BR112019012501A2 - um método para detectar material genético em uma amostra biológica e um dispositivo para sua implementação - Google Patents

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Marian Dobosz Tadeusz
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Abstract

o objeto da invenção é um método para detectar material genético em uma amostra biológica, na qual a amostra biológica é carregada no cartucho de reação (6) e depois o cartucho de reação (6) é colocado no dispositivo de controle, a amostra biológica coletada é levada para a câmara de isolamento (7), o isolamento do material biológico da amostra testada aquecendo a câmara de isolamento (7), o material genético isolado é movido para uma pluralidade de câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), o material genético é amplificado aquecendo as câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), reagentes liofilizados para amplificação do material genético em conjunto com etiqueta fluorescente liofilizada intercalando com material genético estão presentes nas câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), e a detecção de sinal de etiquetas fluorescentes é realizada em conjunto com o estágio de amplificação do material genético.

Description

UM MÉTODO PARA DETECTAR MATERIAL GENÉTICO EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA E UM DISPOSITIVO PARA SUA IMPLEMENTAÇÃO [001] O objeto da invenção é um método para detectar material genético (incluindo DNA e RNA) em uma amostra de material biológico, em particular usando a tecnologia LAMP (AMPlification Isotérmica mediada por Malha) para amplificar material genético e o dispositivo para a sua implementação. O objeto da invenção é usado para a detecção rápida e móvel de patógenos bacterianos, virais e fúngicos no material biológico obtido.
[002] Atualmente existe uma procura por métodos de diagnóstico rápidos, baratos e eficazes para identificar patógenos bacterianos, virais e fúngicos que possam ser contaminantes microbianos, por exemplo, de produtos alimentícios.
[003] O pedido de patente US 2009061450A1 descreve um dispositivo para diagnóstico e ensaio de patógenos respiratórios, compreendendo um dispositivo de amostragem nasal, um cartucho microfluidico descartável de entrada única para amplificação de ácido nucleico alvo, e um instrumento com plataforma de controle de ensaio a bordo e meio de detecção de alvo. Um dispositivo para amostragem é um transportador de amostra sendo colocado em um receptáculo apropriado em um cartucho microfluidico, de modo que seja vedado e conectado de modo fluido um ao outro. Um número de câmaras pode ser distinguido no cartucho microfluidico, onde etapas subsequentes do método do ensaio do patógeno, em que o primeiro estágio inclui o isolamento do material genético da amostra testada, o material isolado é então amplificado e submetido à
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2/33 detecção. Em uma modalidade da solução citada, a amplificação do material genético é realizada usando o método de LAMP. Na câmara de reação, onde ocorre a amplificação, é necessário prover uma temperatura fixa e estável, na qual a solução apresentada é conseguida pelo elemento de aquecimento ITO impresso em um dispositivo microfluidico. A etiqueta fluorescente intercalada com material genético é adicionada após a amplificação do material genético, permitindo a detecção óptica em tempo real.
[004] Por sua vez, o pedido de patente US 2012264132A1 descreve um dispositivo e um método de processamento de amostras, incluindo amplificação essencialmente isotérmica de ácidos nucleicos. O dispositivo de acordo com uma invenção citada compreende um primeiro substrato tendo uma primeira área de população, pelo menos uma área da primeira população tendo pelo menos uma área de satélite disposta próximo a pelo menos uma área, e pelo menos uma área de satélite sendo adaptada para reter material da primeira área. O dispositivo compreende adicionalmente um segundo substrato tendo uma segunda área de população formada no mesmo, o primeiro e segundo substratos sendo engatados um com o outro, de modo que o movimento relativo entre o primeiro e segundo substratos coloque pelo menos algumas das primeiras áreas de população em alinhamento com pelo menos algumas das segundas áreas da população, de modo que estejam em comunicação fluida um com o outro. Amplificar o material genético de usando o dispositivo mencionado consistindo no contato de um material de amostra disposto em uma pluralidade de primeiras áreas, o material de
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3/33 amostra compreendendo um ácido nucleico alvo, e pelo menos uma das primeiras áreas contendo uma molécula do ácido nucleico alvo, com um material reagente disposto em uma pluralidade de segundas áreas, o contato sendo efetuado por colocação em pares de pelo menos algumas das primeiras áreas e pelo menos algumas das segundas áreas em comunicação fluida direta umas com as outras. 0 referido contato dos materiais efetua a amplificação da molécula de ácido nucleico alvo.
[005] O pedido de patente US 20140335527A1 descreve um sistema e um método para análise móvel de ácidos nucleicos e proteínas. O sistema de análise móvel é um pequeno dispositivo sem fio, que se comunica com o usado através do visor e do teclado. O sistema de análise móvel está usando módulos conectados para extração, amplificação e detecção de ácidos nucleicos das amostras. Todo o processo, em conjunto com o processamento de dados, geralmente não leva mais que 20 minutos. No primeiro estágio do método de análise de material genético, a amostra biológica é carregada em um chip integrado. O carregamento da amostra biológica pode ser realizado manualmente, através da porta de entrada da amostra ou através de uma amostragem automatizada. No chip integrado, a amostra é transportada para um módulo de extração, no qual o processo de extração do material genético da amostra biológica é realizado. Os ácidos nucleicos isolados são então transportados para o módulo de amplificação, no qual, em uma modalidade, a amplificação é realizada usando o método de LAMP. Os métodos de extração e amplificação contêm todos os reagentes necessários para realizá-los. A amplificação
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4/33 requer a manutenção da temperatura aumentada estabelecida, que pode ser obtida através de elementos de aquecimento infravermelhos. 0 material genético amplificado vai para o módulo de detecção no qual é detectado, por exemplo, por um sinal fluorescente derivado de etiquetas apropriadas afixadas ao DNA detectado. Portanto, uma das câmaras de amplificação do material genético pode ser pré-carregada com, por exemplo, mistura mestre de LAMP etiquetada com fluorescência. Todo o chip integrado é transparente, permitindo a transmissão de feixes de luz para o aquecimento dos respectivos módulos e a detecção do sinal de fluorescência.
[006] Um problema técnico a ser resolvido é prover um método para detectar material genético (em particular DNA e/ou RNA) em uma amostra de material biológico e o dispositivo para sua implementação que permitirá a detecção rápida de patógenos preferidos, ao mesmo tempo, o dispositivo será simples de construir, completo, móvel, relativamente barato de fabricar e permitirá o armazenamento de cartuchos de reação por períodos prolongados de tempo e não estará associado a condições específicas de armazenamento, como temperaturas muito baixas. É também preferido que os cartuchos de reação, sendo uma parte do dispositivo para detectar o patógeno na amostra de material biológico, sejam adequados para descarte e que o próprio dispositivo tenha um consumo de energia limitado. Além disso, é preferível que o método desenvolvido de detecção de patógenos reduza o número de estágios necessárias, tornando-a mais simples e rápida de implementar e que a construção do dispositivo para sua
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5/33 implementação proveja um risco reduzido de contaminação da amostra de material biológico. Surpreendentemente, os problemas acima mencionados foram resolvidos pela invenção mostrada.
[007] O primeiro objeto da invenção é um método para detectar material genético em uma amostra biológica incluindo os seguintes estágios:
a) a amostra biológica é carregada no cartucho de reação e, em seguida, ou antes que o cartucho de reação seja colocado no dispositivo de medição,
b) a amostra biológica coletada é levada para a câmara de isolamento,
c) isolamento de material biológico da amostra testada por aquecimento da câmara de isolamento,
d) o material genético isolado é movido para uma pluralidade de câmaras de reação,
e) material genético é amplificado aquecendo as câmaras de reação, caracterizado pelo fato de no interior pelo menos uma das câmaras de reação estar presente, reagentes liofilizados para amplificação de material genético em conjunto com corante luminescente, compreendendo corante de fluorescência ou material genético de ligação por pontos quânticos a ser detectado, enquanto simultaneamente com o estágio de amplificação de material genético, uma detecção de sinal luminescente de marcadores luminescentes é registrada.
