CN110079513A - 一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用 - Google Patents

一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110079513A
CN110079513A CN201810073315.7A CN201810073315A CN110079513A CN 110079513 A CN110079513 A CN 110079513A CN 201810073315 A CN201810073315 A CN 201810073315A CN 110079513 A CN110079513 A CN 110079513A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cellotetrose
mutation
fiber element
element enzyme
recombinant fiber
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810073315.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110079513B (zh
Inventor
李福利
张坤迪
王禄山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Original Assignee
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS filed Critical Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority to CN201810073315.7A priority Critical patent/CN110079513B/zh
Publication of CN110079513A publication Critical patent/CN110079513A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110079513B publication Critical patent/CN110079513B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于酶工程领域，具体的说是一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用。持续性内切纤维素酶CcCel9A调控主产纤维四糖突变的靶位点为H123，H372，R374和Y415中的一种或几种。本发明所示内切纤维素酶可以在大肠杆菌中快速表达，且酶活高，稳定性强，可以与其它酶复配进行纤维素水解。本发明利用纤维素底物产生的纤维四糖浓度大，纯度高，可作为标准品用于科学研究。

Description

一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体的说是一种主产物为纤维四糖的重组 纤维素酶及其构建方法和应用。
背景技术
纤维四糖(cellotetrose),化学结构式为 (β-D-Glc-[1→4])3-D-Glc，由4个葡萄糖单元以β-1,4糖苷键连接构 成，主要用于标准品。由于木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质 资源，因此纤维素酶的研究多年来热度不减。纤维寡糖在纤维素酶的研 究中通常是必须的，尤其是在研究酶的最小底物及产物谱的过程中。另 外，纤维四糖能促进人和动物肠道内双歧杆菌的增殖，利于肠道蠕动， 但不会被肠道吸收。纤维四糖的甜度约为蔗糖的30％～40％，因此可以作为 甜味添加剂代替蔗糖用于糖尿病患者的食品。然而，目前纤维四糖的生 产使用化学合成方法，纯化流程复杂，使得其生产成本非常昂贵。进而 现急需一种纯度较高，节约成本且绿色环保的用于产纤维四糖的生物酶 解法。
发明内容
本发明目的是通过酶工程方式改造获得一种主产物为纤维四糖的重 组纤维素酶及其构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种调控主产纤维四糖突变的靶位点，持续性内切纤维素酶CcCel9A 调控主产纤维四糖突变的靶位点为H123，H372，R374和Y415中的一种 或几种。
一种利用所述的调控突变的靶位点主产物为纤维四糖的重组纤维素 酶，重组纤维素酶为产纤维四糖的持续性内切纤维素酶CcCel9A中在 H123A、R374A或H372A/Y415A位点突变所得突变体。
所述产纤维四糖的持续性内切纤维素酶CcCel9A为Clostridium cellulosi CS-4-4菌株(Zhang，K.；Chen，X.；Schwarz，W.H.；Li，F.，Synergism of glycoside hydrolasesecretomes from two thermophilic bacteria cocultivated on lignocellulose.ApplEnviron Microbiol 2014，80(8)，2592-601.)中的持续性内切纤维素酶CcCel9A；其基因序列如SEQ ID NO：1中所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2中所示。
一种构建权利所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的引物：
所述获得H372A/Y415A突变的引物为：
Y415AF1(5’-3’)GATGATTCATGCGCCAACGCTACCCAGACAC，
Y415AR1(5’-3’)GCGTTGGCGCATGAATCATCATAGCTGTG；
H372AF1(5’-3’)TATCCGAAGAATCCTGCTCACAGGACAG，
H372AR1(5’-3’)GCAGGATTCTTCGGATAATTGGTACCG；
所述获得H123A突变的引物为：
H123AF1(5’-3’)GACGGCAGCCTTGACGCCGCATGGTGGGGGCCTG，
H123AR1(5’-3’)CAGGCCCCCACCATGCGGCGTCAAGGCTGCCGTC；
