ES2913092T3 - Un método para detectar material genético en una muestra biológica y un dispositivo para su implementación - Google Patents

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Abstract

Un método de detección de material genético en una muestra biológica que incluye las siguientes etapas: a) la muestra biológica se carga en un cartucho de reacción (6) y después o antes de que el cartucho de reacción (6) se coloque en un dispositivo de medición, comprendiendo el dispositivo de medición una cámara de medición (10) que tiene un receptáculo que aloja el cartucho de reacción (6), en el que el cartucho de reacción (6) comprende una cámara de aislamiento (7) para aislar material genético, que está conectada con cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) a través de canales, para amplificar material genético aislado, b) la muestra biológica recogida se lleva a la cámara de aislamiento (7), c) se aísla material biológico de la muestra sometida a prueba calentando la cámara de aislamiento (7), d) el material genético aislado se traslada a una pluralidad de cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), y e) el material genético se amplifica calentando las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), caracterizado porque: dentro de al menos una de las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) están presentes reactivos secados por congelación para la amplificación de material genético junto con colorante luminiscente, que comprende colorante de fluorescencia o puntos cuánticos que se unen al material genético que va a detectarse, en el que simultáneamente con la etapa de amplificación de material genético se registra una detección de señal luminiscente a partir de marcadores luminiscentes, el dispositivo de medición comprende una pluralidad de unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura (23) dispuestos sustancialmente opuestos a la cámara de aislamiento (7) y/o cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) de manera que los haces de luz emitidos por dicha pluralidad de LED iluminan dicha cámara de aislamiento (7) y/o cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), y el calentamiento de la cámara de aislamiento (7) y/o la cámara de reacción (8.1, 8.2, 8.3) se realiza a través de la pluralidad de unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura (23), y en la cámara de aislamiento (7) está presente material capaz de unirse a los inhibidores de reacción de amplificación.

Description

DESCRIPCIÓN
Un método para detectar material genético en una muestra biológica y un dispositivo para su implementación
En el presente documento se da a conocer un método de detección de material genético (incluyendo ADN y ARN) en una muestra de material biológico, en particular usando tecnología LAMP (Loop-mediated Isothermal AMPplification, amplificación isotérmica mediada por bucle) para amplificar material genético y el dispositivo para su implementación. El método se usa para la detección rápida y móvil de bacterias, patógenos virales y fúngicos en el material biológico obtenido.
Actualmente existe una demanda de métodos de diagnóstico rápidos, económicos y eficaces para identificar patógenos bacterianos, víricos y fúngicos que pueden ser contaminantes microbianos, por ejemplo de productos alimenticios. La solicitud de patente estadounidense US2009061450A1 da a conocer un dispositivo para el diagnóstico y ensayo de patógenos respiratorios, que comprende un dispositivo de muestreo nasal, un cartucho microfluídico desechable de una sola entrada para la amplificación de ácido nucleico diana y un instrumento con plataforma de control de ensayo a bordo y medios de detección de diana. Un dispositivo para el muestreo es un portamuestras que se coloca en un receptáculo apropiado en un cartucho microfluídico de modo que estén conectados de manera sellada y fluida entre sí. Pueden distinguirse varias cámaras en el cartucho microfluídico, donde se realizan etapas posteriores del método de ensayo de patógenos, en donde la primera etapa incluye el aislamiento de material genético de la muestra sometida a prueba, el material aislado se amplifica entonces y se somete a detección. En una realización de la solución citada, la amplificación del material genético se logra usando el método de LAMP. En la cámara de reacción, donde tiene lugar la amplificación, es necesario proporcionar una temperatura ajustada y estable, que en la solución presentada se logra mediante el elemento de calentamiento ITO impreso en un dispositivo microfluídico. Se añade una etiqueta fluorescente que se intercala con material genético después de realizar la amplificación del material genético, lo que permite la detección óptica en tiempo real.
A su vez, la solicitud de patente estadounidense US2012264132A1 da a conocer un dispositivo y método de procesamiento de muestras, incluyendo esencialmente amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. El dispositivo comprende un primer sustrato que tiene una primera área de población, teniendo al menos un área de la primera población al menos un área satelital dispuesta próxima a la al menos un área, y estando al menos un área satelital adaptada para retener material de la primera área. El dispositivo comprende adicionalmente un segundo sustrato que tiene una segunda área de población formada en el mismo, estando los sustratos primero y segundo acoplados entre sí de tal manera que el movimiento relativo entre los sustratos primero y segundo coloca al menos algunas de las primeras áreas de población en alineación con al menos algunas de las segundas áreas de población de modo que estén en comunicación de fluidos entre sí. Amplificación del material genético usando el dispositivo mencionado que consiste en poner en contacto un material de muestra dispuesto en una pluralidad de primeras áreas, comprendiendo el material de muestra una diana de ácido nucleico, y conteniendo al menos una de las primeras áreas una molécula de la diana de ácido nucleico, con un material reactivo dispuesto en una pluralidad de segundas áreas, efectuándose el contacto mediante la colocación por parejas de al menos algunas de las primeras áreas y al menos algunas de las segundas áreas en comunicación de fluidos directa entre sí. Dicho contacto de los materiales efectúa la amplificación de la molécula diana de ácido nucleico.
La solicitud de patente estadounidense US20140335527A1 da a conocer un sistema y método para el análisis móvil de ácidos nucleicos y proteínas. El sistema de análisis móvil es un pequeño dispositivo inalámbrico, que se comunica con el usado por medio de la pantalla y el teclado. El sistema de análisis móvil usa módulos conectados para extraer, amplificar y detectar ácidos nucleicos de las muestras. Todo el proceso, junto con el procesamiento de datos, tarda habitualmente no más de 20 minutos. En la primera etapa del método de análisis de material genético, la muestra biológica se carga sobre un chip integrado. La carga de la muestra biológica puede lograrse manualmente, a través del puerto de entrada de muestra o a través de un muestreo automatizado. En el chip integrado, la muestra se transporta a un módulo de extracción en el que se realiza el proceso de extracción de material genético de la muestra biológica. Los ácidos nucleicos aislados se transportan después al módulo de amplificación, en el que en una realización la amplificación se realiza usando el método de LAMP. Los métodos de extracción y amplificación contienen todos los reactivos necesarios para llevarlos a cabo. La amplificación requiere retener una temperatura aumentada establecida, lo que puede lograrse a través de elementos de calentamiento por infrarrojos. El material genético amplificado va al módulo de detección en el que se detecta, por ejemplo, mediante una señal fluorescente derivada de etiquetas apropiadas unidas al ADN detectado. Por lo tanto, una de las cámaras de amplificación de material genético puede estar precargada con, por ejemplo, mezcla maestra de LAMP etiquetada con fluorescencia. Todo el chip integrado es transparente, lo que permite la transmisión de haces de luz para calentar los módulos respectivos y detectar la señal de fluorescencia.
El documento WO2016/172724 da a conocer un dispositivo para detectar un ácido nucleico diana en una muestra biológica, comprendiendo el dispositivo una cámara de entrada de muestra, una cámara de lisis, una cámara de transcripción inversa y una cámara de amplificación con reactivos liofilizados ubicados a lo largo de los canales intermedios.