[008] Em uma modalidade preferida da invenção, uma amostra biológica é retirada de um sistema de amostragem e o estágio a) é realizado carregando o sistema de amostragem
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6/33
no cartucho da reação (6) .
[009] Em uma outra modalidade preferida da invenção, o
aquecimento da câmara de isolamento e/ou da câmara de
reação é realizado através de várias unidades de
aquecimento em LED com detectores de temperatura, emitindo,
de preferência, radiação eletromagnética com um comprimento de onda na faixa de 350 nm a 530 nm.
[0010]Em outra modalidade preferida da invenção, a unidade de aquecimento de LEDs com detectores de temperatura compreende um detector de temperatura óptico que detecta radiação eletromagnética na faixa de comprimento de onda de 4 μπι a 12 μπι.
[0011] Em uma outra modalidade preferida da invenção, uma amostra biológica é retirada usando forças capilares para o capilar no sistema de amostragem.
[0012]De preferência, reagentes liofilizados para amplificação de material genético incluem desoxinucleotídeos, sequências iniciadoras especificas, tampão de reação, ions de magnésio Mg+2, de preferência na forma de MgSCA, polimerase capaz de realizar uma reação de amplificação, de preferência polimerase Bst 3.0.
[0013]De igual modo, de preferência, a etiqueta fluorescente liofilizada que intercala com o material genético detectado é SYBR Green.
[0014]Para detecção, de acordo com o primeiro e o segundo aspectos da invenção, a detecção em tempo real do produto de amplificação de ácido nucleico, bem como os oligonucleotideos de técnica de ponto final com uma molécula de ponto quântico ligada na extremidade 5' e um extintor ligado na extremidade 3' . A sequência dos
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7/33 oligonucleotídeos usados é complementar à porção da região amplificada do fragmento de ácido desoxirribonucleico localizado entre os iniciadores projetados F1 e Blc e para a porção da região amplificada do fragmento de ácido nucleico localizado entre os iniciadores projetados Flc e Bi. Durante a reação de amplificação, uma polimerase tendo uma atividade de deslocamento de cadeia e atividade de exonuclease 5'>3' é usada, por exemplo, DNA Polimerase Bst, comprimento total.
[0015]Durante a reação de amplificação do ácido desoxirribonucleico, a sonda se liga ao fragmento complementar no segmento de DNA amplificado, durante o alongamento do amplicon, devido às propriedades de exonuclease da polimerase, o oligonucleotídeo ligado é degradado, o que resulta na separação do extintor do ponto quântico. Como resultado da separação, o extintor do ponto quântico, radiação eletromagnética é emitida na faixa de UV, IV ou VIS após a excitação do ponto quântico com o comprimento de onda de radiação específico para o material a partir do qual o ponto quântico foi criado. O sinal emitido é registrado pelo elemento fotossensível.
[0016]O uso de pontos quânticos provoca uma redução significativa no limiar de detecção devido à possibilidade de usar uma fonte de luz de excitação com uma potência maior, graças à qual é possível registrar a emissão de radiação eletromagnética proveniente de uma quantidade muito menor de liberação de pontos quânticos. Adicionalmente, o uso de pontos quânticos para marcar fragmentos de oligonucleotídeos permite uma melhor separação do comprimento de onda de excitação do
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8/33 comprimento de onda do sinal de emissão no qual a detecção de radiação eletromagnética ocorre. Além disso, os pontos quânticos têm uma durabilidade de branqueamento aumentada em comparação aos fluorocromos tradicionais, o que facilita a detecção em toda a reação de amplificação.
[0017]Mais de preferência, o cartucho de reação compreende três câmaras de reação, incluindo uma câmara de teste incluindo iniciadores específicos para o material genético testado, uma câmara de controle positivo que contém iniciadores específicos para uma porção particular do material genético do qual a amostra de material biológico é derivada, e uma câmara de controle negativo, contendo componentes de reação sem iniciadores.
[0018]Na modalidade preferida da invenção, as câmaras de reação em uma vista de topo são círculos, complementares e interconectados no meio com uma válvula ou um diafragma.
[0019]Em outra modalidade preferida da invenção, no estágio c), a câmara de isolamento aquecida a 95°C durante 5 minutos a 10 minutos.
[0020]Ainda em uma outra modalidade preferida da invenção no estágio e) as câmaras de reação são aquecidas a 65°C durante 15 minutos a 60 minutos.
[0021]De preferência, o estágio b) é realizado por meio de uma primeira bomba, de preferência, na forma de um tanque de água fechado com um diafragma conectado a um (a) câmara ou pistão de produção de pressão e foles.
[0022]De igual modo preferencial, o estágio d) é realizado por meio de uma segunda bomba, de preferência na forma de uma câmara oca fechada com um diafragma conectado a uma câmara de produção de pressão.
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9/33 [0023]Mais de preferência, o método compreende adicionalmente um estágio de aquecimento de um cartucho de reação a temperaturas acima de 100°C, de preferência através de um número de unidades de aquecimento em LEDs com detectores de temperatura.
[0024]Segundo objeto da invenção é um dispositivo para detectar material genético em uma amostra biológica compreendendo um cartucho de reação e dispositivo de medição, o dispositivo de medição compreendendo uma câmara de medição tendo um receptáculo alojando o cartucho de reação, em que o cartucho de reação compreende uma câmara de isolamento para isolar material genético, que é conectado com as câmaras de reação através dos canais, para amplificar material genético isolado, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das câmaras de reação está presente, os reagentes liofilizados para amplificação de material genético em conjunto com corante luminescente, compreendendo corante de fluorescência ou material genético de ligação por pontos quânticos a ser detectado, enquanto que simultaneamente com o estágio de amplificação de material genético, uma detecção de sinal luminescente de marcadores luminescentes é registrada.
[0025]Na modalidade preferida da invenção, o dispositivo compreende um sistema de amostragem destacável, o sistema de amostragem destacável compreendendo um tampão e o cartucho de reação compreendendo um receptáculo encaixado no referido tampão e provendo uma conexão estável ou estanque a fluido entre o sistema de amostragem e o cartucho de reação.
[0026]Em outra modalidade preferida da invenção, o
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10/33 dispositivo compreende adicionalmente um módulo de reação para controle e análise de imagem, módulo de comunicação, módulo de fonte de alimentação e módulo de exibição.
[0027]Em outra modalidade preferida da invenção, o dispositivo de reação compreende uma pluralidade de unidades de aquecimento em LED com detectores de temperatura, emitindo, de preferência, radiação eletromagnética com um comprimento de onda na faixa de 350 nm a 530 nm, arranjadas substancialmente opostas à câmara de isolamento e às câmaras de reação, de modo que os feixes de luz emitidos pela referida pluralidade de LEDs iluminem a referida câmara de isolamento e as câmaras de reação.
[0028]Em outra modalidade preferida da invenção, a unidade de aquecimento de LEDs com detectores de temperatura compreende um detector de temperatura óptico que detecta radiação eletromagnética na faixa de comprimentos de onda de 4 μπι a 12 μπι.
[0029]De preferência, as câmaras de reação em uma vista de topo são círculos, complementares e interconectados no meio com uma válvula ou um diafragma.
[0030]De igual modo preferido, o sistema de amostragem compreende um capilar, com o qual uma amostra biológica é retirada, conectada a uma primeira bomba, de preferência, na forma de um tanque de água fechado com um diafragma conectado a um(a) câmara ou êmbolo de produção de pressão e foles.
