二泵(P2)完成，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的中空室形式的第二泵完成，并且包括将反应盒(6)加热至高于100℃的温度的阶段，优选通过具有温度检测器(23)的LED上的多个加热单元加热。
7.用于检测生物样品中遗传物质的设备，其包括反应盒(6)和测量设备，所述测量设备包括具有容纳所述反应盒(6)的插座的测量室(10)，其中所述反应盒(6)包括用于分离遗传物质的分离室(7)，所述分离室通过通道与用于扩增分离的遗传物质的所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)连接，其特征在于在至少一个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)内部存在用于扩增遗传物质的冻干试剂连同发光染料，其包括能结合待检测的遗传物质的荧光染料或量子点，而与遗传物质的扩增阶段同时记录了来自发光标记物的发光信号的检测。
8.如权利要求7所述的设备，其特征在于，所述设备包括可拆卸的采样系统(1)、用于成像控制和分析的测量模块(16)、通信模块(17)、电源模块(18)和显示器模块(19)，所述可拆卸的采样系统(1)包括插头(4)，并且所述反应盒(6)包括适合所述插头(4)并提供所述采样系统(1)与所述反应盒(6)之间的稳定且紧密的流体连通的插座(5)。
9.如权利要求15至17中任一项所述的设备，其特征在于，所述测量设备包括具有温度检测器(23)的LED上的多个加热单元，优选发射波长范围为350nm至530nm的电磁辐射且与所述分离室(7)和反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)基本上相对地排列，使得由所述多个LED发射的光束照亮所述分离室(7)和反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，其中具有温度检测器的LED的加热单元包括检测波长范围为4μm至12μm的电磁辐射的光学温度检测器，并且在俯视图中反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)是圆形的，互补的并在中间用阀或隔膜相互连接。
10.如权利要求7至9中任一项所述的设备，其特征在于，所述采样系统(1)包括采集生物样品的毛细管(2)，所述毛细管与第一泵(P1)连接，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的水箱形式或活塞和波纹管的第一泵连接，以及用于遗传物质扩增的冻干试剂包括脱氧核苷酸、特异性引物序列、反应缓冲液、镁离子Mg2+，优选呈MgSO4的形式、能够进行扩增反应的聚合酶，优选Bst3.0聚合酶，其中嵌入所检测的遗传物质的冻干的荧光标签是SYBR Green。
11.如权利要求7至10中任一项所述的设备，其特征在于，所述反应盒(6)包括三个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，其包括测试室(8.1)、阳性对照室(8.2)以及阴性对照室(8.3)，所述测试室包含针对测试的遗传物质的特异性引物，所述阳性对照室含有对生物材料样品所来源的遗传物质的特定部分有特异性的引物，所述阴性对照室含有反应组分但没有引物，其中所述反应盒(6)包括第二泵(P2)，所述第二泵优选为连接至压力产生室的隔膜封闭的中空室的形式，所述第二泵连接至分离室(7)并产生引起分离的遗传物质从所述分离室(7)移动至所述反应室(8.1、8.2、8.3)的压力。
12.如权利要求7至11中任一项所述的设备，其特征在于，所述反应盒(6)和/或采样系统(1)由疏水性聚合物制成并且是完全被动系统，其中所述反应盒(6)中的分离室(7)和反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)以及所述第二泵(P2)包括阀(Z11)、(Z5、Z6、Z7)、(Z8、Z9、Z10)、(Z3)、(Z4)，优选分别在入口通道和出口通道上的光学阀。
13.如权利要求15至27中任一项所述的设备，其特征在于，在连接所述分离室(7)与所述第二泵(P2)的通道中存在液体检测器(D1)，优选反射红外液体检测器，其中液体检测器(D2、D3、D4)，优选反射红外液体检测器，位于来自所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)的出口通道中，并且测量室(10)具有范围为4℃至40℃的受控等温温度，其由加热系统(13)，优选Peltier组件形式的加热系统实现，并且所述加热系统(13)包括连接风扇(14)和散热器(15)，并且空气混合轮(22)位于所述测量室(10)中。
14.如权利要求7至13中任一项所述的设备，其特征在于，所述测量室(10)用热绝缘(12)绝缘，以及所述反应盒(6)的定位机构(11)和对所述反应盒(6)中的所述泵(P1)施加压力的压力设定机构(20)和反向设定的压力传感器以及照亮检测区的另外的UV LED(29)。
15.如权利要求7至14中任一项所述的设备，其特征在于包括用于操作液体检测器(D1-D4)和阀的另外的LED(27)，并且在所述分离室(7)和/或反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)底部，存在吸收光子能的吸收层，优选由用氧化物，优选染黑的Al2O3，涂覆的Cu或Al制成。
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