Un problema técnico que ha de resolverse es proporcionar un método de detección de material genético (en particular ADN y/o ARN) en una muestra de material biológico y el dispositivo para su implementación que permita la detección rápida de patógenos preferidos, al mismo tiempo, el dispositivo será simple de construir, completo, móvil, relativamente económico de fabricar y permitirá un almacenamiento de cartuchos de reacción durante períodos de tiempo prolongados y no estará asociado con condiciones de almacenamiento específicas tales como temperaturas muy bajas. También se prefiere que los cartuchos de reacción, que son parte del dispositivo para detectar el patógeno en la muestra de material biológico, sean adecuados para su eliminación y que el propio dispositivo tenga un consumo de energía limitado. Además, se prefiere que el método desarrollado de detección de patógenos reduzca el número de etapas requeridas, haciendo que sea más simple y rápido de implementar y que la construcción del dispositivo para su implementación proporcione un riesgo reducido de contaminación de la muestra de material biológico. Sorprendentemente, los problemas mencionados anteriormente se han resuelto mediante la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento se da a conocer un método de detección de material genético en una muestra biológica que incluye las siguientes etapas:
a) la muestra biológica se carga en un cartucho de reacción y después o antes de que el cartucho de reacción se coloque en un dispositivo de medición,
b) la muestra biológica recogida se lleva a una cámara de aislamiento,
c) se aísla material biológico de la muestra sometida a prueba calentando la cámara de aislamiento,
d) el material genético aislado se traslada a una pluralidad de cámaras de reacción, y
e) el material genético se amplifica calentando las cámaras de reacción,
caracterizado porque: dentro de al menos una de las cámaras de reacción están presentes reactivos secados por congelación para la amplificación de material genético junto con colorante luminiscente, que comprende colorante de fluorescencia o puntos cuánticos que se unen al material genético que va a detectarse, en el que simultáneamente con la etapa de amplificación de material genético se registra una detección de señal luminiscente a partir de marcadores luminiscentes; el dispositivo de medición comprende una pluralidad de unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura dispuestos sustancialmente opuestos a la cámara de aislamiento y/o cámaras de reacción de manera que los haces de luz emitidos por dicha pluralidad de LED iluminan dicha cámara de aislamiento y/o cámaras de reacción, y el calentamiento de la cámara de aislamiento y/o cámara de reacción se realiza a través de la pluralidad de unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura; y en la cámara de aislamiento está presente material capaz de unirse a los inhibidores de la reacción de amplificación.
En realizaciones preferidas, se toma una muestra biológica de un sistema de muestreo y la etapa a) se realiza cargando el sistema de muestreo en el cartucho de reacción (6).
En otra realización preferida, el calentamiento de la cámara de aislamiento y/o la cámara de reacción comprende emitir radiación electromagnética con una longitud de onda en el intervalo de 350 nm a 530 nm.
En otra realización preferida, la unidad de calentamiento de LED con detectores de temperatura comprende un detector de temperatura óptico que detecta radiación electromagnética en el intervalo de longitud de onda de 4 |im a 12 |im.
En otra realización preferida, se toma una muestra biológica usando fuerzas capilares para el tubo capilar en el sistema de muestreo.
Preferiblemente, reactivos liofilizados para la amplificación de material genético incluyen desoxinucleótidos, secuencias de cebadores específicos, tampón de reacción, iones de magnesio Mg2+, preferiblemente en forma de MgSO4, polimerasa capaz de llevar a cabo una reacción de amplificación, preferiblemente polimerasa Bst 3.0.
De manera igualmente preferible, la etiqueta fluorescente liofilizada que se intercala con material genético detectado es SYBR Green.
Para la detección, la detección en tiempo real del producto de amplificación de ácido nucleico, así como los oligonucleótidos de la técnica de punto final con una molécula de punto cuántico unida en el extremo 5' y un extintor unido en el extremo 3. La secuencia de los oligonucleótidos usados puede ser complementaria a la porción de la región amplificada del fragmento de ácido desoxirribonucleico ubicado entre los cebadores diseñados F1 y B1c y a la porción de la región amplificada del fragmento de ácido nucleico ubicado entre los cebadores diseñados F1c y B1. Durante la reacción de amplificación, puede usarse una polimerasa que tiene una actividad de desplazamiento de hebra y actividad exonucleasa 5' > 3', por ejemplo ADN polimerasa Bst, longitud completa.
En algunas realizaciones, durante la reacción de amplificación de ácido desoxirribonucleico, la sonda se une al fragmento complementario en el segmento de ADN amplificado, durante el alargamiento del amplicón, debido a las propiedades exonucleasas de la polimerasa, el oligonucleótido unido se degrada, lo que da como resultado la separación del extintor del punto cuántico. Como resultado de la separación del extintor del punto cuántico, se emite radiación electromagnética en el intervalo UV, IR o VIS después de la excitación del punto cuántico con la longitud de onda de radiación específica para el material a partir del cual se creó el punto cuántico. El elemento fotosensible registra la señal emitida.
El uso de puntos cuánticos provoca una reducción significativa en el umbral de detección debido a la posibilidad de usar una fuente de luz de excitación con una potencia más alta, gracias a lo cual es posible registrar la emisión de radiación electromagnética procedente de una cantidad mucho menor de puntos cuánticos liberados. Además, el uso de puntos cuánticos para marcar fragmentos de oligonucleótidos permite una mejor separación de la longitud de onda de excitación con respecto a la longitud de onda de la señal de emisión en la que se produce la detección de la radiación electromagnética. Lo que es más, los puntos cuánticos tienen una mayor durabilidad de blanqueo en comparación con fluorocromos tradicionales, lo que facilita la detección a lo largo de toda la reacción de amplificación.
Más preferiblemente, el cartucho de reacción comprende tres cámaras de reacción, incluyendo una cámara de prueba que incluye cebadores específicos para el material genético sometido a prueba, una cámara de control positivo que contiene cebadores específicos para una porción particular del material genético del que se deriva la muestra de material biológico y una cámara de control negativo, que contiene componentes de reacción sin cebadores.
En realizaciones preferidas, las cámaras de reacción en una vista desde arriba son círculos complementarios e interconectados en el medio con una válvula o un diafragma.
En otra realización preferida en la etapa c), la cámara de aislamiento se calienta hasta 95 °C desde 5 minutos hasta 10 minutos.
En aún otra realización preferida en la etapa e), las cámaras de reacción se calientan hasta 65 °C desde 15 minutos hasta 60 minutos.
Preferiblemente, la etapa b) se realiza por medio de una primera bomba, preferiblemente en forma de un tanque de agua cerrado con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión o pistón y fuelle.
De manera igualmente preferible, la etapa d) se realiza por medio de una segunda bomba, preferiblemente en forma de una cámara hueca cerrada con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión. Más preferiblemente, el método comprende adicionalmente una etapa de calentar un cartucho de reacción hasta temperaturas por encima de 100 °C, preferiblemente a través de varias unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura.
Además, se da a conocer un dispositivo para detectar material genético en una muestra biológica que comprende un cartucho de reacción y un dispositivo de medición, comprendiendo el dispositivo de medición una cámara de medición que tiene un receptáculo que aloja el cartucho de reacción, en el que el cartucho de reacción comprende una cámara de aislamiento para aislar material genético, que está conectada con cámaras de reacción a través de canales, para amplificar material genético aislado, caracterizado porque: dentro de al menos una de las cámaras de reacción están presentes reactivos secados por congelación para la amplificación de material genético junto con colorante luminiscente, que comprende colorante de fluorescencia o puntos cuánticos que se unen al material genético que va a detectarse, en el que simultáneamente con la etapa de amplificación de material genético se registra una detección de señal luminiscente a partir de marcadores luminiscentes; el dispositivo de medición comprende una pluralidad de unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura dispuestos sustancialmente opuestos a la cámara de aislamiento y/o cámaras de reacción de manera que los haces de luz emitidos por dicha pluralidad de LED iluminan dicha cámara de aislamiento y/o cámaras de reacción; y porque en la cámara de aislamiento está presente material capaz de unirse a los inhibidores de la reacción de amplificación.
En una realización preferida, el dispositivo comprende un sistema de muestreo desmontable, comprendiendo el sistema de muestreo desmontable un tapón y comprendiendo el cartucho de reacción un receptáculo equipado con dicho tapón y que proporciona una conexión de fluidos estable y hermética entre el sistema de muestreo y el cartucho de reacción.
En otra realización preferida, el dispositivo comprende adicionalmente un módulo de medición para el control y análisis de imágenes, un módulo de comunicación, un módulo de suministro de energía y módulo de visualización.