[0031]Mais de preferência, reagentes liofilizados para desoxinucleotídeos de amplificação de material genético, sequências iniciadoras específicas, tampão de reação, íons de magnésio Mg+2, de preferência na forma de MgSCM,
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11/33 polimerase capaz de realizar uma reação de amplificação, de preferência polimerase Bst 3.0.
[0032]Na modalidade preferida da invenção, o agente fluorescente liofilizado que intercala com material genético detectado é SYBR Green.
[0033]Ainda em outra modalidade preferida da invenção, o cartucho de reação compreende três câmaras de reação, incluindo uma câmara de teste incluindo iniciadores específicos para o material genético testado, uma câmara de controle positivo que contém iniciadores específicos para uma porção particular do material genético a partir do qual a amostra de material é derivada e uma câmara de controle negativo, contendo componentes de reação sem iniciadores.
[0034]Ainda em outra modalidade preferida da invenção, o cartucho de reação compreende uma segunda bomba, de preferência, na forma de uma câmara vazia fechada com um diafragma conectado a uma câmara que produz pressão, provocando o movimento de material genético isolado da câmara de isolamento para a câmaras de reação.
[0035]De preferência, o cartucho de reação e/ou sistemas de amostragem é(são) feito(s) de um polimero hidrofóbico e é um sistema totalmente passivo.
[0036]De modo igual, de preferência, a câmara de isolamento e a câmara de reação, bem como a segunda bomba no cartucho de reação, compreendem as válvulas, de preferência as ópticas nos canais de entrada e de saida, respectivamente.
[0037]Mais de preferência, no canal que conecta a câmara de isolamento com a segunda bomba, há um detector de liquido, de preferência um infravermelho reflexivo.
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12/33 [0038]Na modalidade preferida da invenção, os detectores de liquido, de preferência os infravermelhos reflexivos, são localizados nos canais de saida das câmaras de reação.
[0039]Em uma outra modalidade preferida da invenção, a câmara de medição tem uma temperatura isotérmica controlada na faixa de 4°C a 40°C, realizada através de um sistema de aquecimento, de preferência sob a forma de um conjunto Peltier.
[0040]Em uma outra modalidade preferida da invenção, o sistema de aquecimento compreende uma ventoinha e um radiador conectados, e uma roda de mistura de ar é localizada na câmara de medição.
[0041]De preferência, a câmara de medição é isolada com isolamento térmico.
[0042]De preferência, de modo igual, o dispositivo compreende um mecanismo de posicionamento do cartucho de reação.
[0043]Mais de preferência, o dispositivo compreende um mecanismo de ajuste de pressão que exerce uma pressão sobre a bomba no cartucho de reação e um sensor de pressão opostamente fixado.
[0044]Na modalidade preferida da invenção, o dispositivo compreende LEDs de UV adicionais que iluminam a área de detecção.
[0045]Em uma outra modalidade preferida da invenção, o dispositivo compreende LEDs adicionais para operar detectores e válvulas de liquidos.
[0046]Em uma outra modalidade preferida da invenção, no fundo da câmara de isolamento e/ou câmara de reação existe
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13/33 uma camada de absorção absorvendo energia de fótons, de preferência feita de Cu ou Al revestida com óxidos, de preferência, tingida com AI2O3 preto.
[0047]Um método para detectar material genético em uma amostra biológica de acordo com a presente invenção permite evitar a necessidade de modificar a amostra de material biológico, colocando-a nos dispositivos, reduzindo a probabilidade de contaminação, e também permitindo que o usuário realize o teste apenas pelo usuário final. Além disso, nenhum equipamento de laboratório adicional ou condições estéreis de preparação de reação são necessários para completar o teste. Adicionalmente, a liofilização no processo de produção dos componentes de reação provê um aumento significativo na utilidade do cartucho de reação (mesmo mais de um ano a partir da data de fabricação) , e não é necessário armazenar o cartucho de reação sob refrigeração. Colocar os iniciadores, específicos para o fragmento de ácido nucleico amplificado, dentro da câmara de reação reduz adicionalmente a suscetibilidade do procedimento à contaminação, e facilita ainda mais o estudo para o usuário final. Além disso, a colocação do corante na câmara de reação permite a detecção imediata do produto de reação resultante, sem que o usuário final tome medidas e simplifique significativamente todo o processo de detecção, reduzindo o número de etapas necessárias. O cartucho de reação e o sistema de amostragem são feitos como componentes totalmente passivos, a partir de um material polimérico, permitindo que eles sejam descartados com segurança, beneficiando o meio ambiente. Além disso, os LEDs para aquecer a câmara de isolamento e as câmaras de
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14/33 reação usadas no dispositivo de controle reduzem o consumo de energia de todo o processo.
[0048]Modalidades exemplificativas da invenção são mostradas nas figuras do desenho, nas quais as Figuras 1, 6 mostram uma representação esquemática do sistema de amostragem e do cartucho de reação de acordo com uma modalidade da presente invenção, as Figuras 2, 7 mostram o cartucho de reação de acordo com outra modalidade da presente invenção, a Figura 3 mostra o cartucho de reação de acordo com ainda outra modalidade da presente invenção, a Figura 4 mostra várias modalidades das válvulas usadas em diferentes modalidades do cartucho de reação, enquanto a Figura 5 mostra um diagrama de blocos do dispositivo de medição de acordo com uma modalidade da presente invenção.
Exemplo 1 [0049] Um dispositivo para detectar material genético em uma amostra biológica de acordo com a modalidade da presente invenção foi parcialmente ilustrado esquematicamente (sem um dispositivo de medição) na Figura 1 e a sua variedade na Figura 6. A amostra de material biológico (por exemplo, sangue capilar, sangue total, saliva, fluido da cavidade corporal) retirada usando o sistema de amostragem 1, é introduzida em um cartucho de reação 6 feito de um polimero hidrofilico revestido com uma camada anticoagulante, por exemplo, citrato de sódio, EDTA, por forças capilares, em um volume não maior que 1 ml (na modalidade mostrada na Figura 1, o volume é de 10 μΐ) . Depois de encher o capilar 2, sinalizado ao usuário final por meio de uma etiqueta no final do canal (não mostrado) , por exemplo, observando o canal a encher até à janela de
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15/33 controle ou por meio de um sinal luminoso e/ou sonoro, o material biológico é transportado pela pressão do fluido que sai da câmara contendo água destinada ao diagnóstico molecular.
[0050]A mistura de material biológico e a água passa do capilar 2 para a câmara de isolamento 7 no seu final. Na câmara de isolamento 7 existe uma resina de troca iônica imobilizada Chelex 100 ou outro material capaz de se ligar a inibidores da reação de amplificação de material genético. Depois da mistura atravessar, o conteúdo da câmara de isolamento 7 é aquecido a 70°C ou mais por mais de 5 minutos. Neste momento, há uma lise térmica das células e, em alguns casos, também dos nucleocapsídios virais contidos no material biológico, liberando assim o material genético de seu interior. Dependendo do tipo de patógeno, a temperatura pode ser aumentada para 98 °C. No final do processo de aquecimento, a mistura é resfriada (passivamente ou ativamente, por exemplo, por corrente de ar que escoa através da ventoinha) e movida para pelo menos uma câmara de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 em um volume de pelo menos 0,1 μΐ (na modalidade mostrada nas Figuras 1 e 6, câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 possuem um volume de 20 μΐ) na qual um liofilizado, contendo as quantidades apropriadas de substâncias necessárias para realizar uma reação de amplificação isotérmica específica e detecção de fragmento de material genético selecionado, amplificado durante a reação, é localizado. A liofilização no processo de produção dos componentes da reação permite um aumento significativo na utilidade do cartucho de reação (até mais do que um ano a partir da data de fabricação) , e não é
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16/33 necessário armazenar o cartucho de reação sob refrigeração. A câmara de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 aloja também um corante liofilizado intercalando com o DNA. A colocação do corante na câmara de reação permite a detecção imediata do produto da reação resultante sem que o usuário final tome medidas. Dependendo do corante fluorescente usado, o comprimento da luz que causa o corante intercalante é diferente. Corantes usados para marcação resultarão em luz visivel. 0 corante fluorescente que intercala com o DNA (por exemplo, SYBR Green, EvaGreen, PikoGreen, brometo de etidio, calceina, laranja de acridina, proflavina, acriflavina e outros) é usado para detectar o produto da reação de amplificação.