所述获得R374A突变的引物为：
R374AF1(5’-3’)GAAGAATCCTCATCACGCGACAGCTGAAAG，
R374AR1(5’-3’)GCGTGATGAGGATTCTTCGGATAATTGG。
一种所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的构建方法，根据 CcCel9A活性中心的特点，确定突变的亚位点，通过PCR的引物设计引入 突变，转化大肠杆菌构建点突变基因的表达载体，然后通过诱导表达得 到突变体蛋白。
所述突变的亚位点的确定为将CcCel9A的活性中心中对与各个亚位 点相互作用力大的氨基酸位点即作为突变的靶位点。
所述持续性内切纤维素酶CcCel9A调控主产纤维四糖突变的靶位点 为H123，H372，R374和Y415中的一种或几种。
所述获得H372A/Y415A突变的引物为：
Y415AF1(5’-3’)GATGATTCATGCGCCAACGCTACCCAGACAC，
Y415AR1(5’-3’)GCGTTGGCGCATGAATCATCATAGCTGTG；
H372AF1(5’-3’)TATCCGAAGAATCCTGCTCACAGGACAG，
H372AR1(5’-3’)GCAGGATTCTTCGGATAATTGGTACCG；
所述获得H123A突变的引物为：
H123AF1(5’-3’)GACGGCAGCCTTGACGCCGCATGGTGGGGGCCTG，
H123AR1(5’-3’)CAGGCCCCCACCATGCGGCGTCAAGGCTGCCGTC；
所述获得R374A突变的引物为：
R374AF1(5’-3’)GAAGAATCCTCATCACGCGACAGCTGAAAG，
R374AR1(5’-3’)GCGTGATGAGGATTCTTCGGATAATTGG。
一种所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的应用，所述重组纤 维素酶在调控底物主产纤维四糖中的应用。
所述底物为含纤维素的物质；例如底物可以是滤纸、无定型纤维素、 微晶纤维素、预处理过的木质纤维素(如气爆秸秆、双螺杆挤压秸秆等)、 未预处理过的木质纤维素等。
产糖反应最优条件：温度60℃，pH 6.5，酶量1μM以上，进而使纤 维四糖不再继续水解而得到积累。
本发明的有益效果与特点在于：
1.本发明直接以纤维素为原料通过酶解法生产纤维四糖，不需要以 化学方法从头合成；本发明所得内切纤维素酶可以在大肠杆菌中快速表 达，且酶活高，稳定性强，可以与其它酶复配进行纤维素水解。
2.本发明构建获得酶不像普通的内切纤维素酶，随机产生各种长度 的纤维寡糖，该纤维素酶特异性地产生并积累纤维四糖，无需高成本的 纯化步骤，其利用纤维素底物产生的纤维四糖浓度大，纯度高，可作为 标准品用于科学研究。
3.通过本发明提供的方法，以5g/L无定型纤维素为原料，H123A、 R374A和H372A/Y415A酶解24h后分别获得纤维四糖0.9、1.2和1.5g/L， 转化率分别为18％、24％和30％(w/w)，且纤维四糖的纯度都在70％以上。
附图说明
图1为本发明实施例提供的CcCel9ATM4晶体结构模式图。(A)表面 结构模式图，-4～+2位点为活性中心，被含有6个葡萄糖单元的纤维素单 链填塞；(B)活性中心模式图，浅色(原绿色)为含有6个葡萄糖单元的纤维素单 链，深色(原红色)为与纤维素单链有相互作用的氨基酸位点。
图2为本发明实施例提供的CcCel9A突变靶位点H123、H372、R374 和Y415的保守性分析图(字母字体越大表示保守性越强)。
图3为本发明实施例提供的野生型、点突变体H123A、R374A和 H372A/Y415A的FACE电泳产物图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：
获得持续产生并积累纤维四糖的纤维素酶包括如下步骤：
1)同源建模与分子对接：以解纤维梭菌Clostridium cellulolyticum 中的Cel9G(PDB:1GA2)和嗜热裂孢菌Thermobifida fusca中的Cel9A (PDB:4TF4)，三维结构为模板，利用Discovery Studio 4.0构建目标 序列的结构模型；然后将纤维素单链(纤维素单链为大于6个葡萄糖单 元的纤维素链，能够填塞模型活性中心)利用Pymol 1.7 (http://www.pymol.org)将该纤维素单链与上述获得酶分子的结构模 型进行分子对接，获得与CcCel9A结构域相同的酶。
并且在获得的模型中标注出酶分子的活性中心及CBM区域与底物结合的 氨基酸位点。
2)突变位点的选择
(1)将Clostridium cellulosi CS-4-4菌株(1.Zhang,K.；Chen,X.； Schwarz,W.H.；Li,F.,Synergism of glycoside hydrolase secretomes from two thermophilicbacteria cocultivated on lignocellulose. Appl Environ Microbiol 2014,80(8),2592-601.)的CcCel9A活性 中心(SEQ ID NO.1所示)各氨基酸位点与上述经底物结合能的计算模拟 模型进行分析：
根据CcCel9A与上述获得底物对接结构模型的分析(Darden,T.； York,D.；Pedersen,L.,Particle Mesh Ewald-an N.Log(N)Method for Ewald Sums in LargeSystems.J Chem Phys 1993,98(12), 10089-10092.)，找到与底物距离以内的氨基酸位点，并计算了氨基酸 与底物的结合能(表1)：
表1
由于目的产物是纤维四糖，因此-1～-4位点不能改变，突变位点只 能从与+1&+2亚位点相互作用的氨基酸里面选择，因此初步选择与底物结 合作用力大的位点H123，H372，R374和Y415作为下一步点突变的靶位 点。
(2)氨基酸位点的保守性分析