En otra realización preferida, las unidades de calentamiento emiten radiación electromagnética con una longitud de onda en el intervalo de 350 nm a 530 nm.
En otra realización preferida, la unidad de calentamiento de LED con detectores de temperatura comprende un detector de temperatura óptico que detecta radiación electromagnética en el intervalo de longitud de onda de 4 |im a 12 |im.
Preferiblemente, las cámaras de reacción en una vista desde arriba son círculos, complementarios e interconectados en el medio con una válvula o un diafragma.
De manera igualmente preferible, el sistema de muestreo comprende un tubo capilar, con el que se toma una muestra biológica, conectado con una primera bomba, preferiblemente en forma de un tanque de agua cerrado con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión o pistón y fuelle.
Más preferiblemente, reactivos liofilizados para la de amplificación de material genético de desoxinucleótidos, secuencias de cebadores específicos, tampón de reacción, iones de magnesio Mg2+, preferiblemente en forma de MgSO4, polimerasa capaz de llevar a cabo una reacción de amplificación, preferiblemente polimerasa Bst 3.0.
En realizaciones preferidas, el agente fluorescente liofilizado que se intercala con el material genético detectado es SYBR Green.
En aún otra realización preferida, el cartucho de reacción comprende tres cámaras de reacción, incluyendo una cámara de prueba que incluye cebadores específicos para el material genético sometido a prueba, una cámara de control positivo que contiene cebadores específicos para una porción particular del material genético del que se deriva la muestra de material biológico y una cámara de control negativo, que contiene componentes de reacción sin cebadores. En aún otra realización preferida, el cartucho de reacción comprende una segunda bomba, preferiblemente en forma de una cámara vacía cerrada con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión, que provoca el movimiento del material genético aislado desde la cámara de aislamiento hasta las cámaras de reacción.
Preferiblemente, el cartucho de reacción y/o el sistema de muestreo están hechos de un polímero hidrófobo y es un sistema completamente pasivo.
De manera igualmente preferible, la cámara de aislamiento y la cámara de reacción, así como la segunda bomba en el cartucho de reacción, comprenden las válvulas, preferiblemente ópticas en los canales de entrada y salida, respectivamente.
Más preferiblemente, en el canal que conecta la cámara de aislamiento con la segunda bomba, hay un detector de líquido, preferiblemente uno infrarrojo reflectante.
En realizaciones preferidas, están ubicados detectores de líquido, preferiblemente los infrarrojos reflectantes en canales de salida de las cámaras de reacción.
En otra realización preferida, la cámara de medición tiene una temperatura isotérmica controlada en el intervalo de desde 4 °C hasta 40 °C, realizado por medio de un sistema de calentamiento, preferiblemente en forma de un conjunto Peltier.
En otra realización preferida, el sistema de calentamiento comprende un ventilador y un radiador conectados, y está ubicada una rueda de mezclado de aire en la cámara de medición.
Preferiblemente, la cámara de medición está aislada con aislamiento térmico.
De manera igualmente preferible, el dispositivo comprende un mecanismo de posicionamiento del cartucho de reacción. Más preferiblemente, el dispositivo comprende un mecanismo de ajuste de presión que ejerce una presión sobre la bomba en el cartucho de reacción y un sensor de presión ajustado de manera opuesta.
En una realización preferida, el dispositivo comprende LED de UV adicionales que iluminan el área de detección. En otra realización preferida, el dispositivo comprende LED adicionales para hacer funcionar válvulas y detectores de líquido.
En otra realización preferida, en la parte inferior de la cámara de aislamiento y/o cámara de reacción, hay una capa de absorción que absorbe energía fotónica, preferiblemente hecha de Cu o Al recubierto con óxidos, preferiblemente, Al2O3 teñido de negro.
Un método de detección de material genético en una muestra biológica como se da a conocer en el presente documento permite evitar la necesidad de modificar la muestra de material biológico colocándola en los dispositivos, reduciendo la probabilidad de contaminación y también permite al usuario realizar la prueba solo por el usuario final. Además, no se requieren equipos de laboratorio adicionales ni condiciones de preparación de la reacción estériles para completar la prueba. Adicionalmente, la liofilización en el proceso de producción de los componentes de reacción proporciona un aumento significativo en la utilidad del cartucho de reacción (incluso más de un año desde la fecha de fabricación), y no es necesario almacenar el cartucho de reacción bajo refrigeración. Colocar los cebadores, específicos para el fragmento de ácido nucleico amplificado, dentro de la cámara de reacción reduce adicionalmente la susceptibilidad a la contaminación del procedimiento, y facilita además el estudio al usuario final. Además, la colocación del colorante en la cámara de reacción permite la detección inmediata del producto de reacción resultante sin que el usuario final tome medidas y simplifica significativamente todo el proceso de detección al reducir el número de etapas requeridas. El cartucho de reacción, así como el sistema de muestreo, se fabrican, como componentes completamente pasivos, a partir de un material polimérico, lo que permite que se desechen de manera segura, beneficiando al medio ambiente. Además, los LED para calentar la cámara de aislamiento y las cámaras de reacción usadas en el dispositivo de control reducen el consumo de energía de todo el proceso.
Se muestran realizaciones a modo de ejemplo en las figuras del dibujo, en las que las figuras 1, 6 muestran una representación esquemática del sistema de muestreo y el cartucho de reacción según una realización, las figuras 2, 7 muestran el cartucho de reacción según otra realización, la figura 3 muestra el cartucho de reacción según aún otra realización, la figura 4 muestra diversas realizaciones de las válvulas usadas en diferentes realizaciones del cartucho de reacción, mientras que la figura 5 muestra un diagrama de bloques del dispositivo de medición según una realización.
Ejemplo 1
Un dispositivo para detectar material genético en una muestra biológica según la realización de la presente divulgación se ilustró de manera parcialmente esquemática (sin un dispositivo de medición) en la figura 1 y su variedad en la figura 6. La muestra de material biológico (por ejemplo sangre capilar, sangre completa, saliva, fluido de cavidad corporal) tomada usando el sistema de muestreo 1 se introduce en un cartucho de reacción 6 hecho de un polímero hidrófilo recubierto con una capa anticoagulante, por ejemplo citrato de sodio, EDTA, por fuerzas capilares en un volumen que no excede 1 ml (en la realización mostrada en la figura 1 el volumen es de 10 |il). Después de llenar el tubo capilar 2, señalizado al usuario final por medio de una etiqueta en el extremo del canal (no mostrado), por ejemplo, observando el canal que se llena hasta la ventana de control o por medio de una señal luminosa y/o sonora, el material biológico se transporta por la presión del fluido que sale de la cámara que contiene agua destinada al diagnóstico molecular.
La mezcla de material biológico y agua pasa del tubo capilar 2 a la cámara de aislamiento 7 en su extremo. En la cámara de aislamiento 7, hay una resina de intercambio iónico inmovilizada Chelex 100 u otro material capaz de unirse a inhibidores de la reacción de amplificación de material genético. Después de que la mezcla haya pasado, el contenido de la cámara de aislamiento 7 se calienta hasta 70 °C o más durante más de 5 minutos. En este momento, hay una lisis térmica de las células y, en algunos casos, también de las nucleocápsides virales contenidas en el material biológico, liberando así el material genético de su interior. Dependiendo del tipo de patógeno, la temperatura puede aumentarse hasta 98 °C. Al final del proceso de calentamiento, la mezcla se enfría (pasiva o activamente, por ejemplo por una corriente de aire que fluye a través del ventilador) y se traslada a al menos una cámara de reacción 8.1 , 8.2 , 8.3, 8.4 a un volumen de al menos 0,1 |il (en la realización mostrada en las figuras 1 y 6, las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 tienen un volumen de 20 |il) en la que está ubicado un liofilizado, que contiene las cantidades apropiadas de sustancias necesarias para realizar una reacción de amplificación isotérmica específica y la detección del fragmento seleccionado de material genético amplificado durante la reacción. La liofilización en el proceso de producción de los componentes de reacción permite un aumento significativo en la utilidad del cartucho de reacción (incluso más de un año desde la fecha de fabricación), y no es necesario almacenar el cartucho de reacción bajo refrigeración. La cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 aloja también un colorante liofilizado que se intercala con el ADN. La colocación del colorante en la cámara de reacción permite la detección inmediata del producto de reacción resultante sin que el usuario final tome medidas. Dependiendo del colorante fluorescente utilizado, la longitud de la luz que provoca el colorante intercalante es diferente. Los colorantes usados para el marcaje proporcionan luz visible. El colorante fluorescente que se intercala con el ADN (por ejemplo, SYBR Green, EvaGreen, PikoGreen, bromuro de etidio, calceína, naranja de acridina, proflavina, acriflavina y otros) para detectar el producto de la reacción de amplificación.