[0051]Para detecção, de acordo com o primeiro e o segundo aspectos da invenção, a detecção em tempo real do produto de amplificação de ácido nucleico, bem como os oligonucleotideos de técnica de ponto final com uma molécula de ponto quântico ligada na extremidade 5' e um extintor ligado na extremidade 3' . A sequência dos oligonucleotideos usados é complementar à porção da região amplificada do fragmento de ácido desoxirribonucleico localizado entre os iniciadores projetados F1 e Blc e para a porção da região amplificada do fragmento de ácido nucleico localizado entre os iniciadores projetados Flc e BI. Durante a reação de amplificação, uma polimerase tendo uma atividade de deslocamento de cadeia e atividade de
exonuclease 5'>3', é usada, por exemplo, DNA Polimerase
Bst, Comprimento Total [0052]Durante a reação de amplificação do ácido
desoxirribonucleico, a sonda se liga ao fragmento
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17/33 complementar no segmento de DNA amplificado, durante o alongamento do amplicon, devido às propriedades de exonuclease da polimerase, o oligonucleotideo ligado é degradado, o que resulta na separação do extintor do ponto quântico. Como resultado da separação, o extintor do ponto quântico, a radiação eletromagnética é emitida na faixa de UV, IV ou VIS após a excitação do ponto quântico com o comprimento de onda de radiação especifico para o material a partir do qual o ponto quântico foi criado. 0 sinal emitido é registrado pelo elemento fotossensível.
[0053]0 uso de pontos quânticos provoca uma redução significativa no limiar de detecção devido à possibilidade de usar uma fonte de luz de excitação com uma potência maior, graças à qual é possível registrar a emissão de radiação eletromagnética proveniente de uma quantidade muito menor de pontos quânticos liberados. Adicionalmente, o uso de pontos quânticos para marcar fragmentos de oligonucleotídeos permite uma melhor separação do comprimento de onda de excitação do comprimento de onda do sinal de emissão no qual a detecção de radiação eletromagnética ocorre. Além disso, os pontos quânticos têm uma durabilidade de branqueamento aumentada em comparação aos fluorocromos tradicionais, o que facilita a detecção em toda a reação de amplificação.
[0054]De modo a amplificar o produto de reação específico, podem ser usadas as seguintes tecnologias de amplificação isotérmica: Amplificação isotérmica mediada por Malha Fechada (LAMP); Amplificação de Deslocamento de Cadeia (SDA); Amplificação dependente de Helicase (HDA); Reação de amplificação enzimática em Fenda (NEAR). O
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18/33 liofilizado contém as quantidades experimentais de desoxinucleotídeos (dNTPs); sequências iniciadoras específicas, componentes do tampão de reação, ions de magnésio Mg+2; polimerase capaz de realizar uma reação de amplificação; em alguns casos, transcriptase reversa e outros componentes necessários para amplificar a sequência selecionada de material genético. Um conjunto de iniciadores (pelo menos um par de iniciadores) com uma sequência única específica para o genoma de um determinado patógeno determina a especificidade da reação. A água que vem da câmara de isolamento 7 em conjunto com o material dissolvido na mesma é carregada na câmara de reação 8.1,
8.2, 8.3, 8.4.
[0055]0 processo de amplificação de um fragmento de ácido nucleico selecionado ocorre na câmara de reação 8.1,
8.2, 8.3, 8.4 a uma temperatura constante de pelo menos 40°C durante um mínimo de 5 minutos. As sequências iniciadoras específicas ligam-se ao DNA de molde (isolado na câmara de pré-ísolamento 7), derivado dos vários patógenos presentes no material biológico. Se o material biológico é RNA, o processo de amplificação é precedido por transcrição reversa usando os chamados iniciadores aleatórios, resultando em cDNA. Uma vez determinada a especificidade pelo iniciador, a DNA polimerase sintetiza a cadeia complementar. Durante o processo de LAMP cerca de 30 μς/μΐ de DNA são recebidos. Uma quantidade tão grande de DNA de cadeia dupla é mostrada pelos corantes intercalando com o material genético. Ao adicionar um corante fluorescente ao liofilizado, a combinação do corante com o DNA ocorre simultaneamente com a sua amplificação durante a
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19/33 reação. Após a conclusão da reação, a mistura reacional é iluminada com uma luz com um comprimento de onda específico que excita o corante intercalando com o DNA em uma base de fluorescência. A detecção do produto de reação é conseguida registrando, o comprimento de onda emitido pelo complexo de DNA de cadeia dupla e corante, específico para o corante usado, usando a unidade fotocondutora. A construção do cartucho de reação 6 e o material do qual foi feito (isto é, polímero transparente), permite a transmissão da luz, excitando o complexo corante-DNA bem como a luz emitida por este complexo. 0 resultado é interpretado com base na presença de luz ou sua ausência (resultado positivo - luz atual, negativo - sem luz).
Exemplo 2 [0056]Na presente modalidade, o dispositivo para detectar o material genético na amostra biológica compreende, em geral, três elementos principais, isto é, dispositivo de medição (mostrado na forma de um diagrama de blocos na Figura 5), o cartucho de reação 6 e o sistema de amostragem 1. A Figura 1 mostra esquematicamente uma construção de uma modalidade não limitativa do cartucho de reação 6 e do sistema de amostragem 1. O sistema de amostragem conectado 1 e a câmara de reação 6 são arranjados no dispositivo de medição que é projetado para direcionar e controlar todo o processo de análise de material genético. O dispositivo de medição assume a forma de um pequeno dispositivo móvel, tipo um telefone celular, que contém um receptáculo que aloja o cartucho de reação 6.