将已知氨基酸序列的7个GH9家族的内切酶包括解纤维梭菌 Clostridiumcellulolyticum来源的Cel9G,嗜热裂孢菌Thermobifida fusca来源的Cel9A，热线梭菌Clostridium thermocellum来源的Cel9I、 Cel9N、Cel9R，Clostridium phytofermentans来源的Cel9,Clostridium cellulosi CS-4-4来源的Cel9B连同CcCel9A的序列一起比对进行保守 性分析，依据是氨基酸序列的相似性,选取完全保守的H123，H372，R374 和Y415作为靶位点(图2)。
持续性内切纤维素酶CcCel9A的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
ATGAGGACGTTTAAAAAATTCCTCAGCGCGGCGCTGTCAGCGGCAGTTGTAAGCATGACCGCCATCCCGATGCCGTTTGCTGCTTCAGCGGCGACCCAGGCATCTGGCAGCTACAACTACGGCGAAGCGCTGCAGAAAGCAATCATGTTTTATGAATTCCAGCGTTCCGGTCCCGTTGCCCCAGACCAGCGCAACAACTGGCGCGGCGATTCCGGCATGAGCGACGGAAGCGACGTTGGTCTCGACCTCACCGGCGGTTATTATGACGCGGGCGACCATGTAAAGTTCAATCTTCCTATGTCATATACAGCCGCTATGCTGGCATGGGACGTTTATGAGAACAAGGATGCCCTTGCTTCAAGTGGTCAGCTCAGCTACATAAAAACTGCAATAAAGTGGGCAACGGACTACCTTATTAAGTGTCATCCGTCACCCAACGTATTCTATTATCAGGTGGGCGACGGCAGCCTTGACCACGCATGGTGGGGGCCTGCCGAGGTCATGCAGATGAAACGCCCGGCCTTTAAGGTTGATACCTCAAGCCCAGGTTCAACCGTTTCTGCTGAAGCAGCCGCAGCTCTGGCGGCAGCGGCAGTTGTCTTTGAGGACTCCGATCCCTCATATGCCGCAAATTGCCTGTCGCATGCGAAAGACTTATTCAATTTCGCAGATTCGACAAAGAGCGATGCCGGCTATACAGCCGCTTCGGGATATTACAACTCTTTCAGCGGCTTCTATGATGAACTTTCATGGGCTGCAGTATGGCTTTACATCGCAACAGGCGATTCAGATTATCTCGATAAGGCTGAATCCTATGTTGCCAAATGGAACAGGCAGGGCCAGTCGGACATTATAGAGTATAAGTACACCCAGTGCTGGGATGATGTCCATTATGGTGCCCAGCTCCTGCTGGCTCGTATCACAGGCAAGTCCATTTATAAAGAATCAGTTGAGAGGAACCTTGACTGGTGGACAACAGGTTATGATGGCGACAGGGTTACATATACGCCTAAAGGGCTCGCATGGCTCCAACAGTGGGGTCCATTAAGATATGCAACAACGGCGGCATTCCTGGCCGACGTTTATGCGAACAGCGGACTTTGCAGCGCCGAAAAGGCCAATACTTACAAAGCGTTTGCAAAGCAACAGGTAGACTATGCACTTGGCTCTTCGGGACGCAGCTATGTAATCGGATTCGGTACCAATTATCCGAAGAATCCTCATCACAGGACAGCTGAAAGCTCATGGGCTGACAGCATGCAGATACCCGGTTACTGCCGCCACCTCCTTGTTGGCGCACTGGTCGGCGGACCGGACCAAGGGGACAGCTATGATGATTCATGCGCCAACTATACCCAGACAGAAGTTGCTTGCGACTACAACGCGGGCCTTGTCTGTGCGCTTACCTCTTTGTACAGAGATTACGGCGGATCGCCGATTGAAGGCTTAAATGCAATCGAGACTCCGACAAATAACGAATTCTTTGTAGAAGCCTCAGTTAACTCCGCAGGCAGCAACTTTGAGGAAATCAAAGCGTTGATCTACAACGAATCAGGTTGGCCTGCAAGAATGGGGGACAAGCTCTCATTCAAATACTTTATTGATATCAGTGAACTCGTCAAAGCTGGCTACAGCGCGAAAGACGTCACCATTAAGACCAATTACAACGCCGGCGCGACTGTCAGCGGCCTTTATCCGTGGGACGAGACACACAATATCTACTATGTAAATGTTGATTTCACCGGCACAAAGATCTATCCGGGCGGACAGTCTGTTTATAGGAAAGAAGTCCAGTTCAGAATGTCCTATCCGGAGAATGTCAACGTGTGGGATAACTCGAACGACTTCTCATACGAGGGTATTTCTACAACCCCGGGTTCATCACCCGTACTTGCGCTCAATATTCCGGTTTATGACGACGGTGTAAAGATCTTTGGCAATGAGCCGGGTTCAAGCGGCGTAAAGGATGCTTCAATCACACCGACAACTGCGACATTTGACCTCAATCCCCAGAATCAGGCGGACATCTCCGTTGCAGTAAATGCCAACGGCAATACGCTCAAAGGCATTTATTACGGAACCACCGCCCTTGTAAAAGGCACAGATTATACAGTGTCAAGTGACGGCAAGACAGTCACTATCTCAAAGAACTTCCTTTCAACATTGGATCAGGGAACTGCGAACCTGAAGTTTGATTTTGACGCAGGTGCAGATCCTGTTCTCACAGTAACAATAACCGACACAACGCCGGTTGTAAGTGCTGAGATTTCACCGACAACTGCGACATTTGACCTTAACCCCGAAAAACAGGCCGATATACCTGTTTCAGTTACTTACAACGGCAAGACGCTCAAGGGTATCTATAACGGAACTACTGCCCTTGCAGAAGGCACAGATTATACTGTGTCAAGTGGCGGCGATACAATCACTATCTTAAAGAGCTATCTTGCAACATTAGATGAGGGAACAGCGAACCTGAGGTTTGATTTTGACTCAGGCACAGACCCGGTTCTCAAAGTCACGATTACCGACAGTACACCGGTTGTAGATTCTGAGATTTCACCGACGACTGCAACCTTTGACCTCAATGCCGAGAATCAGGCCGATATTCCTGTTGAGGTCACCTACAACGGCAATACGCTGAACGGCATTTACAACGGCAGCACAGCCCTTGTAAAAGGCACTGACTACACAGTCAGCAGCGACGGAACAGTTACTATACTCAAATCCTATCTCTCAAAGCAGCCGGTTGGCACTCTGAATCTCATATTCGACTTCAACAAGGGCACAGACCCGATCCTTGCAATAACCGTTGTCAATACGTCGCCGATAGTCATTGGTGACCTTAAGCTCCAGATGTTCAACTCCAATACCCAGTCGACGACAAACGGCATTATGCCGCGCTTCCGTCTTGTCAACACTGGTGATACTGCTGTTGACCTGTCAACAGTAAAGATCCGCTACTACTTCACAGAGGACGGCACCCAGAGTCAGAACTTCTGGTGTGACTGGTCAAGTGTAGGTAGCTCCAACGTCACCAGCACATTTGTCAAGATGGATAATCCGGTCGATGGGGCGGATACCTACCTTGAGATAGGATTCACCTCTGGCGCGGGACAGATTGCACCGGGTGCAAGCGTTGAAGTCCAGGCCCGCTTCTCAAAGGCTGACTGGAGCGATTACAATCAGGCAGACGACTATTCGTTTAACCCAACGGATAATTCGTATGTCGATTGGACAAAGGCAACTCTTTATATAGATGGCAAACTCGAATGGGGCATGGAGC CCTAA
(a)序列特征：
●长度：3291
●类型：基因序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Clostridium cellulosi CS-4-4
SEQ ID NO.2:
MRTFKKFLSAALSAAVVSMTAIPMPFAASAATQASGSYNYGEALQKAIMFYEFQRSGPVAPDQRNNWRGDSGMSDGSDVGLDLTGGYYDAGDHVKFNLPMSYTAAMLAWDVYENKDALASSGQLSYIKTAIKWATDYLIKCHPSPNVFYYQVGDGSLDHAWWGPAEVMQMKRPAFKVDTSSPGSTVSAEAAAALAAAAVVFEDSDPSYAANCLSHAKDLFNFADSTKSDAGYTAASGYYNSFSGFYDELSWAAVWLYIATGDSDYLDKAESYVAKWNRQGQSDIIEYKYTQCWDDVHYGAQLLLARITGKSIYKESVERNLDWWTTGYDGDRVTYTPKGLAWLQQWGPLRYATTAAFLADVYANSGLCSAEKANTYKAFAKQQVDYALGSSGRSYVIGFGTNYPKNPHHRTAESSWADSMQIPGYCRHLLVGALVGGPDQGDSYDDSCANYTQTEVACDYNAGLVCALTSLYRDYGGSPIEGLNAIETPTNNEFFVEASVNSAGSNFEEIKALIYNESGWPARMGDKLSFKYFIDISELVKAGYSAKDVTIKTNYNAGATVSGLYPWDETHNIYYVNVDFTGTKIYPGGQSVYRKEVQFRMSYPENVNVWDNSNDFSYEGISTTPGSSPVLALNIPVYDDGVKIFGNEPGSSGVKDASITPTTATFDLNPQNQADISVAVNANGNTLKGIYYGTTALVKGTDYTVSSDGKTVTISKNFLSTLDQGTANLKFDFDAGADPVLTVTITDTTPVVSAEISPTTATFDLNPEKQADIPVSVTYNGKTLKGIYNGTTALAEGTDYTVSSGGDTITILKSYLATLDEGTANLRFDFDSGTDPVLKVTITDSTPVVDSEISPTTATFDLNAENQADIPVEVTYNGNTLNGIYNGSTALVKGTDYTVSSDGTVTILKSYLSKQPVGTLNLIFDFNKGTDPILAITVVNTSPIVIGDLKLQMFNSNTQSTTNGIMPRFRLVNTGDTAVDLSTVKIRYYFTEDGTQSQNFWCDWSSVGSSNVTSTFVKMDNPVDGADTYLEIGFTSGAGQIAPGASVEVQARFSKADWSDYNQADDYSFNPTDNSYVDWTKATLYIDGKLEWGMEP
(a)序列特征：
●长度：1096
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Clostridium cellulosi CS-4-4
3)点突变体的构建：
根据基因序列和目的位点设计一系列点突变引物(表2)，以含原基因序 列的表达质粒pEasyE2-3880为模板分别进行PCR扩增即得到不同的突变 体。
PCR扩增体系如下：
程序如下：94℃预变性2-5min，94℃变性20s，55℃退火20s， 72℃延伸2～4kb/min，循环20次，72℃延伸10min。
对上述扩增得到的不同突变体进行电泳检测，电泳检测条带正确后， 分别加1μlDMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1小时用于消化体外 降解非突变型质粒模板(甲基化质粒模板)，然后转化DMT感受态细胞可 以体内降解非突变型质粒模板(甲基化质粒模板)，具体步骤如下：
(1)加入2～5μl DMT酶消化产物于50μl感受态细胞中(在感受态细胞 刚刚解冻时加入)，轻弹混匀，冰浴20～30min。
(2)42℃水浴热激45s，立即置于冰上2min。
(3)加250μl平衡至室温的LB培养基，200rpm，37℃培养1h。
(4)取200μl菌液均匀地涂在平板上，37℃培养箱中过夜培养。
挑取阳性克隆测序验证，验证正确的克隆进行保种和质粒提取。
即分别得到H123A，R374A和H372A/Y415A三种不同的突变体。
引物设计如表2所示
注，将上述靶位点突变为没有功能侧链的丙氨酸(简写为A)。
4)点突变体的表达纯化：将上述提取的不同质粒分别转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态，37℃培养至OD600为0.6-0.8时加IPTG至终浓度为 500mM,16℃诱导表达过夜。分别收集菌体之后进行超声波细胞破碎， 程序为破5s，停5s，破碎总时间为30min。