Para la detección, la detección en tiempo real del producto de amplificación de ácido nucleico, así como los oligonucleótidos de la técnica de punto final con una molécula de punto cuántico unida en el extremo 5' y un extintor unido en el extremo 3'. La secuencia de los oligonucleótidos usados es complementaria a la porción de la región amplificada del fragmento de ácido desoxirribonucleico ubicado entre los cebadores diseñados F1 y B1c y para la porción de la región amplificada del fragmento de ácido nucleico ubicado entre los cebadores diseñados F1c y B1. Durante la reacción de amplificación, se usa una polimerasa que tiene una actividad de desplazamiento de hebra y actividad exonucleasa 5' > 3', por ejemplo ADN polimerasa Bst, longitud completa.
Durante la reacción de amplificación de ácido desoxirribonucleico, la sonda se une al fragmento complementario en el segmento de ADN amplificado, durante el alargamiento del amplicón, debido a las propiedades exonucleasas de la polimerasa, el oligonucleótido unido se degrada, lo que da como resultado la separación del extintor del punto cuántico. Como resultado de la separación del extintor del punto cuántico, se emite radiación electromagnética en el intervalo UV, IR o VIS después de la excitación del punto cuántico con la longitud de onda de radiación específica para el material a partir del cual se creó el punto cuántico. La señal emitida se registra por el elemento fotosensible.
El uso de puntos cuánticos provoca una reducción significativa en el umbral de detección debido a la posibilidad de usar una fuente de luz de excitación con una potencia más alta, gracias a lo cual es posible registrar la emisión de radiación electromagnética procedente de una cantidad mucho menor de puntos cuánticos liberados. Además, el uso de puntos cuánticos para marcar fragmentos de oligonucleótidos permite una mejor separación de la longitud de onda de excitación con respecto a la longitud de onda de la señal de emisión en la que se produce la detección de radiación electromagnética. Lo que es más, los puntos cuánticos tienen una mayor durabilidad de blanqueo en comparación con los fluorocromos tradicionales, lo que facilita la detección a lo largo de toda la reacción de amplificación.
Con el fin de amplificar el producto de reacción específico, pueden usarse las siguientes tecnologías de amplificación isotérmica: amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP); amplificación por desplazamiento de hebra (Strand displacement amplification, SDA); amplificación dependiente de helicasa (Helicase-dependant amplification, HDA); reacción de amplificación de enzima de mellado (Nicking enzyme amplification reaction, NEAR). El liofilizado contiene las cantidades experimentales de desoxinucleótidos (dNTP); secuencias de cebadores específicos, componentes del tampón de reacción, iones de magnesio Mg2+; polimerasa capaz de llevar a cabo una reacción de amplificación; en algunos casos, transcriptasa inversa y otros componentes necesarios para amplificar la secuencia seleccionada de material genético. Un conjunto de cebadores (al menos un par de cebadores) con una secuencia única específica para el genoma de un patógeno dado determina la especificidad de la reacción. El agua procedente de la cámara de aislamiento 7 junto con el material disuelto en la misma se carga en la cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4.
El proceso de amplificación de un fragmento de ácido nucleico seleccionado tiene lugar en la cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 a una temperatura constante de al menos 40 °C durante un mínimo de 5 minutos. Las secuencias de cebadores específicos se unen al ADN molde (aislado en la cámara de preaislamiento 7), derivado de los diversos patógenos presentes en el material biológico. Si el material biológico es ARN, el proceso de amplificación está precedido por transcripción inversa usando los denominados cebadores aleatorios, dando como resultado ADNc. Una vez que el cebador ha determinado la especificidad, la ADN polimerasa sintetiza la hebra complementaria. Durante el proceso de LAMP, se reciben aproximadamente 30 |ig/|il de ADN. Tal gran cantidad de ADN bicatenario se muestra por los colorantes que se intercalan con el material genético. Al añadir un colorante fluorescente al liofilizado, la combinación del colorante con el ADN se produce simultáneamente con su amplificación durante la reacción. Tras la finalización de la reacción, la mezcla de reacción se ilumina con una luz de una longitud de onda específica que excita el colorante que se intercala con el ADN sobre una base de fluorescencia. La detección del producto de reacción se logra registrando la longitud de onda emitida por el colorante y el complejo de ADN bicatenario específico para el colorante usado, usando la unidad fotoconductora. La construcción del cartucho de reacción 6 y el material del que estaba hecho (es decir, polímero transparente), permite la transmisión tanto de la luz que excita el complejo colorante-ADN como la luz emitida por este complejo. El resultado se interpreta basándose en la presencia de luz o su ausencia (resultado positivo - luz actual, negativo - sin luz).
Ejemplo 2
En la presente realización, el dispositivo para detectar el material genético en la muestra biológica comprende en general tres elementos principales, es decir, el dispositivo de medición (mostrado en forma de un diagrama de bloques en la figura 5), el cartucho de reacción 6 y el sistema de muestreo 1. La figura 1 muestra esquemáticamente una construcción de una realización no limitativa del cartucho de reacción 6 y el sistema de muestreo 1. El sistema de muestreo conectado 1 y la cámara de reacción 6 están dispuestos en el dispositivo de medición que está diseñado para dirigir y controlar todo el proceso de análisis de material genético. El dispositivo de medición adopta la forma de un dispositivo móvil pequeño, como un teléfono móvil, que contiene un receptáculo que aloja el cartucho de reacción 6.