[0057]O sistema de amostragem 1 compreende um capilar de coleta de sangue 2 que é conectado à câmara de água, que
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20/33 é um tanque de água fechado com um diafragma conectado à câmara de produção de pressão. Tal sistema funciona como a primeira bomba 1 produzindo pressão exercendo água a partir da câmara de água através de um capilar 2 com um material biológico amostrado. A operação apropriada do sistema de amostragem 1 provê a exaustão 3, que forma a ramificação do capilar 2 e das válvulas controladas em conjunto Z1 e Z2. Durante o uso, o sistema de amostragem 1 está em contato com material biológico liquido (por exemplo, sangue), onde o capilar 2 é enchido sob a influência de forças capilares. Ao encher o capilar 2 com material biológico, a válvula Z1 é aberta e a válvula Z2 é fechada para garantir a operação apropriada do sistema. Após o enchimento do capilar 2 com o material biológico, o sistema de amostragem 1 é colocado no cartucho de reação 6. Uma conexão estanque e estável desses elementos é provida por um plugue de conjugação 4 no sistema de amostragem 1 e um receptáculo 5 no cartucho de reação 6. A conexão deste plugue 4 ao receptáculo 5 provê uma conexão fluida estável e vedada entre o sistema de amostragem 1 e o cartucho de reação 6. Depois de colocar o sistema de amostragem 1 no cartucho de reação 6, a válvula Z1 é fechada, a válvula Z2 é aberta e a ativação da primeira bomba PI (isto é, o tanque de água fechado com um diafragma conectado para a câmara de produção de pressão). A ativação da primeira bomba PI ocorre por compressão mecânica da câmara. O método de ativação da primeira bomba PI não é limitante neste caso, e qualquer método conhecido na técnica anterior pode ser usado para transportar o liquido, por exemplo, aquecer com LEDs uma substância com alto coeficiente de expansão térmica. Esta operação remove
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21/33 o material biológico do capilar 2 junto da água da câmara de água. A mistura de água e material biológico é transportada através de um canal adequado para a câmara de isolamento 7. Na câmara de isolamento 7 existe um material capaz de ligar os inibidores de reação de amplificação do material genético, e a câmara de isolamento 7 tem acesso à câmara de água. 0 material biológico coletado é provido a esta câmara de isolamento 7. A capacidade desta câmara de isolamento é de cerca de 100 μΐ. Existe um canal de conexão com uma câmara oca fechada com um diafragma conectado a uma câmara de produção de pressão formando uma segunda bomba geradora de pressão P2, estendendo-se a partir da câmara de isolamento 7. A câmara de isolamento 7 é conectada à segunda bomba P2 por um detector de liquido infravermelho reflexivo Dl e uma válvula normalmente aberta Z3. A segunda bomba P2, por sua vez, é conectada por uma válvula normalmente aberta Z4 com uma exaustão 9 localizada na extremidade do cartucho de reação 6, oposta ao receptáculo 5. Esta configuração 9 das válvulas Z3 e Z4 permite a mistura de material biológico e água a ser introduzida através da câmara de isolamento 7 mais para a segunda bomba P2. Quando as misturas de teste atingem o detector de liquido Dl, a câmara de isolamento 7 sinaliza o seu enchimento e as válvulas Zll e Z3 são fechadas. Em seguida, o material biológico na câmara de isolamento 7 é aquecido a uma temperatura adequada durante um periodo de tempo especificado, o que provoca a liberação do material genético encapsulado no envelope células/proteina.
[0058]Após o estágio de isolamento do material genético da amostra coletada ser concluído, as válvulas Z3, Z5, Z6 e
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Z7 são abertas e a segunda bomba P2 é ativada. As válvulas Z5, Z6 e Z7 são localizadas em canais separados que conectam a câmara de isolamento 7 às câmaras de reação correspondentes 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Cada câmara de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, por sua vez, é conectada a uma exaustão 9 correspondente localizada na borda do cartucho de reação 6, via detectores de liquido Dl, D2, D3, respectivamente, e
normalmente abre as válvulas Z8, Z9, Z10, respectivamente.
A ativação da segunda bomba P2, em conjunto com a
configuração das válvulas Z5, Z6, Z7 e Z8, Z9, Z10 permite
que o material genético isolado seja movido para as câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Depois de receber o sinal dos detectores de liquido Dl, D2, D3, as válvulas Z8, Z9, Z10 são fechadas. Então, as válvulas Z5, Z6 e Z7 são fechadas em seguida. Desta maneira, as câmaras de reação 8.1, 8.2,
8.3, 8.4 são enchidas com o material genético isolado. As câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 contêm reagentes liofilizados no seu volume, contendo todos os ingredientes necessários para a amplificação do material genético. A mistura principal nas câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 compreende também um corante fluorescente liofilizado que intercala com material genético. A capacidade das câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 está na faixa de 20 μΐ a 25 μΐ. Na presente modalidade, três câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 são providas, incluindo uma câmara de teste 8.1 compreendendo iniciadores específicos para o material genético testado, uma câmara de controle positivo 8.2 que contém iniciadores específicos para uma porção particular do material genético a partir do qual a amostra de material biológico é derivada e uma câmara de controle negativo 8.3
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23/33 que não contém iniciadores, mas outros componentes de reação. A câmara de controle positivo 8.2 é projetada para permitir o controle da polimerase, condições de temperatura e o isolamento do material genético. A câmara de controle negativo 8.3 permite controlar o processo de liofilização (por exemplo, esterilidade) e controlar o comportamento da válvula, o que poderia causar a mistura do conteúdo destas câmaras de reação. Naturalmente, o número de câmaras usadas não é uma limitação da presente invenção, e a pessoa qualificada na técnica, por exemplo, usará um aumento simultâneo no número de câmaras 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 para a análise simultânea de patógenos diferentes.
[0059]Para amplificar o material genético, as câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 são então aquecidas a temperaturas apropriadas, o que amplifica o material genético. Simultaneamente com a amplificação (ou subsequentemente), o sinal de fluorescência detectado a partir da etiqueta fluorescente usada é ligado ao material genético amplificado. O incremento do produto é igual ao aumento da intensidade da luz gerada pela etiqueta fluorescente usada.
[0060]Após todo o processo e lendo o resultado pelo sistema óptico com a câmera 28, as regiões contendo o material biológico são aquecidas com LEDs UV 29 emitindo radiação em comprimentos de onda que variam de 350 nm a 450 nm (ou laser) a 150°C por 2 a 3 segundos para neutralizar o risco biológico. A baixa potência de UV, estes LEDs UV 29 servem simultaneamente para excitar a fluorescência (iluminar o cartucho de reação 6). A exposição a UV resulta na destruição do material biológico e na despolimerização
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24/33 do material da câmara de reação 6, o que reduz o risco biológico e desintegra o polímero, protegendo favoravelmente o ambiente e garantindo o descarte apropriado.
[0061]Ao longo do processo de análise de material biológico, o tratamento térmico do material biológico líquido é realizado na câmara de isolamento 7 e nas câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. A energia necessária para aquecer a câmara de isolamento 7 e as câmaras de reação
8.1, 8.2, 8.3, 8.4 é comunicada sem contato. A fonte de energia é de diodos emissores de luz LED, que emitem radiação de luz da faixa UV-VIS. Por exemplo, comprimentos de onda emitidos por LEDs podem ser selecionados de 350 nm a 500 nm. Os diodos emissores de luz são localizados no interior do dispositivo de medição e são arranjados para iluminar a área da câmara de isolamento 7 e das câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Usando um material transparente para a construção do cartucho de reação 6, que é caracterizado por uma alta transmissão de luz, é possível usar um método de aquecimento com eficiência energética para as respectivas câmaras. A temperatura da câmara de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 e da câmara de isolamento 7 é controlada sem contato por um pirômetro com um bloco de processamento digital. Todo o sistema é controlado por uma unidade de microprocessador com software incorporado. Além disso, o LED UV de baixa potência é usado no dispositivo de medição para iluminar o interior do reator, que é necessário para registro de imagens pelo CCD. A detecção do produto de reação bioquímica baseia-se na determinação dos níveis quantificados de sinais dos canais de RGB do
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25/33 detector CCD. 0 projeto do dispositivo permite o registro contínuo de sinais de cor. 0 uso do diodo de iluminação permite o registro contínuo da imagem pelo detector, uma vez que não é necessário iluminar constantemente a amostra com uma fonte de luz externa.