分别破碎完成后在低温下以10000rpm离心20min，所得上清经 0.22μm滤器过滤后即得到粗酶液，然后用镍柱进行目的蛋白的分离纯化， 步骤如下：
a.Ni-NTA-Sefinose柱中的乙醇流出后，加入总体积为10ml的经 0.22μm滤膜过滤的无菌水，每次加入2ml。
b.加入总体积10ml的buffer 0，每次加入2ml。
c.加入步骤2中所得的粗酶液，并穿透3次。
d.加入buffer 0，直至无蛋白被洗脱出来(将一滴洗脱液加入到 100μl考马斯亮蓝蛋白染液中，染液不变蓝色)。
e.依次加入咪唑浓度逐渐升高(5mM-500mM)的洗脱buffer，直至 没有蛋白被洗脱出来。
f.加入镍柱中总体积10ml的buffer 0，每次加入2ml。
g.加入过滤过的30％乙醇，保存镍柱。
h.用相应孔径的超滤管浓缩纯化后的目的蛋白，然后用PC buffer 置换含有咪唑的buffer，以去除蛋白溶液中的咪唑。
i.将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE，以确定目的蛋白的纯度，然后 用BCA的方法测定蛋白浓度。即获得不同突变的纯化突变体，
实施例2：点突变体蛋白酶解无定型纤维素
将上述构建获得的点突变体蛋白进行表达纯化后，加入至纤维素底 物中进行纤维四糖的生产，同时也野生型为作为对照，反应体系如下： 在10g/L无定型纤维素中加入终浓度为1μM的酶，总体积为5mL，60℃ 孵育48h，灭活蛋白之后离心取上清进行产物谱的检测。
其中，点突变体的产物图谱分析：在50μl 1％的RAC溶液中加入3μM 上述获得不同点突变的纯化的酶液，然后加PC buffer至总体积为100μl， 置于60℃反应。按时间5min、10min、20min、40min、120min取样， 每次取样体积为10μl，取样后沸水浴10min灭活酶液。
取5μl纤维素酶降解产物，加入5μl 0.2M ANDS(溶于15％的醋酸)， 室温避光放置1h；加入1M NaCNBH3(溶于DMSO)，置于40℃过夜；点 甩离心以收集全部液体，开盖放置30min，挥发掉管内的HCN气体，完成 样品制备。电泳Marker使用实验室制备的纤维寡糖，标记方式与酶解产 物相同。
凝胶制备过程如下：分离胶包括35％聚丙稀酰胺、375mM Tris-HCl(pH 8.8)，0.1％APS以及0.02％TEMED；浓缩胶包括5％丙稀酰胺，62.5mM Tris-HCl(pH 6.8)，0.1％APS以及0.02％TEMED。上样缓冲液使用50％的蔗 糖，样品与上样缓冲液的体积比为1:1，每个样品的上样量为5μl。电 泳的整个过程在冰水浴的条件下进行，电流调至7mA/胶，大约3h后， 使用紫外灯观察样品前沿，当前沿到达凝胶底部时结束电泳。将胶块取 出，置于凝胶成像系统中拍摄图片。电泳结束后使用凝胶成像系统，获 得电泳图片(参见图3)。由图3可见，点突变体蛋白H123A，R374A和 H372A/Y415A的产物谱中纤维四糖的比例明显比野生型(WT)高，经条带 灰度计算三种突变体的水解产物中纤维四糖分别占比75％，70％和80％(w/w)。
实施例3：点突变体蛋白参与纤维素酶制剂复配
将构建好的点突变体蛋白H372A/Y415A进行表达纯化后，与诺维信纤 维素酶制剂Cellic CTec2进行复配，按1:5的摩尔比混合在10g/L气 爆处理后的玉米秸秆中加入终浓度为5μM的上述复配所得酶，总体积为 5mL，60℃孵育48h。以不加点突变体蛋白H372A/R374A的样品作为对 照，采取与实验组相同的处理。灭活蛋白之后离心取上清进行产物的检 测，结果显示实验组与对照组相比纤维寡糖产率分别为30％和40％，本发 明酶与诺维信酶通过协同作用可将纤维寡糖产量提高10％。可见采用上述 实施例获得的酶与现有的酶混合进行降解能产生协同效应，进而提高产 糖效率。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3291
<212> DNA
<213> 持续性内切纤维素酶CcCel9A(Clostridium cellulosi CS-4-4)
<400> 1
atgaggacgt ttaaaaaatt cctcagcgcg gcgctgtcag cggcagttgt aagcatgacc 60
gccatcccga tgccgtttgc tgcttcagcg gcgacccagg catctggcag ctacaactac 120
ggcgaagcgc tgcagaaagc aatcatgttt tatgaattcc agcgttccgg tcccgttgcc 180
ccagaccagc gcaacaactg gcgcggcgat tccggcatga gcgacggaag cgacgttggt 240
ctcgacctca ccggcggtta ttatgacgcg ggcgaccatg taaagttcaa tcttcctatg 300
tcatatacag ccgctatgct ggcatgggac gtttatgaga acaaggatgc ccttgcttca 360
agtggtcagc tcagctacat aaaaactgca ataaagtggg caacggacta ccttattaag 420
tgtcatccgt cacccaacgt attctattat caggtgggcg acggcagcct tgaccacgca 480
tggtgggggc ctgccgaggt catgcagatg aaacgcccgg cctttaaggt tgatacctca 540
agcccaggtt caaccgtttc tgctgaagca gccgcagctc tggcggcagc ggcagttgtc 600
tttgaggact ccgatccctc atatgccgca aattgcctgt cgcatgcgaa agacttattc 660
aatttcgcag attcgacaaa gagcgatgcc ggctatacag ccgcttcggg atattacaac 720
tctttcagcg gcttctatga tgaactttca tgggctgcag tatggcttta catcgcaaca 780