El sistema de muestreo 1 comprende un tubo capilar de recogida de sangre 2 que está conectado a la cámara de agua, que es un tanque de agua cerrado con un diafragma conectado a la cámara de producción de presión. Tal sistema funciona como primera bomba 1 que produce presión empleando agua desde la cámara de agua a través de un tubo capilar 2 con un material biológico muestreado. El funcionamiento apropiado del sistema de muestreo 1 proporciona el orificio de ventilación 3, que forma la ramificación del tubo capilar 2 y las válvulas controladas conjuntamente Z1 y Z2. Durante el uso, el sistema de muestreo 1 está en contacto con material biológico líquido (por ejemplo sangre), donde el tubo capilar 2 se llena bajo la influencia de fuerzas capilares. Cuando se llena el tubo capilar 2 con material biológico, la válvula Z1 se abre y la válvula Z2 se cierra para garantizar el funcionamiento apropiado del sistema. Después de llenar el tubo capilar 2 con el material biológico, el sistema de muestreo 1 se coloca en el cartucho de reacción 6. Se proporciona una conexión estanca y estable de estos elementos mediante un tapón coincidente 4 en el sistema de muestreo 1 y un receptáculo 5 en el cartucho de reacción 6. La conexión de este tapón 4 al receptáculo 5 proporciona una conexión de fluido estable y sellada entre el sistema de muestreo 1 y el cartucho de reacción 6. Después de colocar el sistema de muestreo 1 en el cartucho de reacción 6, la válvula Z1 se cierra, la válvula Z2 se abre y la activación de la primera bomba P1 (es decir, tanque de agua cerrado con un diafragma conectado a la cámara de producción de presión). La activación de la primera bomba P1 se produce por compresión mecánica de la cámara. El método de activación de la primera bomba P1 no es limitante en este caso, y cualquier método conocido en la técnica anterior puede usarse para transportar el líquido, por ejemplo calentando con LED una sustancia con un alto coeficiente de expansión térmica. Esta operación retira el material biológico del tubo capilar 2 junto con el agua de la cámara de agua. La mezcla de agua y material biológico se transporta a través de un canal adecuado a la cámara de aislamiento 7. En la cámara de aislamiento 7, hay un material capaz de unirse a los inhibidores de la reacción de amplificación del material genético, y la cámara de aislamiento 7 tiene acceso a la cámara de agua. El material biológico recogido se proporciona en esta cámara de aislamiento 7. La capacidad de esta cámara de aislamiento es de aproximadamente 100 |il. Hay un canal de conexión con una cámara hueca cerrada con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión que forma una segunda bomba de generación de presión P2, que se extiende desde la cámara de aislamiento 7. La cámara de aislamiento 7 está conectada a la segunda bomba P2 por un detector de líquido de infrarrojo reflectante D1 y una válvula normalmente abierta Z3. La segunda bomba P2, a su vez, está conectada por una válvula normalmente abierta Z4 con un orificio de ventilación 9 ubicado en el extremo del cartucho de reacción 6, opuesto al receptáculo 5. Esta configuración de las válvulas Z3 y Z4 permite que la mezcla de material biológico y agua se introduzca a través de la cámara de aislamiento 7 adicionalmente hacia la segunda bomba P2. Cuando la mezcla de prueba alcanza el detector de líquido D1, la cámara de aislamiento 7 señala su llenado y las válvulas Z11 y Z3 se cierran. Entonces, el material biológico en la cámara de aislamiento 7 se calienta hasta una temperatura adecuada durante un período de tiempo especificado, lo que provoca la liberación del material genético encapsulado en la envoltura proteica/células.
Después de completar la etapa de aislamiento del material genético de la muestra recogida, se abren las válvulas Z3, Z5, Z6 y Z7 y se activa la segunda bomba P2. Las válvulas Z5, Z6 y Z7 están ubicados en canales separados que conectan la cámara de aislamiento 7 a las correspondientes cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Cada cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, a su vez, está conectada con un orificio de ventilación 9 correspondiente ubicado en el borde del cartucho de reacción 6, por medio de detectores de líquido D1, D2, D3, respectivamente, y válvulas normalmente abiertas Z8, Z9, Z10, respectivamente. La activación de la segunda bomba P2, junto con la configuración de las válvulas Z5, Z6, Z7 y Z8, Z9, Z l0, permite que el material genético aislado se traslade a las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Después de recibir la señal de los detectores de líquido D1, D2, D3, las válvulas Z8, Z9, Z10 se cierran. Entonces, las válvulas Z5, Z6 y Z7 se cierran a continuación. De esta manera, las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 se llenan con el material genético aislado. Las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 contienen reactivos liofilizados en su volumen, que contienen todos los componentes necesarios para la amplificación del material genético. La mezcla maestra en las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 comprende también un colorante fluorescente liofilizado que se intercala con el material genético. La capacidad de las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 está en el intervalo de 20 |il a 25 |il. En la presente realización, se proporcionan tres cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, incluyendo una cámara de prueba 8.1 que comprende cebadores específicos para el material genético sometido a prueba, una cámara de control positivo 8.2 que contiene cebadores específicos para una porción particular del material genético del que se deriva la muestra de material biológico y una cámara de control negativo 8.3 que no contiene cebadores, sino otros componentes de reacción. La cámara de control positivo 8.2 está diseñado para permitir el control de la polimerasa, las condiciones de temperatura y el aislamiento del material genético. La cámara de control negativo 8.3 permite controlar el proceso de liofilización (por ejemplo, esterilidad) y controlar el comportamiento de la válvula, lo que podría provocar el mezclado del contenido de estas cámaras de reacción. Por supuesto, el número de cámaras usadas no es una limitación de la presente divulgación y el experto en la técnica, por ejemplo, usará un aumento simultáneo en el número de cámaras 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 para el análisis simultáneo de diferentes patógenos.
Para amplificar el material genético, las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 se calientan entonces hasta las temperaturas apropiadas, lo que amplifica el material genético. Simultáneamente con la amplificación (o posteriormente), la señal de fluorescencia detectada a partir de la etiqueta fluorescente usada se une al material genético amplificado. El aumento del producto es igual al aumento en la intensidad de luz generado por la etiqueta fluorescente usada.
Después de todo el proceso y la lectura del resultado por el sistema óptico con la cámara 28, las regiones que contienen el material biológico se calientan con LED de UV 29 que emiten radiación a longitudes de onda que oscilan desde 350 nm hasta 450 nm (o láser) hasta 150 °C durante de 2 a 3 segundos para neutralizar el riesgo biológico. A menor potencia UV, estos LED de UV 29 sirven simultáneamente para excitar la fluorescencia (iluminan el cartucho de reacción 6). La exposición a UV da como resultado la destrucción del material biológico y la despolimerización del material de la cámara de reacción 6, lo que reduce el riesgo biológico y desintegra el polímero, protegiendo favorablemente el medio ambiente y garantizando una eliminación apropiada.
A lo largo del proceso de análisis de material biológico, se lleva a cabo el tratamiento térmico del material biológico líquido en la cámara de aislamiento 7 y en las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. La energía requerida para calentar la cámara de aislamiento 7 y las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 se comunica sin contacto. La fuente de energía son los diodos emisores de luz LED, que emiten radiación luminosa a partir del intervalo UV-VIS. Por ejemplo, las longitudes de onda emitidas por los l Ed pueden seleccionarse de desde 350 nm hasta a 500 nm. Los diodos emisores de luz están ubicados dentro del dispositivo de medición y están dispuestos para iluminar el área de la cámara de aislamiento 7 y las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Mediante el uso de un material transparente para la construcción del cartucho de reacción 6, que se caracteriza por una alta transmisión de luz, es posible usar un método de calentamiento eficiente energéticamente para las cámaras respectivas. La temperatura de la cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 y la cámara de aislamiento 7 se controla sin contacto mediante un pirómetro con un bloque de procesamiento digital. Todo el sistema está controlado por un controlador de microprocesador con software incorporado. Además, se usa el LED de UV de baja potencia en el dispositivo de medición para iluminar el interior del reactor, lo que es necesario para la grabación de imágenes por el CCD. La detección del producto de reacción bioquímica se basa en la determinación de los niveles cuantizados de señales a partir de los canales RGB del detector CCD. El diseño del dispositivo permite el registro continuo de señales de color. El uso del diodo de iluminación permite la grabación continua de la imagen por el detector, ya que no es necesario iluminar constantemente la muestra con una fuente de luz externa.