[0062]A construção do dispositivo de medição de acordo com uma modalidade da presente invenção é mostrada na forma de diagrama de blocos na Figura 5. Em geral, uma câmara de medição 10 que construa de modo que aloje um cartucho de reação 6 distingue-se no dispositivo de medição. De modo a posicionar apropriadamente o cartucho de reação 6 na câmara de medição 10, um mecanismo de posicionamento 11 do cartucho de reação 6 é provido. A câmara de medição 10 é uma estrutura fechada que é coberta por um isolamento térmico externo 12, o que facilita manter a temperatura ajustada no interior. A manutenção da temperatura controlada isotérmica dentro da câmara de medição 10 (por exemplo, na faixa de 4°C a 40°C) assegura o sistema de aquecimento 13 (por exemplo, na forma de um conjunto Peltier). De modo a distribuir apropriadamente o ar aquecido no interior da câmara de medição 11, uma ventoinha 14 e uma roda de mistura de ar 22 são usados. A eficiência do sistema de aquecimento 13 é também assegurada pelo radiador 15 localizado fora da câmara de medição 10. O dispositivo de medição também contém outros blocos necessários para o funcionamento apropriado do dispositivo, tal como o módulo de controle e análise de imagem 16, o módulo de comunicação 17, o módulo de fonte de alimentação 18, e o visor 19. A funcionalidade dos blocos acima mencionados e a sua construção são bem conhecidos dos
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26/33 qualificados na técnica, de modo que sua sua descrição exata seja omitida para simplificar a discussão. A câmara de medição 20 do dispositivo de medição também provê o mecanismo de fixação de pressão 10 com a finalidade de ativar a bomba PI no cartucho de reação 6. Um sensor de pressão 21 é localizado oposto ao controle da pressão fixada na bomba Pl. De modo a assegurar uma temperatura correta na câmara de isolamento 7 e nas câmaras de reação
8.1, 8.2, 8.3, 8.4, um número de unidades de aquecimento 23 é provido na câmara de medição 10, que são então posicionadas em relação ao cartucho de reação 6, que as correntes de luz emitidas iluminam a câmara de isolamento 7 e as câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, respectivamente. Mais especificamente, cada unidade de aquecimento 23 consiste em LED com radiadores 24, um detector de temperatura 25 e um estabilizador de detector de temperatura 26. O aquecimento da câmara de isolamento 7 e da câmara de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 é realizado com LEDs com uma corrente de energia de fótons continuamente ajustável variando de 400 nm a 500 nm, o que é preferido devido ao alto desempenho de emissão de fótons e se traduz em alta potência, alcançando a camada de absorção no fundo da câmara de isolamento 7 e das câmaras do reator 8.1, 8.2,
8.3, 8.4. A fim de compensar a temperatura do fundo da câmara 7, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 e absorção de energia, para evitar a degradação do material biológico liofilizado nas câmaras 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, a camada de absorção completamente absorvendo energia de fótons foi usada. A camada é feita de materiais, por exemplo, Cu ou Al revestido com óxidos (no presente exemplo AI2O3, corante
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27/33 negro) e outros materiais com propriedades de boa absorção e boa condutividade térmica (incluindo polímeros modificados, por exemplo, carbono ou grafeno).
[0063]0 aumento da temperatura ao longo do tempo nas câmaras 7, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 é conseguido aumentando a potência da corrente de luz e diminui através da câmara de medição isotérmica 10 a uma temperatura de 4°C a 40°C. Com a resistência térmica constante da câmara de isolamento 7 ou da câmara do reator 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 na circunvizinhança, a taxa da temperatura decrescente pode ser controlada alterando a temperatura ambiente do cartucho da reação 6. Dependendo da taxa de diminuição da temperatura desejada, a temperatura dentro do dispositivo (isto é, na câmara de medição 10) é fixada e uma potência adequada é aplicada à camada de absorção das câmaras 7,
8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Desta forma, qualquer perfil de temperatura pode ser obtido na faixa de 25°C a 100°C com altas taxas de aumento e diminuição. A camada de absorção das câmaras tem uma alta condutividade térmica que elimina a possível heterogeneidade da corrente de luz dos LEDs e não garante gradientes de temperatura na área das câmaras de trabalho.
[0064]Como a medição de temperatura é feita por um detector de temperatura, como um pirômetro com um filtro permeável à radiação incorporado na faixa de 8 μπι a 12 μπι, é possível medir simultaneamente a temperatura e alimentar energia para as câmaras de isolamento 7 e câmaras de reação
8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Neste caso, não há períodos de falta de controle sobre o controle de temperatura nas câmaras de isolamento 7 e nas câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4.
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28/33
Além disso, não há picos de temperatura associados à operação do controlador PID, e não há necessidade de controle de potência por meio da modulação por largura de pulso PWM, que tem a vantagem de produzir menos ruído térmico.
[0065] Além disso, uma série de LEDs 27, arranjados analogamente de modo que o feixe de luz gerado, ilumine o dispositivo, é provida para operar as válvulas Zl-Zll e os detectores de líquido D1-D4. O sistema óptico com a câmera 28, que pode ter a forma de um detector CCD e é destinado a detectar o sinal luminoso resultante dos corantes fluorescentes resultantes da reação na câmara de reação
8.1, 8.2, 8.3, 8.4. De modo a permitir que estes LEDs UV 29 também sejam providos, que iluminam a área de detecção.
Exemplo 2 [0066]A Figura 2 mostra esquematicamente outra modalidade do cartucho de reação 6 usado no dispositivo para detectar material genético em uma amostra biológica de acordo com a presente invenção. O projeto geral e o princípio de operação do cartucho de reação 6 mostrado na presente modalidade é consistente com a construção e o princípio de operação do cartucho de reação 6 do Exemplo 1. A diferença fundamental entre os cartuchos de reação comparativos 6 é que no cartucho de reação 6 do exemplo 2 integrado no sistema de amostragem 1 é usado (não é um dispositivo separado como na primeira modalidade do presente invenção). O cartucho de reação 6 é, portanto, uma estrutura compacta, desprovida de elementos destacáveis. Neste caso, o material biológico coletado é introduzido no sistema de amostragem 1, que forma uma parte integrante do
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29/33 cartucho de reação 6. Também neste exemplo, o capilar 2 pode ser distinguido, o que, por meio das forças capilares, absorve o material biológico. Na outra extremidade do capilar 2, é provida uma janela de controle 30 que assinala o enchimento do capilar 2 com o material biológico. Na presente modalidade, a primeira bomba Pi é feita por meio de elementos mecânicos, tais como, pistão e foles. Nesta modalidade, deve ser enfatizado que a água para a câmara de reação 6 é provida na forma de cápsulas, o que permite uma esterilização fácil e a possibilidade de separar o processo a úmido na produção das câmaras de reação 6. A liberação de água ocorre pouco antes do teste, e é realizada por injeção de agulha 31 quando a bomba Pi começa a operar. O transporte do material biológico e dos produtos da câmara de isolamento 7 para as câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 é provido pela bomba Pi por extrusão da água da cápsula. Isso simplifica o controle do processo no dispositivo. A pressão adequada durante o aquecimento é provida pelo sensor de pressão 21 no dispositivo de medição e o controle correspondente das válvulas Z5, Z8, Z9, Z10. Nesta modalidade, a construção de câmaras de reação 8.1,
8.2, 8.3, 8.4 também merece ser mencionada. Cada uma das câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 em uma vista de topo são círculos complementares. As câmaras de reação 8.1, 8.2,
8.3, 8.4 complementam uma à outra para formar uma região circular compreendendo todas as câmaras de reação 8.1, 8.2,
8.3, 8.4, conectadas no meio por meio de um (a) válvula ou diafragma 33. Nesta modalidade, vários projetos de válvulas 33 podem ser usados para não afetarem a totalidade da modalidade. Válvulas exemplificativas 33, utilizáveis nos
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30/33 cartuchos de reação 6, são mostradas na Figura 4 A-D, válvula circular hidrofóbica, válvula redonda hidrofóbicamecânica, válvula elíptica hidrofóbica-mecânica, válvula retangular hidrofóbica-mecânica, respectivamente. As válvulas mecânicas apresentadas atuam na deformação do material flexível a partir do qual a válvula foi feita. Uma força específica é necessária, o que ao mesmo tempo define a pressão, que tendo sido excedida faz com que o fluxo de líquido em uma determinada direção. A forma da válvula é de modo que na segunda direção, a deformação elástica seja bloqueada, bloqueando assim o fluxo de líquido para essa direção. As válvulas hidrofóbicas operam com base no princípio de que o líquido deve superar as forças de tensão superficial em contato com o material da válvula hidrofóbica (enquanto o ar flui livremente). Isto permite bloquear o fluxo do líquido no canal até uma predeterminada pressão, dependendo do diâmetro da abertura na válvula e da hidrofobicidade do material a partir do qual a válvula é feita. No caso de enchimento simultâneo dos três canais com o líquido, após a colocação das válvulas hidrofóbicas nas extremidades dos canais, elas serão automaticamente preenchidas. O ar fluirá sem obstruções, e o líquido irá parar sucessivamente nessas válvulas, porque será necessária mais pressão para que o líquido flua através das válvulas. A combinação desses dois tipos de válvulas facilita o controle do fluxo de líquido no cartucho de reação 6.