ggcgattcag attatctcga taaggctgaa tcctatgttg ccaaatggaa caggcagggc 840
cagtcggaca ttatagagta taagtacacc cagtgctggg atgatgtcca ttatggtgcc 900
cagctcctgc tggctcgtat cacaggcaag tccatttata aagaatcagt tgagaggaac 960
cttgactggt ggacaacagg ttatgatggc gacagggtta catatacgcc taaagggctc 1020
gcatggctcc aacagtgggg tccattaaga tatgcaacaa cggcggcatt cctggccgac 1080
gtttatgcga acagcggact ttgcagcgcc gaaaaggcca atacttacaa agcgtttgca 1140
aagcaacagg tagactatgc acttggctct tcgggacgca gctatgtaat cggattcggt 1200
accaattatc cgaagaatcc tcatcacagg acagctgaaa gctcatgggc tgacagcatg 1260
cagatacccg gttactgccg ccacctcctt gttggcgcac tggtcggcgg accggaccaa 1320
ggggacagct atgatgattc atgcgccaac tatacccaga cagaagttgc ttgcgactac 1380
aacgcgggcc ttgtctgtgc gcttacctct ttgtacagag attacggcgg atcgccgatt 1440
gaaggcttaa atgcaatcga gactccgaca aataacgaat tctttgtaga agcctcagtt 1500
aactccgcag gcagcaactt tgaggaaatc aaagcgttga tctacaacga atcaggttgg 1560
cctgcaagaa tgggggacaa gctctcattc aaatacttta ttgatatcag tgaactcgtc 1620
aaagctggct acagcgcgaa agacgtcacc attaagacca attacaacgc cggcgcgact 1680
gtcagcggcc tttatccgtg ggacgagaca cacaatatct actatgtaaa tgttgatttc 1740
accggcacaa agatctatcc gggcggacag tctgtttata ggaaagaagt ccagttcaga 1800
atgtcctatc cggagaatgt caacgtgtgg gataactcga acgacttctc atacgagggt 1860
atttctacaa ccccgggttc atcacccgta cttgcgctca atattccggt ttatgacgac 1920
ggtgtaaaga tctttggcaa tgagccgggt tcaagcggcg taaaggatgc ttcaatcaca 1980
ccgacaactg cgacatttga cctcaatccc cagaatcagg cggacatctc cgttgcagta 2040
aatgccaacg gcaatacgct caaaggcatt tattacggaa ccaccgccct tgtaaaaggc 2100
acagattata cagtgtcaag tgacggcaag acagtcacta tctcaaagaa cttcctttca 2160
acattggatc agggaactgc gaacctgaag tttgattttg acgcaggtgc agatcctgtt 2220
ctcacagtaa caataaccga cacaacgccg gttgtaagtg ctgagatttc accgacaact 2280
gcgacatttg accttaaccc cgaaaaacag gccgatatac ctgtttcagt tacttacaac 2340
ggcaagacgc tcaagggtat ctataacgga actactgccc ttgcagaagg cacagattat 2400
actgtgtcaa gtggcggcga tacaatcact atcttaaaga gctatcttgc aacattagat 2460
gagggaacag cgaacctgag gtttgatttt gactcaggca cagacccggt tctcaaagtc 2520
acgattaccg acagtacacc ggttgtagat tctgagattt caccgacgac tgcaaccttt 2580
gacctcaatg ccgagaatca ggccgatatt cctgttgagg tcacctacaa cggcaatacg 2640
ctgaacggca tttacaacgg cagcacagcc cttgtaaaag gcactgacta cacagtcagc 2700
agcgacggaa cagttactat actcaaatcc tatctctcaa agcagccggt tggcactctg 2760
aatctcatat tcgacttcaa caagggcaca gacccgatcc ttgcaataac cgttgtcaat 2820
acgtcgccga tagtcattgg tgaccttaag ctccagatgt tcaactccaa tacccagtcg 2880
acgacaaacg gcattatgcc gcgcttccgt cttgtcaaca ctggtgatac tgctgttgac 2940
ctgtcaacag taaagatccg ctactacttc acagaggacg gcacccagag tcagaacttc 3000
tggtgtgact ggtcaagtgt aggtagctcc aacgtcacca gcacatttgt caagatggat 3060
aatccggtcg atggggcgga tacctacctt gagataggat tcacctctgg cgcgggacag 3120