La construcción del dispositivo de medición según una realización de la presente divulgación se muestra en forma de diagrama de bloques en la figura 5. En general, se distingue en el dispositivo de medición una cámara de medición 10 que está construida de modo que aloja un cartucho de reacción 6. Con el fin de posicionar apropiadamente el cartucho de reacción 6 en la cámara de medición 10 , se proporciona un mecanismo de posicionamiento 11 del cartucho de reacción 6. La cámara de medición 10 es una estructura cerrada que está cubierta por un aislamiento térmico exterior 12, lo que facilita mantener la temperatura ajustada en el interior. Mantener la temperatura controlada isotérmicamente dentro de la cámara de medición 10 (por ejemplo en el intervalo de 4 °C a 40 °C) garantiza el sistema de calentamiento 13 (por ejemplo en forma de un conjunto Peltier). Con el fin de distribuir apropiadamente el aire calentado dentro de la cámara de medición 11, se usan un ventilador 14 y una rueda de mezclado de aire 22. La eficiencia del sistema de calentamiento 13 está garantizada también por el radiador 15 ubicado fuera de la cámara de medición 10. El dispositivo de medición también contiene bloques adicionales necesarios para el funcionamiento adecuado del dispositivo, tal como el módulo de control y análisis de imagen 16, el módulo de comunicación 17, el módulo de suministro de energía 18 y la pantalla 19. La funcionalidad de los bloques mencionados anteriormente y su construcción las conocen bien los expertos en la técnica, por lo que su descripción exacta se omite para simplificar la discusión. La cámara de medición 20 del dispositivo de medición proporciona también el mecanismo de ajuste de presión 10 con el fin de activar la bomba P1 en el cartucho de reacción 6. Un sensor de presión 21 está ubicado opuesto para controlar la presión ajustada en la bomba P1. Con el fin de garantizar una temperatura correcta en la cámara de aislamiento 7 y las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, se proporcionan varias unidades de calentamiento 23 en la cámara de medición 10 que están posicionadas en relación con el cartucho de reacción 6 de manera que las corrientes de luz emitidas iluminan la cámara de aislamiento 7 y las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, respectivamente. Más específicamente, cada unidad de calentamiento 23 consiste en LED con radiadores 24, un detector de temperatura 25 y un estabilizador de detector de temperatura 26. El calentamiento de la cámara de aislamiento 7 y la cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 se realiza con LED con una corriente de energía fotónica ajustable de manera continua que oscila desde 400 nm hasta 500 nm, lo que se prefiere debido al alto rendimiento de emisión de fotones y se traduce en una alta potencia que alcanza la capa de absorción en la parte inferior de la cámara de aislamiento 7 y las cámaras de reactor 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Con el fin de compensar la temperatura en la parte inferior de la cámara 7, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 y la absorción de energía, para evitar la degradación del material biológico liofilizado en las cámaras 8.1, 8.2, 8.3, 8.4., se usó la capa de absorción que absorbe completamente la energía fotónica. La capa está hecha de materiales, por ejemplo, Cu o Al recubierto con óxidos (en el presente ejemplo AhO3, teñido de negro) y otros materiales con buenas propiedades de absorción y buena conductividad térmica (incluyendo polímeros modificados, por ejemplo carbono o grafeno).
El aumento de temperatura a lo largo del tiempo en las cámaras 7, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 se logra aumentando la potencia de la corriente de luz y disminuyendo a través de la cámara de medición isotérmica 10 a una temperatura de desde 4 °C hasta 40 °C. Con la resistencia térmica constante de la cámara de aislamiento 7 o la cámara de reactor 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 con los alrededores, la velocidad de la disminución de la temperatura puede controlarse cambiando la temperatura ambiental del cartucho de reacción 6. Dependiendo de la velocidad de disminución de la temperatura deseada, se ajusta la temperatura dentro del dispositivo (es decir, en la cámara de medición 10) y se aplica una potencia adecuada a la capa de absorción de las cámaras 7, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. De esta manera, puede obtenerse cualquier perfil de temperatura en el intervalo de desde 25 °C hasta 100 °C con altas velocidades de aumento y disminución. La capa de absorción de las cámaras tiene una alta conductividad térmica que elimina la posible heterogeneidad de la corriente de luz de los LED y garantiza que no haya gradientes de temperatura en el área de las cámaras de trabajo.
Debido a que la medición de temperatura se realiza mediante un detector de temperatura tal como un pirómetro con un filtro permeable a la radiación incorporado en el intervalo de 8 |im a 12 |im, es posible medir simultáneamente la temperatura y suministrar energía a las cámaras de aislamiento 7 y las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. En este caso, no hay períodos de falta de control con respecto al control de temperatura en las cámaras de aislamiento 7 y las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Además, no hay picos de temperatura asociados con el funcionamiento del controlador PID, y no hay necesidad de control de potencia por medio de modulación de ancho de pulso PWM, lo que tiene la ventaja de producir menos ruido térmico.
Además, se proporciona una serie de LED 27, dispuestos de manera análoga de modo que el haz de luz generado ilumina el dispositivo, para hacer funcionar las válvulas Z1-Z11 y los detectores de líquido D1-D4. El sistema óptico con la cámara 28 que puede tener la forma de un detector CCD y está destinado a detectar la señal luminosa resultante de los colorantes fluorescentes resultantes de la reacción en la cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Con el fin de permitir esto, también se proporcionan LED de UV 29, que iluminan el área de detección.
Ejemplo 2
La figura 2 muestra esquemáticamente otra realización del cartucho de reacción 6 usado en el dispositivo para detectar material genético en una muestra biológica según una realización de la presente divulgación.
El diseño general y el principio de funcionamiento del cartucho de reacción 6 mostrado en la presente realización son consecuentes con la construcción y el principio de funcionamiento del cartucho de reacción 6 del ejemplo 1. La diferencia fundamental entre los cartuchos de reacción 6 comparativos es que, en el cartucho de reacción 6 del ejemplo 2 , se usa el sistema de muestreo integral 1 (no es un dispositivo separado como en la primera realización).
El cartucho de reacción 6 es, por lo tanto, una estructura compacta, desprovista de elementos desmontables. En este caso, el material biológico recogido se introduce en el sistema de muestreo 1, que forma una parte integral del cartucho de reacción 6. También en este ejemplo, puede distinguirse el tubo capilar 2, que por medio de las fuerzas capilares absorbe el material biológico. En el otro extremo del tubo capilar 2 se proporciona una ventana de control 30 que señala el llenado del tubo capilar 2 con el material biológico. En la presente realización, la primera bomba P1 está hecha por medio de elementos mecánicos tales como pistón y fuelle. En esta realización, debe enfatizarse que el agua para la cámara de reacción 6 se proporciona en forma de cápsulas, lo que permite una esterilización fácil y la posibilidad de separar el proceso húmedo en la producción de las cámaras de reacción 6. La liberación de agua tiene lugar justo antes de la prueba y se realiza mediante la inyección de aguja 31 cuando la bomba P1 comienza a funcionar. El transporte del material biológico y los productos desde la cámara de aislamiento 7 hasta las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 se proporciona por la bomba P1 extruyendo agua de la cápsula. Esto simplifica el control del proceso en el dispositivo. Se proporciona la presión adecuada durante el calentamiento por el sensor de presión 21 en el dispositivo de medición y el control correspondiente de las válvulas Z5, Z8, Z9, Z10. En esta realización, la construcción de las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 también merece mención. Cada una de las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 en una vista desde arriba son círculos complementarios. Las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 se complementan entre sí formando una región circular que comprende todas las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, conectadas en el medio por medio de una válvula o diafragma 33. En esta realización, pueden usarse varios diseños de válvula 33 que no afecten a la globalidad de la realización. Válvulas a modo de ejemplo 33, utilizables en los cartuchos de reacción 6, se muestran en las figuras 4 A-D, válvula circular hidrófoba, válvula redonda hidrófoba -mecánica, válvula elíptica hidrófoba - mecánica, válvula rectangular hidrófoba - mecánica, respectivamente. Las válvulas mecánicas presentadas actúan sobre la deformación del material flexible del que estaba hecha la válvula. Se requiere una fuerza específica, que al mismo tiempo define la presión, que al excederse provoca el flujo de líquido en una dirección dada. La forma de la válvula es tal que, en la segunda dirección, se bloquea la deformación elástica, bloqueando así el flujo de líquido para esa dirección. Las válvulas hidrófobas funcionan según el principio de que el líquido debe superar las fuerzas de tensión superficial en contacto con el material de válvula hidrófobo (mientras el aire fluye libremente). Esto permite bloquear el flujo del líquido en el canal hasta una presión predeterminada dependiendo del diámetro de la abertura en la válvula y la hidrofobicidad del material del que está hecha la válvula. En el caso de llenado simultáneo de los tres canales con el líquido, después de colocar las válvulas hidrófobas en los extremos de los canales, se llenarán automáticamente. El aire fluirá sin obstrucciones, y el líquido se detendrá sucesivamente en estas válvulas, porque se requerirá más presión para que el líquido fluya a través de las válvulas. La combinación de estos dos tipos de válvulas facilita el control del flujo de líquido en el cartucho de reacción 6.