[0067] Além disso, na presente modalidade nenhuma bomba adicional P2 é usada e substancialmente o número de válvulas usadas foi reduzido (comparado com o cartucho de
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31/33 reação 6 da primeira modalidade). Além disso, devido à construção das câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, os canais de saida são direcionados para as três bordas diferentes do cartucho de reação 6 e as câmaras de compensação 33 são providas antes da exaustão 9 para evitar que o liquido saia do cartucho de reação 6 para o dispositivo de medição.
[0068]Os outros componentes e o principio de operação do cartucho de reação 6 coincidem com os descritos na primeira modalidade do cartucho de reação 6.
Exemplo 3 [0069]O cartucho de reação 6 mostrado na Figura 3, sendo ainda outra modalidade da presente invenção, difere do cartucho de reação 6 mostrado na Figura 2 apenas em que em cada câmara de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 duas válvulas 33 são usadas na entrada e na saida da câmara de reação
8.1, 8.2, 8.3, 8.4) e um canal de conexão 34 que se destina a prover um fluxo de liquido estável e controlado em uma direção com variações de pressão provocadas pelo aquecimento das câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Na solução apresentada na presente modalidade, em contrato com a solução apresentada na segunda modalidade, não existem válvulas Z8 e Z10, o que simplifica grandemente o projeto do cartucho de reação 6 e a sua operação. O canal de conexão 34 serve para fazer exaustão das câmaras de reação
8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Devido ao fato de as válvulas impedirem a retração do liquido, não existe mistura descontrolada do liquido nas câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Colocar duas válvulas nas câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 permite o uso de apenas uma válvula normalmente aberta na
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32/33 saída para garantir a operação apropriada do sistema.
Exemplo 4 [ 0070]Detecção de HIV no sangue usando o método da presente invenção e o dispositivo da presente invenção.
[0071]Analisar a presença do vírus HIV em uma amostra retirada de um paciente, um método e um dispositivo para a detecção de material genético em uma amostra biológica de acordo com a presente invenção, descrita em detalhes nos Exemplos 1 e 2. Na câmara de isolamento 7 é usado o Chelex 100. O isolamento do DNA envolve a degradação térmica da membrana celular ou do envelope da proteína viral e a liberação de material genético que é encapsulado no (as) células virais/envelope de proteína. O Chelex 100 é necessário para capturar inibidores que possam bloquear a polimerase e produzir resultados falso negativos. O Chelex 100 é preparado como uma mistura a 5% em água deionizada,
livre de nuclease, pode também ser imobilizado no fundo da
câmara de isolamento na forma de uma camada porosa. Para
realizar isolamento na câmara de isolamento, o sangue é
aquecido a 95°C por 5-10 min.
[0072]Reagentes liofilizados, incluindo tampão, dNTPs, MgSCA, Misturador de Iniciadores, polimerase Bst 3.0, SYBR Green estão nas câmaras de reação. A amplificação do material genético é realizada nas câmaras de reação 8.1,
8.2, 8.3, 8.4 por aquecimento a 65°C durante 30 min.
Existem iniciadores de HIV específicos na câmara de teste
8.1. Na câmara de controle positivo endógeno 8.2 existem iniciadores específicos para o gene humano. Na câmara de controle negativo 8.3 não existem iniciadores adicionados, mas contém os outros componentes da reação. A reação e
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33/33 detecção de LAMP - ocorre nas câmaras de reação 8.1, 8.2,
8.3, 8.4 e consiste na amplificação do material genético de um determinado patógeno (e material genético humano para controle endógeno) usando a enzima polimerase Bst 3.0. Iniciadores específicos adicionados à reação são ligados a fragmentos selecionados do genoma testado e determinam o fragmento amplificado na reação. No final da reação, aproximadamente 10-50 gg/μΐ do fragmento de DNA amplificado são formados. O SYBR Green presente na mistura reacional é combinado com o produto da reação e, quando combinado com o DNA de cadeia dupla, torna-se fluorescente (ilumina-se quando a luz é de comprimento suficiente). O incremento do produto é igual ao aumento da luz do corante. No final da reação, quando o resultado é positivo e o fragmento testado é luz amplificada visível, quando o resultado é negativo, não há luz. Outros componentes de reação (tampão, MgSO4, dNTPs) são adicionados para prover condições de trabalho adequadas para a polimerase Bst 3.0.
[0073]No processo de isolamento do material de DNA/RNA na câmara de reação, o patógeno é neutralizado. O único perigo pode ser o resíduo do material genético no capilar 2 ou canais no cartucho de reação 6. Assim, após a detecção, o resíduo do material genético é reciclado, que é realizado expondo o cartucho de reação 6 (em particular, a câmara de isolamento 7 e as câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4) para radiação UV para aquecer os componentes individuais até uma temperatura acima de 100°C e deste modo descartar o material genético. Isso permite descartar com segurança o cartucho de reação usado 6 sem a necessidade de realizar procedimentos complicados de descarte.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para detectar material genético em uma amostra biológica, incluindo os seguintes estágios:
    a) a amostra biológica é carregada no cartucho de reação (6) e depois ou antes que o cartucho de reação (6) seja colocado no dispositivo de medição,
    b) a amostra biológica coletada é levada para a câmara de isolamento (7),
    c) isolamento de material biológico da amostra testada por aquecimento da câmara de isolamento (7),
    d) o material genético isolado é movido para uma pluralidade de câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4),
    e) o material genético é amplificado aquecendo as câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), caracterizado pelo fato de que no interior de pelo menos uma das câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4,) estão presentes reagentes liofilizados para amplificação de material genético em conjunto com corante de fluorescência, compreendendo corante de fluorescência ou material genético de ligação por pontos quânticos a ser detectado, enquanto que, simultaneamente com o estágio de amplificação do material genético, uma detecção do sinal de fluorescência de etiquetas fluorescentes é registrada.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma amostra biológica é retirada de um sistema de amostragem (1) e estágio a) é realizado carregando o sistema de amostragem (1) no cartucho de reação (6), em que o aquecimento da câmara de isolamento (7) e/ou câmara de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4) é realizado através de uma pluralidade de unidades de
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    2/7 aquecimento em LED com detectores de temperatura (23), emitindo, de preferência, radiação eletromagnética com um comprimento de onda na faixa de 350 nm a 530 nm, e a unidade de aquecimento de LEDs com detectores de temperatura (23) compreende um detector de temperatura óptico (25) que detecta radiação eletromagnética na faixa de comprimento de onda de 4 μπι a 12 μπι.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma amostra biológica é retirada usando forças capilares para o capilar (2) no sistema de amostragem (1) e reagentes liofilizados para desoxinucleotideos de amplificação de material genético, sequências iniciadoras especificas, tampão de reação, ions de magnésio Mg+* 2 * 4 5, de preferência na forma de MgSCM, polimerase capaz de realizar uma reação de amplificação, de preferência polimerase Bst 3.0, em que a etiqueta fluorescente liofilizada intercalando com o material genético detectado é SYBR Green.