attgcaccgg gtgcaagcgt tgaagtccag gcccgcttct caaaggctga ctggagcgat 3180
tacaatcagg cagacgacta ttcgtttaac ccaacggata attcgtatgt cgattggaca 3240
aaggcaactc tttatataga tggcaaactc gaatggggca tggagcccta a 3291

Claims (10)

1.一种调控主产纤维四糖突变的靶位点，其特征在于：持续性内切纤维素酶CcCel9A调控主产纤维四糖突变的靶位点为H123，H372，R374和Y415中的一种或几种。
2.一种利用权利要求1所述的调控突变的靶位点主产物为纤维四糖的重组纤维素酶，其特征在于：重组纤维素酶为产纤维四糖的持续性内切纤维素酶CcCel9A中在H123A、R374A或H372A/Y415A位点突变所得突变体。
3.按权利要求2所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶，其特征在于：所述产纤维四糖的持续性内切纤维素酶CcCel9A为Clostridium cellulosi CS-4-4菌株中的持续性内切纤维素酶CcCel9A；其基因序列如SEQ ID NO：1中所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2中所示。
4.一种构建权利要求2所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的引物，其特征在于：
所述获得H372A/Y415A突变的引物为：
Y415AF1(5’-3’)GATGATTCATGCGCCAACGCTACCCAGACAC，
Y415AR1(5’-3’)GCGTTGGCGCATGAATCATCATAGCTGTG；
H372AF1(5’-3’)TATCCGAAGAATCCTGCTCACAGGACAG，
H372AR1(5’-3’)GCAGGATTCTTCGGATAATTGGTACCG；
所述获得H123A突变的引物为：
H123AF1(5’-3’)GACGGCAGCCTTGACGCCGCATGGTGGGGGCCTG，
H123AR1(5’-3’)CAGGCCCCCACCATGCGGCGTCAAGGCTGCCGTC；
所述获得R374A突变的引物为：
R374AF1(5’-3’)GAAGAATCCTCATCACGCGACAGCTGAAAG，
R374AR1(5’-3’)GCGTGATGAGGATTCTTCGGATAATTGG。
5.一种权利要求2所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的构建方法，其特征在于：根据CcCel9A活性中心的特点，确定突变的亚位点，通过PCR的引物设计引入突变，转化大肠杆菌构建点突变基因的表达载体，然后通过诱导表达得到突变体蛋白。
6.按权利要求5所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的构建方法，其特征在于：所述突变的亚位点的确定为将CcCel9A的活性中心中对与各个亚位点相互作用力大的氨基酸位点即作为突变的靶位点。
7.按权利要求6所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的构建方法，其特征在于：所述持续性内切纤维素酶CcCel9A调控主产纤维四糖突变的靶位点为H123，H372，R374和Y415中的一种或几种。
8.按权利要求5所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的构建方法，其特征在于：所述获得H372A/Y415A突变的引物为：
Y415AF1(5’-3’)GATGATTCATGCGCCAACGCTACCCAGACAC，
Y415AR1(5’-3’)GCGTTGGCGCATGAATCATCATAGCTGTG；
H372AF1(5’-3’)TATCCGAAGAATCCTGCTCACAGGACAG，
H372AR1(5’-3’)GCAGGATTCTTCGGATAATTGGTACCG；
所述获得H123A突变的引物为：
H123AF1(5’-3’)GACGGCAGCCTTGACGCCGCATGGTGGGGGCCTG，
H123AR1(5’-3’)CAGGCCCCCACCATGCGGCGTCAAGGCTGCCGTC；
所述获得R374A突变的引物为：
R374AF1(5’-3’)GAAGAATCCTCATCACGCGACAGCTGAAAG，
R374AR1(5’-3’)GCGTGATGAGGATTCTTCGGATAATTGG。
9.一种权利要求权利要求2所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的应用，其特征在于：所述重组纤维素酶在调控底物主产纤维四糖中的应用。
10.按权利要求权利要求9所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的应用，其特征在于：所述底物为含纤维素的物质。
CN201810073315.7A 2018-01-25 2018-01-25 一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用 Active CN110079513B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810073315.7A CN110079513B (zh) 2018-01-25 2018-01-25 一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810073315.7A CN110079513B (zh) 2018-01-25 2018-01-25 一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110079513A true CN110079513A (zh) 2019-08-02
CN110079513B CN110079513B (zh) 2022-10-25

Family