Además, en la presente realización, no se usa una bomba adicional P2 y se redujo sustancialmente el número de válvulas usadas (en comparación con el cartucho de reacción 6 de la primera realización). Además, debido a la construcción de las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, los canales de salida se dirigen hacia los tres bordes diferentes del cartucho de reacción 6 y se proporcionan cámaras de compensación 33 antes del orificio de ventilación 9 para evitar que el líquido salga del cartucho de reacción 6 hacia el dispositivo de medición.
Los otros componentes y el principio de funcionamiento del cartucho de reacción 6 coinciden con los dados a conocer en la primera realización del cartucho de reacción 6.
Ejemplo 3
El cartucho de reacción 6 que se muestra en la figura 3, que es aún otra realización más de la presente divulgación, difiere del cartucho de reacción 6 mostrado en la figura 2 solo en que en cada cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 se usan dos válvulas 33 en la entrada y salida de la cámara de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 y un canal de conexión 34 que está destinado a proporcionar un flujo de líquido estable y controlado en una dirección con variaciones de presión provocadas por el calentamiento de las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. En la solución presentada en la presente realización, en contraposición con la solución presentada en la segunda realización, no hay válvulas Z8 y Z10, lo que simplifica en gran medida el diseño del cartucho de reacción 6 y su funcionamiento. El canal de conexión 34 sirve para ventilar las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Debido al hecho de que las válvulas evitan la retracción del líquido, no hay un mezclado incontrolado del líquido en las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4. Colocar dos válvulas en las cámaras de reacción 8.1, 8.2 , 8.3, 8.4 permite el uso de una sola válvula normalmente abierta en la salida para garantizar el funcionamiento adecuado del sistema.
Ejemplo 4
Detección de VIH en la sangre usando el método de una realización de la presente divulgación y el dispositivo de una realización de la presente divulgación.
Para analizar la presencia del virus VIH en una muestra tomada de un paciente, un método y dispositivo para la detección de material genético en una muestra biológica según una realización de la presente divulgación, descritos en detalle en los ejemplos 1 y 2. En la cámara de aislamiento 7 se usa Chelex 100. El aislamiento de ADN implica la degradación térmica de la membrana celular o la envoltura proteica vírica y la liberación de material genético que está encapsulado en las envoltura proteica/células víricas. Chelex 100 es necesario para atrapar inhibidores que pueden bloquear la polimerasa y producir resultados negativos falsos. Se prepara Chelex 100 como una mezcla al 5 % en agua desionizada, libre de nucleasa, también puede inmovilizarse en la parte inferior de la cámara de aislamiento en forma de una capa porosa. Para realizar el aislamiento en la cámara de aislamiento, la sangre se calienta a 95 °C durante 5-10 min.
En las cámaras de reacción hay reactivos liofilizados, incluyendo tampón, dNTP, MgSO4, mezcla de cebadores, polimerasa Bst 3.0, SYBR Green. La amplificación del material genético se lleva a cabo en las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 calentando a 65 °C durante 30 min. Hay cebadores de VIH específicos en la cámara de prueba 8.1. En la cámara de control positivo endógeno 8.2 hay cebadores específicos para el gen humano. En la cámara de control negativo 8.3 no hay cebadores añadidos, pero contiene los otros componentes de la reacción. La reacción y detección por LAMP tiene lugar en las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 y consiste en amplificar material genético de un patógeno dado (y material genético humano para el control endógeno) usando la enzima polimerasa Bst 3.0. Los cebadores específicos añadidos a la reacción se unen a fragmentos seleccionados del genoma sometido a prueba y determinan el fragmento amplificado en la reacción. Al final de la reacción, se forman aproximadamente 10-50 |ig/|il del fragmento de ADN amplificado. Se combina SYBR Green presente en la mezcla de reacción con el producto de reacción y, cuando se combina con ADN bicatenario, se vuelve fluorescente (se ilumina cuando la luz es de longitud suficiente). El aumento del producto es igual al aumento de la luz del colorante. Al final de la reacción, cuando el resultado es positivo y el fragmento sometido a prueba se amplifica, es visible luz, cuando el resultado es negativo, no hay luz. Se añaden otros componentes de reacción (tampón, MgSO4, dNTP) para proporcionar condiciones de trabajo adecuadas para la polimerasa Bst 3.0.
En el proceso de aislamiento del material de ADN/ARN en la cámara de reacción, el patógeno se neutraliza. El único peligro puede ser el residuo del material genético en el tubo capilar 2 o canales en el cartucho de reacción 6. Por lo tanto, después de la detección, el residuo del material genético se recicla, lo que se realiza exponiendo el cartucho de reacción 6 (en particular, la cámara de aislamiento 7 y las cámaras de reacción 8.1, 8.2, 8.3, 8.4) a radiación UV para calentar los componentes individuales hasta una temperatura por encima de 100 °C y se elimina de ese modo el material genético. Esto permite eliminar de manera segura el cartucho de reacción 6 usado sin tener que llevar a cabo procedimientos de eliminación complicados.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método de detección de material genético en una muestra biológica que incluye las siguientes etapas:
    a) la muestra biológica se carga en un cartucho de reacción (6) y después o antes de que el cartucho de reacción (6) se coloque en un dispositivo de medición, comprendiendo el dispositivo de medición una cámara de medición (10) que tiene un receptáculo que aloja el cartucho de reacción (6), en el que el cartucho de reacción (6) comprende una cámara de aislamiento (7) para aislar material genético, que está conectada con cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) a través de canales, para amplificar material genético aislado,
    b) la muestra biológica recogida se lleva a la cámara de aislamiento (7),
    c) se aísla material biológico de la muestra sometida a prueba calentando la cámara de aislamiento (7),
    d) el material genético aislado se traslada a una pluralidad de cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), y
    e) el material genético se amplifica calentando las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), caracterizado porque:
    dentro de al menos una de las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) están presentes reactivos secados por congelación para la amplificación de material genético junto con colorante luminiscente, que comprende colorante de fluorescencia o puntos cuánticos que se unen al material genético que va a detectarse, en el que simultáneamente con la etapa de amplificación de material genético se registra una detección de señal luminiscente a partir de marcadores luminiscentes,
    el dispositivo de medición comprende una pluralidad de unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura (23) dispuestos sustancialmente opuestos a la cámara de aislamiento (7) y/o cámaras de reacción (8.1,8.2, 8.3) de manera que los haces de luz emitidos por dicha pluralidad de LED iluminan dicha cámara de aislamiento (7) y/o cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), y el calentamiento de la cámara de aislamiento (7) y/o la cámara de reacción (8.1, 8.2, 8.3) se realiza a través de la pluralidad de unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura (23), y
    en la cámara de aislamiento (7) está presente material capaz de unirse a los inhibidores de reacción de amplificación.
  2. 2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado porque se toma una muestra biológica de un sistema de muestreo (1 ) y se realiza la etapa a) cargando el sistema de muestreo (1 ) en el cartucho de reacción (6), en el que el calentamiento de la cámara de aislamiento (7) y/o la cámara de reacción (8.1, 8.2, 8.3) comprende emitir radiación electromagnética con una longitud de onda en el intervalo de 350 nm a 530 nm, y la unidad de calentamiento de LED con detectores de temperatura (23) comprende un detector de temperatura óptico (25) que detecta radiación electromagnética en el intervalo de longitud de onda de 4 |im a 12 |im, y en el que en la parte inferior de la cámara de aislamiento (7) y/o la cámara de reacción (8.1, 8.2, 8.3) hay una capa de absorción que absorbe energía fotónica.
  3. 3. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque se toma una muestra biológica usando fuerzas capilares para el tubo capilar (2 ) en el sistema de muestreo (1 ) y reactivos liofilizados para la amplificación de material genético de desoxinucleótidos, secuencias de cebadores específicos, tampón de reacción, iones de magnesio Mg2+, preferiblemente en forma de MgSO4, polimerasa capaz de llevar a cabo una reacción de amplificación, preferiblemente polimerasa Bst 3.0 en el que la etiqueta fluorescente liofilizada que se intercala con el material genético detectado es SYBR Green.
  4. 4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el cartucho de reacción (6) comprende tres cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), incluyendo una cámara de prueba (8.1) que incluye cebadores específicos para el material genético sometido a prueba, una cámara de control positivo (8.2 ) que contiene cebadores específicos para una porción particular del material genético del que se deriva la muestra de material biológico y una cámara de control negativo (8.3), que contiene componentes de reacción sin cebadores.
  5. 5. Un método según la reivindicación 4, caracterizado porque las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) en una vista desde arriba son círculos, complementarios e interconectados en el medio con una válvula o un diafragma (33).
  6. 6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque en la etapa c) la cámara de aislamiento se calienta hasta 95 °C desde 5 minutos hasta 10 minutos en el que, en la etapa e), las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) se calientan hasta 65 °C desde 15 minutos hasta 60 minutos y la etapa b) se realiza por medio de una primera bomba (P1), preferiblemente en forma de un tanque de agua cerrado con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión o pistón y fuelle y la etapa d) se realiza por medio de una segunda bomba (P2), preferiblemente en forma de una cámara hueca cerrada con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión y comprende una etapa de calentamiento de un cartucho de reacción (6) hasta temperaturas por encima de 100 °C, preferiblemente a través de varias unidades de calentamiento en LED con detectores de temperatura (23).
  7. 7. Un dispositivo para detectar material genético en una muestra biológica que comprende un cartucho de reacción (6) y un dispositivo de medición, comprendiendo el dispositivo de medición una cámara de medición (10) que tiene un receptáculo que aloja el cartucho de reacción (6), en el que el cartucho de reacción (6) comprende una cámara de aislamiento (7) para aislar material genético, que está conectada con cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) a través de canales, para amplificar material genético aislado, caracterizado porque:
    dentro de al menos una de las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) están presentes reactivos secados por congelación para la amplificación de material genético junto con colorante luminiscente, que comprende colorante de fluorescencia o puntos cuánticos que se unen al material genético que va a detectarse, mientras que simultáneamente con la etapa de amplificación de material genético se registra una detección de señal luminiscente a partir de marcadores luminiscentes,
    el dispositivo de medición comprende una pluralidad de unidades de calentamiento de LED con detectores de temperatura (23) dispuestos sustancialmente opuestos a la cámara de aislamiento (7) y/o cámaras de reacción (8.1,8.2, 8.3) de manera que los haces de luz emitidos por dicha pluralidad de LED iluminan dicha cámara de aislamiento (7) y/o cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), y
    en la cámara de aislamiento (7) está presente material capaz de unirse a los inhibidores de la reacción de amplificación.
  8. 8. Un dispositivo según la reivindicación 7, caracterizado porque el dispositivo comprende un sistema de muestreo desmontable (1), comprendiendo el sistema de muestreo desmontable (1) un tapón (4) y comprendiendo el cartucho de reacción (6) un receptáculo (5) equipado con dicho tapón (4) y que proporciona una conexión de fluidos estable y estanca entre el sistema de muestreo (1 ) y el cartucho de reacción (6) y un módulo de medición para el control y análisis de imagen (16), módulo de comunicación (17), módulo de suministro de energía (18) y módulo de visualización (19).
  9. 9. Un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque las unidades de calentamiento emiten radiación electromagnética con una longitud de onda en el intervalo de 350 nm a 530 nm, en el que la unidad de calentamiento de LED con detectores de temperatura comprende un detector de temperatura óptico que detecta radiación electromagnética en el intervalo de longitud de onda de 4 |im a 12 |im, en el que en la parte inferior de la cámara de aislamiento (7) y/o la cámara de reacción (8.1, 8.2, 8.3) hay una capa de absorción que absorbe energía fotónica, y las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) en una vista desde arriba son círculos, complementarios e interconectados en el medio con una válvula o un diafragma.
  10. 10. Un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque el sistema de muestreo (1 ) comprende un tubo capilar (2 ) con el que se toma una muestra biológica, conectado con una bomba (P1) preferiblemente en forma de un tanque de agua cerrado con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión o pistón y fuelle y reactivos liofilizados para la amplificación de material genético de desoxinucleótidos, secuencias de cebadores específicos, tampón de reacción, iones de magnesio Mg2+, preferiblemente en forma de MgSO4, polimerasa capaz de llevar a cabo una reacción de amplificación, preferiblemente polimerasa Bst 3.0, en el que la etiqueta fluorescente liofilizada que se intercala con el material genético detectado es SYBR Green.
  11. 11. Un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque el cartucho de reacción (6) comprende tres cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3), incluyendo una cámara de prueba (8.1) que incluye cebadores específicos para el material genético sometido a prueba, una cámara de control positivo (8.2 ) que contiene cebadores específicos para una porción particular del material genético del que se deriva la muestra de material biológico y una cámara de control negativo (8.3), que contiene componentes de reacción sin cebadores, en el que el cartucho de reacción (6) comprende una bomba (P2), preferiblemente en forma de una cámara vacía cerrada con un diafragma conectado a una cámara de producción de presión, conectada a la cámara de aislamiento (7) y que produce presión que provoca el movimiento del material genético aislado desde la cámara de aislamiento (7) hasta las cámaras de reacción (8.1 , 8.2 , 8.3).
  12. 12. Un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizado porque el cartucho de reacción (6) y/o el sistema de muestreo (1 ) están hechos de un polímero hidrófobo y es un sistema completamente pasivo, en el que la cámara de aislamiento (7) y las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) así como la bomba (P2) en el cartucho de reacción (6) comprenden válvulas (Z11), (Z5, Z6, Z7), (Z8, Z9, Z10), (Z3), (Z4), preferiblemente ópticas en los canales de entrada y salida, respectivamente.
    Un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado porque en el canal que conecta la cámara de aislamiento (7) con la segunda bomba (P2) hay un detector de líquido (D1), preferiblemente uno infrarrojo reflectante, en el que los detectores de líquido (D2, D3, D4), preferiblemente infrarrojos reflectantes, están ubicados en canales de salida de las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3) y la cámara de medición (10) tiene una temperatura isotérmica controlada en el intervalo de desde 4 °C hasta 40 °C, realizado a través de un sistema de calentamiento (13), preferiblemente en forma de un conjunto Peltier y el sistema de calentamiento (13) comprende un ventilador (14) y un radiador (15) conectados, y una rueda de mezclado de aire (22 ) está ubicada en la cámara de medición (10).
    Un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque la cámara de medición (10) está aislada con aislamiento térmico (12 ) y un mecanismo de posicionamiento (11 ) del cartucho de reacción (6) y un mecanismo de ajuste de presión (20) que ejerce una presión sobre la bomba (P1) en el cartucho de reacción (6) y un sensor de presión ajustado de manera opuesta (21) y LED de UV adicionales (29) que iluminan el área de detección.
    Un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, caracterizado porque el dispositivo comprende LED adicionales (27) para hacer funcionar detectores de líquido (D1-D4) y válvulas (Z1-Z11) y en la parte inferior de la cámara de aislamiento (7) y/o la cámara de reacción (8.1, 8.2, 8.3) hay una capa de absorción que absorbe energía fotónica, preferiblemente hecha de Cu o Al recubierto con óxidos, preferiblemente, AhO3 teñido de negro.
    Un dispositivo según la reivindicación 11, caracterizado porque la cámara de aislamiento (7) está conectada con una cámara (8.4), que está conectada además a través de válvulas (Z5-Z7) con las cámaras de reacción (8.1, 8.2, 8.3).
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