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o cartucho de reação (6) compreende três câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), incluindo uma câmara de teste (8.1) incluindo iniciadores específicos para o material genético testado, uma câmara de controle positivo (8.2) que contém iniciadores específicos para uma porção particular do material genético do qual a amostra de material biológico é derivada e uma câmara de controle negativo (8.3), contendo componentes de reação sem iniciadores.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as câmaras de reação (8.1,
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    3/7
    8.2, 8.3, 8.4) em uma vista de topo são círculos, complementares e interconectados no meio com uma válvula ou um diafragma (33).
  6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que no estágio c) a câmara de isolamento é aquecida a 95°C de 5 minutos min a 10 min, em que no estágio e) as câmaras de reação (8.1, 8.2 , 8.3, 8.4) são aquecidas a 65°C de 15 minutos a 60 minutos e o estágio b) é realizado por meio de uma primeira bomba (Pl), de preferência, na forma de um tanque de água fechado com um diafragma conectado a um (a) câmara ou pistão e foles de produção de pressão e a etapa d) é realizada por meio de uma segunda bomba (P2), de preferência, na forma de uma câmara oca fechada com um diafragma conectado a uma câmara de produção de pressão e compreende um estágio de aquecimento de um cartucho de reação (6) até temperaturas acima de 100°C, de preferência através de um número de unidades de aquecimento em LEDs com detectores de temperatura (23).
  7. 7. Dispositivo para detectar material genético em uma amostra biológica compreendendo um cartucho de reação (6) e dispositivo de medição, o dispositivo de medição compreendendo uma câmara de medição (10) tendo um receptáculo alojando o cartucho de reação (6), em que o cartucho de reação (6) compreende uma câmara de isolamento (7) para isolar material genético, que é conectado com as câmaras de reação através dos canais (8.1, 8.2, 8.3, 8.4) para amplificar material genético isolado, caracterizado pelo fato de que dentro de pelo menos uma das câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4,) estão presentes reagentes
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    4/Ί liofilizados para amplificação de material genético em conjunto com corante luminescente, compreendendo corante de fluorescência ou material genético de ligação por pontos quânticos a ser detectado, enquanto simultaneamente com o estágio de amplificação de material genético, uma detecção do sinal luminescente de marcadores luminescentes é registrada.
  8. 8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende um sistema de amostragem destacável (1), o sistema de amostragem destacável (1) compreendendo um tampão (4) e o cartucho de reação (6) compreendendo um receptáculo (5) encaixado ao referido plugue (4) e provendo uma conexão fluida estável e estanque entre o sistema de amostragem (1) e o cartucho de reação (6) e um módulo de medição para controle e análise de imagem (16), módulo de comunicação (17), módulo de fonte de alimentação (18) e módulo de exibição (19).
  9. 9. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, o dispositivo de medição caracterizado pelo fato de compreender uma pluralidade de unidades de aquecimento em LEDs com detectores de temperatura (23), emitindo, de preferência, radiação eletromagnética com um comprimento de onda na faixa de 350 nm a 530 nm, arranjadas substancialmente opostas à câmara de isolamento (7) e às câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), de modo que os feixes de luz emitidos pela referida pluralidade de LEDs iluminem a referida câmara de isolamento (7) e câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), em que a unidade de aquecimento de LEDs com detectores de
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    5/7 temperatura compreende um detector de temperatura óptico que detecta radiação eletromagnética na faixa de comprimento de onda de 4 μπι a 12 μπι, e câmaras de reação 8.1, 8.2, 8.3, 8.4) em uma vista de topo são circulos complementares e interconectados no meio com uma válvula ou um diafragma.
  10. 10. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o sistema de amostragem (1) compreende um capilar (2) ao qual uma amostra biológica é retirada, conectada com uma primeira bomba (Pl), de preferência, na forma de um tanque de água fechado com um diafragma conectado a uma câmara ou pistão e foles de produção de pressão e reagentes liofilizados para desoxinucleotideos de amplificação de material genético, sequências de iniciadores específicos, tampão de reação, ions de magnésio Mg+2, de preferência na forma de MgSCR, polimerase capaz de realizar uma reação de amplificação, de preferência polimerase Bst 3.0, em que a etiqueta fluorescente liofilizada intercalando com o material genético detectado é SYBR Green.
  11. 11. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o cartucho de reação (6) compreende três câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), incluindo uma câmara de teste (8.1) incluindo iniciadores específicos para o material genético testado, uma câmara de controle positivo (8.2) que contém iniciadores específicos para uma porção particular do material genético do qual a amostra de material biológico é derivada e uma câmara de controle negativo (8.3), contendo componentes de reação sem iniciadores, em que o cartucho de
    Petição 870190056121, de 17/06/2019, pág. 48/60 ζ>/Ί reação (6) compreende uma segunda bomba (P2), de preferência, na forma de uma câmara vazia fechada com um diafragma conectado a uma câmara de produção de pressão, conectada à câmara de isolamento (7) e produzindo pressão causando o movimento de material genético isolado da câmara de isolamento (7) para as câmaras de reação (8.1, 8.2,
    8.3).
  12. 12. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que o cartucho de reação (6) e/ou sistemas de amostragem (1) é(são) feito(s) de um polímero hidrofóbico e é(são) um sistema totalmente passivo, em que a câmara de isolamento (7) e as câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4) bem como a segunda bomba (P2) no cartucho de reação (6) compreendem as válvulas (Zll), (Z5, Z6, Z7), (Z8, Z9, Z10), (Z3), (Z4), de preferência ópticas, nos canais de entrada e saída, respectivamente.
  13. 13. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 27, caracterizado pelo fato de que no canal que conecta a câmara de isolamento (7) com a segunda bomba (P2) existe um detector de líquido (Dl), de preferência um infravermelho reflexivo, em que os detectores de líquido (D2, D3, D4), de preferência infravermelhos reflexivos, são localizados nos canais de saída das câmaras de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4), e a câmara de medição (10) tem uma temperatura isotérmica controlada na faixa de 4°C a 40°C, realizado através de um sistema de aquecimento (13), de preferência, na forma de um conjunto Peltier e o sistema de aquecimento (13) compreende uma ventoinha conectada (14) e um radiador (15), e um roda
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    7/7 de mistura de ar (22) é localizada na câmara de medição (10) .
  14. 14. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que a câmara de medição (10) é isolada com isolamento térmico (12) e um mecanismo de posicionamento (11) do cartucho de reação (6) e um mecanismo de fixação de pressão (20) exercendo uma pressão sobre a bomba (Pl) no cartucho de reação (6) e um sensor de pressão fixado opostamente (21) e LEDs UV adicionais (29) iluminando a área de detecção.
  15. 15. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende LEDs adicionais (27) para operar detectores de líquido (D1-D4) e válvulas (Zl-Zll) e no fundo da câmara de isolamento (7) e/ou da câmara de reação (8.1, 8.2, 8.3, 8.4) existe uma camada de absorção que absorve energia de fótons, de preferência feita de Cu ou Al revestido com óxidos, de preferência, tingida com AI2O3 preto.
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