ID=67412097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810073315.7A Active CN110079513B (zh) 2018-01-25 2018-01-25 一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110079513B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104178472A (zh) * 2013-05-28 2014-12-03 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 降解纤维素的酶及其构建和应用
CN104630185A (zh) * 2015-02-03 2015-05-20 中国农业科学院饲料研究所 对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶及其编码基因和应用
CN104736701A (zh) * 2012-03-30 2015-06-24 巴斯夫酶有限责任公司(美国) 在极端井况下水解瓜尔胶压裂流体的纤维素酶的编码基因

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104736701A (zh) * 2012-03-30 2015-06-24 巴斯夫酶有限责任公司(美国) 在极端井况下水解瓜尔胶压裂流体的纤维素酶的编码基因
CN104178472A (zh) * 2013-05-28 2014-12-03 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 降解纤维素的酶及其构建和应用
CN104630185A (zh) * 2015-02-03 2015-05-20 中国农业科学院饲料研究所 对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶及其编码基因和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUNDI ZHANG等: "Synergism of glycoside hydrolase secretomes from two thermophilic bacteria cocultivated on lignocellulose", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
杨敏: "高温糖苷水解酶酶系协同降解木质纤维素的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技Ⅰ辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110079513B (zh) 2022-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105087456B (zh) 一种产特定分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌构建的方法
CN109988739A (zh) 一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法
CN106520586B (zh) 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
CN106916752A (zh) 制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法及其专用菌株
CN101979644A (zh) 融合蛋白一步催化制备n-乙酰神经氨酸的方法
CN1693448A (zh) 一种酵母基因工程菌及耐热耐碱木聚糖酶制剂和应用方法
CN103146726B (zh) 一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法
CN103952326A (zh) 一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用
CN113403245A (zh) 一种重组大肠杆菌固定化细胞及其应用
WO2022016641A1 (zh) 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的菌株及其构建方法和应用
CN103695323B (zh) 一种稳定、高产α-转移葡萄糖苷酶的菌株
CN103614303B (zh) 一种表达糖化酶的里氏木霉菌株
CN105349461A (zh) 一株产琼胶酶溶藻弧菌及应用
CN103215198B (zh) 利用重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法
CN104789586A (zh) 大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用
CN105695370B (zh) 一种丁酸梭菌及其培养方法与应用
CN106497881A (zh) 稳定高效表达重组人透明质酸酶cho‑k1sp细胞株及其构建方法
CN104560845A (zh) 一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法
CN109517777A (zh) 一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用
CN107460152A (zh) 产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途
TW201420760A (zh) 枯草桿菌菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及其應用
CN105754923A (zh) 一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法
CN103911337B (zh) 高粘附性丁酸梭菌及其制备方法
CN110079513A (zh) 一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant