CN110072860A - 可用作免疫调节剂的化合物 - Google Patents

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Abstract

本公开一般地涉及可用作免疫调节剂的化合物。本文提供化合物、包含此类化合物的组合物及其使用方法。本公开进一步涉及包含至少一种根据本公开所述化合物的药物组合物，其可用于治疗各种疾病，包括癌症和感染性疾病。

Description

可用作免疫调节剂的化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月20日提交的美国临时申请序列号62/436,674的优先权，所述申请通过引用并入本文。
本公开一般地涉及可用作PD-1/PD-L1蛋白/蛋白和CD80/PD-L1蛋白/蛋白的相互作用的抑制剂的化合物。本文提供了化合物、包含此类化合物的组合物及其使用方法。本公开进一步涉及包含至少一种根据本公开化合物的药物组合物，其可用于治疗各种疾病，包括癌症和感染性疾病。
程序性死亡-1 (CD279)是T细胞上的一种受体，其已被证明在与其任一配体(程序性死亡-配体1 (PD-L1、CD274、B7-H1)或PD-L2 (CD273、B7-DC))结合时抑制T细胞受体的活化信号(Sharpe等人, Nat. Imm. 2007)。当表达PD-1的T细胞接触表达其配体的细胞时，响应抗原刺激的功能活性被降低，所述功能活性包括增殖、细胞因子分泌和细胞溶解活性。在感染或肿瘤消退期间或在自身耐受性发展期间PD-1/PD-配体的相互作用下调免疫应答(Keir Me, Butte MJ, Freeman GJ等人, Annu. Rev. Immunol. 2008；26: Epub)。慢性抗原刺激，诸如在肿瘤疾病或慢性感染期间出现的慢性抗原刺激，致使T细胞表达升高水平的PD-1且在针对慢性抗原的活性方面功能异常(评述于Kim和Ahmed, Curr Opin Imm, 2010中)。这被称为"T细胞枯竭"。B细胞也呈现PD-1/PD-配体抑制和"枯竭"。
PD-L1也被证明与CD80相互作用(Butte MJ等人, Immunity；27:111-122(2007))。已经证明PD-L1/CD80对表达免疫细胞的相互作用为抑制性相互作用。已经证明阻断该相互作用可以消除这种抑制性相互作用(Paterson AM等人, J Immunol., 187:1097-1105 (2011)；Yang J等人, J Immunol. Aug 1；187(3):1113-9 (2011))。
已经证明使用PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用在许多系统中恢复和增强T细胞活化。患有晚期癌症的患者受益于使用针对PD-L1的单克隆抗体的疗法(Brahmer等人,New Engl J Med 2012)。肿瘤的临床前动物模型已经证明通过单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1路径可以增强免疫应答且实现对多种组织学上不同的肿瘤的免疫应答(Dong H, Chen L.J Mol Med. 2003；81(5):281-287；Dong H, Strome SE, Salamoa DR等人, Nat Med.2002；8(8):793-800)。
干扰PD-1/PD-L1相互作用也已经证明在慢性感染系统中增强的T细胞活性。小鼠的慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(Chronic lymphocytic chorio meningitis)病毒感染也表现出随着阻断PD-L1而改善的病毒清除率和恢复的免疫力(Barber DL, Wherry EJ,Masopust D等人, Nature. 2006；439(7077):682-687)。感染HIV-1的人源化小鼠表现出对病毒血症增强的防护和减少的CD4+T细胞的病毒消耗(Palmer等人, J. Immunol 2013)。经由PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1可以恢复HIV患者(Day, Nature 2006；Petrovas, J. Exp. Med. 2006；Trautman, Nature Med. 2006；D'Souza, J.Immunol. 2007；Zhang,Blood 2007；Kaufmann, Nature Imm. 2007；Kasu, J. Immunol. 2010；Porichis, Blood2011)、HCV患者[Golden-Mason, J. Virol. 2007；Jeung, J. Leuk. Biol. 2007；Urbani,J. Hepatol. 2008；Nakamoto, PLoS Path. 2009；Nakamoto, Gastroenterology 2008]或HBV患者(Boni, J. Virol. 2007；Fisicaro, Gastro. 2010；Fisicaro等人,Gastroenterology, 2012；Boni等人, Gastro., 2012；Penna等人, J Hep, 2012；Raziorrough, Hepatology 2009；Liang, World J Gastro. 2010；Zhang, Gastro. 2008)的T细胞的体外抗原特异性功能。
也已经证明阻断PD-L1/CD80相互作用可以刺激免疫力(Yang J.等人, J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011))。已经证明由阻断PD-L1/CD80相互作用引起的免疫刺激通过与阻断另外的PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用相结合而得到增强。
免疫细胞表型的改变被假设为是感染性休克的重要因素(Hotchkiss等人, Nat Rev Immunol (2013))。这些包括PD-1和PD-L1水平和T细胞凋亡的增加(Guignant等人,Crit. Care (2011))。针对PD-L1的抗体可以降低免疫细胞凋亡的水平(Zhang等人, Crit. Care (2011))。此外，缺乏PD-1表达的小鼠与野生型小鼠相比对感染性休克症状更具抗性(Yang J.等人, J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011))。研究表明，使用抗体阻断PD-L1相互作用可以抑制不当免疫应答和改善疾病症状。
除了增强对慢性抗原的免疫应答之外，也已经证明阻断PD-1/PD-L1路径可以增强对疫苗接种(包括在慢性感染的情形下的治疗性疫苗接种)的应答(S. J. Ha, S. N.Mueller, E. J. Wherry等人, The Journal of Experimental Medicine, vol. 205,no. 3, pp. 543–555, 2008.; A. C. Finnefrock, A. Tang, F. Li等人,The Journal of Immunology, vol. 182, no. 2, pp.980–987, 2009; M. -Y. Song, S. -H. Park,H. J. Nam, D. -H. Choi和Y.-C. Sung, The Journal of Immunotherapy, vol. 34,no. 3, pp. 297–306, 2011)。
PD-1路径是由慢性感染和肿瘤疾病期间的慢性抗原刺激引起的T细胞枯竭中的关键抑制分子。经由靶向PD-L1蛋白来阻断PD-1/PD-L1相互作用已经证明可以在体外和体内恢复抗原特异性T细胞免疫功能，包括在肿瘤或慢性感染的背景下增强对疫苗接种的应答。因此，需要阻断PD-L1与PD-1或CD80的相互作用的药剂。
申请人发现了有效化合物，所述化合物具有作为PD-L1与PD-1和CD80的相互作用的抑制剂的活性，并因此可以用于治疗性给药以增强在癌症或感染中的免疫力，包括治疗性疫苗。提供这些化合物可用作具有所期望的稳定性、生物利用度、治疗指数和毒性值的药物，所述期望的稳定性、生物利用度、治疗指数和毒性值对于其成药性(drugability)而言是重要的。
在第一方面，本公开提供式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
m是0、1或2；
Z选自-OCH3和-O(CH2)nAr；其中，
n是1、2、3或4；
Ar选自苯基和吡啶基，其中每个环任选地被1、2、3或4个取代基取代，所述取代基独立地选自C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、酰氨基、羧基、氰基、甲酰基、卤素、卤代C1-C4烷基、卤代C1-C4烷氧基和硝基；
A选自-CH2O-、-OCH2-、-(CH2)2-、-CH=CH-、-C(O)NH-和-NHC(O)-，其中每个基团绘制为其左侧连接到R2上并且其右侧连接到苯环上；
R2选自
其中，
Rm和Rn独立地选自氢、C1-C3烷基和卤素；
Y选自氢、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基、氰基和卤素；
R5是任选含有一个或两个独立地选自氮和氧的杂原子并含有零个、一个、两个或三个双键的三至十元单环或双环，其中所述环任选地被一个、两个或三个独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷氧基C1-C4烷基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基、二(C1-C4)烷基氨基、氨基、氨基C1-C4烷基、羧基、羧基C1-C4烷基、C3-C4环烷基和苯基的基团取代；
每个R3独立地选自C1-C4烷基、氰基、卤素和卤代C1-C4烷基；
R4选自-CH2OH、-CHO和-(CH2)nNRqR8；其中
n是1、2、3或4；
Rq选自氢和C1-C4烷基；
R8选自氢、C1-C4烷基、-(CH2)nN(CH3)2、
R9选自氢和C1烷基；
每个R9'独立地选自氢和C1-C3烷基；且
R10选自氢和C1-C4烷基；或
R8和Rq与它们所连接的氮原子一起形成环，所述环是；其中，
s是0、1或2；
z是1、2或3；且
每个R14独立地选自C1-C4烷氧基羰基、C1-C6烷基、羧基、卤素、羟基和羟基C1-C4烷基。
在第一方面的第一实施方案中，本公开提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中m是1且R3是卤素。在第一方面的第二实施方案中，Z是-OCH2Ar，其中Ar是被氰基取代的吡啶基。在第三实施方案中，A是-CH2O-。
在第一方面的第四实施方案中，本公开提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中
m是1；
R3是卤素；
Z是OCH2Ar，其中Ar是被氰基取代的吡啶基；
A是-CH2O-；
R2是
Y选自氢和C1烷基；
Rn选自氢和C1烷基；且
R5是含有一个氮原子和零个双键的六至八元单环或双环，其中所述环任选被一个选自C1烷基、二(C1-C4)烷基氨基、氨基、羧基C1-C4烷基和C3-C4环烷基的取代基取代。
在第一方面的第五实施方案中，本公开提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中
m是1；
R3是卤素；
Z是OCH2Ar，其中Ar是被氰基取代的吡啶基；
A是-CH2O-；
R2是
Y选自氢和C1烷基；
Rn选自氢和C1烷基；
R5是含有一个氮原子和零个双键的六至八元单环或双环，其中所述环任选被一个选自C1烷基、二(C1-C4)烷基氨基、氨基、羧基C1-C4烷基和C3-C4环烷基的取代基取代；且
R4是-(CH2)NRqR8；其中，
Rq选自氢和C1烷基；
R8选自和；
R9选自氢和C1烷基；
每个R9'独立地选自氢和C1烷基；且
R10选自氢和C1-C4烷基；或
R8和Rq与它们所连接的氮原子一起形成环，所述环是；其中，
s是1；
z是3；且
R14是羧基。
在第一方面的第六实施方案中，本公开提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中
m是1；
Z是-O(CH2)nAr；
n是1；
Ar是被一个氰基取代的吡啶基；
A是-CH2O-；
R2选自
其中，
Rm和Rn独立地选自氢和C1-C3烷基；
Y选自氢和C1-C3烷基；
R5是任选含有一个或两个独立地选自氮和氧的杂原子并含有零个、一个、两个或三个双键的五至八元单环或双环，其中所述环任选地被选自C1-C4烷基、二(C1-C4)烷基氨基、氨基、羧基C1-C4烷基和C3-C4环烷基的一个基团取代：
R3是卤素；
R4选自-CH2OH、-CHO和-(CH2)nNRqR8；其中，
n是1；
Rq选自氢和C1-C4烷基；
R8选自
R9选自氢和C1烷基；
每个R9'独立地选自氢和C1-C3烷基；且
R10选自氢和C1-C4烷基；或
R8和Rq与它们所连接的氮原子一起形成环，所述环是；其中，
s是1；
z是3；且
R14是羧基。
在第二方面，本公开提供药物组合物，其包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
在第三方面中，本公开提供一种增强、刺激、调节和/或增加有此需要的对象的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在所述第三方面的第一实施方案中，该方法还包括在式(I)的化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给药额外的药剂。在第二实施方案中，所述额外的药剂为抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂、调节基因表达的药剂和/或免疫应答调节剂。
在第四方面中，本公开提供一种抑制有此需要的对象中的癌细胞生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的式(I)的化合物或药学上可接受的盐。在第一实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在第五方面中，本公开提供一种治疗有此需要的对象中的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在所述第五方面的第一实施方案中，所述感染性疾病由病毒引起。在第二实施方案中，所述病毒选自HIV、甲型肝炎(Hepatitis A)、乙型肝炎(Hepatitis B)、丙型肝炎(Hepatitis C)、丁型肝炎(Hepatitis D)、疱疹病毒、乳突瘤病毒和流感。
在第六方面中，本公开提供一种治疗有此需要的对象中的感染性休克的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
在第七方面中，本公开提供用作药物的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本公开提供式(II)的化合物，
或其药学上可接受的盐，其中：
m是0、1或2；
Z是-O(CH2)nAr；
n是0、1、2、3或4；
Ar选自苯基和吡啶基，其中每个环任选地被1、2、3或4个取代基取代，所述取代基独立地选自C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、酰氨基、羧基、氰基、甲酰基、卤素、卤代C1-C4烷基、卤代C1-C4烷氧基和硝基；
A选自-CH2O-、-OCH2-、-(CH2)2-、-CH=CH-、-C(O)NH-和-NHC(O)-，其中每个基团绘制为其左侧连接到R2上并且其右侧连接到苯环上；
R2选自
其中，
Rm和Rn独立地选自氢、C1-C3烷基和卤素；
Y选自氢、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基、氰基和卤素；
R5是任选含有一个或两个独立地选自氮和氧的杂原子并含有零个、一个、两个或三个双键的三至十元单环或双环，其中所述环任选地被一个、两个或三个独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷氧基C1-C4烷基、C1-C4烷基、二(C1-C4)烷基氨基、氨基、氨基C1-C4烷基、羧基、羧基C1-C4烷基和C3-C4环烷基的基团取代；
每个R3独立地选自C1-C4烷基、氰基、卤素和卤代C1-C4烷基；
R4选自-CH2OH、-CHO和-(CH2)nNRqR8；其中，
n是1、2、3或4；
Rq选自氢和C1-C4烷基；
R8选自氢、C1-C4烷基、-(CH2)nN(CH3)2、
R9选自氢和C1烷基；
每个R9'独立地选自氢和C1-C3烷基；
R10选自氢和C1-C4烷基；或
R8和Rq与它们所连接的氮原子一起形成环，所述环是；其中，
s是0、1或2；
z是1、2或3；且
每个R14独立地选自C1-C4烷氧基羰基、C1-C6烷基、羧基、卤素、羟基和羟基C1-C4烷基。
除非本文中另有具体说明，否则以单数形式提及也可包括复数形式。例如，"一个/种(a/an)"可指一个/种，或一或多个/种。
如本文所用，短语"化合物或其药学上可接受的盐"指至少一种化合物、所述化合物的至少一种盐或其组合。例如，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐包括一种式(I)的化合物；两种式(I)的化合物；一种式(I)的化合物的一种盐；一种式(I)的化合物和所述式(I)的化合物的一或多种盐；和一种式(I)的化合物的两种或更多种盐。
除非另有说明，否则假定具有不饱和价态的任何原子具有足以使价态饱和的氢原子。
在整个说明书中，本领域技术人员可以选择基团及其取代基以提供稳定的部分和化合物。
下文列出用于描述本公开的各种术语的定义。当术语单独地或作为较大基团的一部分用于整个本说明书中时(除非在特定情况下以其它方式加以限制)，这些定义适用于术语。本文所阐述的定义优先于以引用的方式并入本文中的任何专利、专利申请和/或专利申请公开中所阐述的定义。
除非上下文清楚地另行指明，本文所用的单数形式"一个/种(a/an)"和"该"包括复数对象。
本公开的双环可以是单环或稠合、螺环或桥连双环结构。
本文所用的术语"C1-C3烷氧基"是指通过氧原子与母体分子部分连接的C1-C3烷基。
本文所用的术语"C1-C3烷氧基C1-C4烷基"是指通过C1-C4烷基与母体分子部分连接的C1-C3烷氧基。
本文所用的术语"C1-C4烷氧基"是指通过氧原子与母体分子部分连接的C1-C4烷基。
本文所用的术语"C1-C4烷氧基羰基"是指通过羰基与母体分子基团连接的C1-C4烷氧基。
本文所用的术语"C1-C3烷基"是指衍生自含有1-3个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文所用的术语"C1-C4烷基"是指衍生自含有1-4个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文所用的术语"C1-C6烷基"是指衍生自含有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文所用的术语"C1-C4烷基氨基"是指-NHR，其中R是C1-C4烷基。
本文所用的术语"酰氨基"是指-C(O)NH2。
本文所用的术语"氨基C1-C4烷基"是指通过C1-C4烷基与母体分子部分连接的氨基。
本文所用的术语"羰基"是指-C(O)-。
本文所用的术语"羧基"是指-CO2H。
本文所用的术语"羧基C1-C4烷基"是指通过C1-C4烷基与母体分子部分连接的羧基。
本文所用的术语"氰基"是指-CN。
本文所用的术语"C3-C6环烷基"是指具有三个或四个碳原子和零个杂原子的饱和单环烃环系。
本文所用的术语"二(C1-C4烷基)氨基"是指-NR2，其中每个R是C1-C4烷基。所述R基团可以相同或不同。
本文所用的术语"甲酰基"是指-C(O)H。
本文所用的术语"卤代"和"卤素"是指F、Cl、Br或I。
本文所用的术语"卤代C1-C4烷氧基"是指通过氧原子与母体分子部分连接的卤代C1-C4烷基。
本文所用的术语"卤代C1-C4烷基"是指被一个、两个或三个卤素原子取代的C1-C4烷基。
本文所用的术语"羟基"是指-OH。
本文所用的术语"羟基C1-C4烷基"是指通过C1-C4烷基与母体分子部分连接的羟基。
本文所用的术语"硝基"是指-NO2。
短语"药学上可接受的"在本文中用于指在合理医学判断的范畴内适于与人和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理益处/风险比相匹配的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
式(I)的化合物可形成也在本公开范畴内的盐。除非另外说明，否则提及本发明化合物应理解为包括提及一种或多种其盐。术语"盐"表示与无机酸和/或有机酸以及无机碱和/或有机碱形成的酸性盐和/或碱性盐。此外，术语"盐"可包括两性离子(内盐)，例如当式(I)的化合物含有碱性部分(诸如胺或吡啶或咪唑环)与酸性部分(诸如羧酸)时。药学上可接受的(即无毒的，生理学上可接受的)盐为优选，诸如例如可接受的金属和胺盐，其中阳离子不会明显促成所述盐的毒性或生物活性。然而，其它盐可用于例如在制备期间可采用的分离或纯化步骤，并因此涵盖在本公开的范畴内。所述式(I)的化合物的盐例如可通过使式(I)的化合物与一定量(诸如当量的量)的酸或碱在介质(诸如使盐沉淀的介质)中或在水性介质中反应，继而冻干来形成。
示例性酸加成盐包括乙酸盐(诸如用乙酸或三卤乙酸(例如三氟乙酸)形成的那些盐)、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(用盐酸形成)、氢溴酸盐(用溴化氢形成)、氢碘酸盐、马来酸盐(用马来酸形成)、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐(用甲磺酸形成)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐(pectinates)、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(诸如用硫酸形成的那些盐)、磺酸盐(诸如本文中提及的那些盐)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(诸如甲苯磺酸盐(tosylate))、十一烷酸盐等。
示例性碱性盐包括铵盐；碱金属盐，诸如钠盐、锂盐和钾盐；碱土金属盐，诸如钙盐和镁盐；钡盐、锌盐和铝盐；与有机碱(例如有机胺)形成的盐，所述有机碱如三烷基胺(诸如三乙胺)、普鲁卡因(procaine)、二苄胺、N-苄基-β-苯乙胺、1-二苯羟甲胺(1-ephenamine)、N,N'-二苄基乙二胺、脱氢枞胺、N-乙基哌啶、苄胺、二环己胺或类似的药学上可接受的胺，以及与氨基酸(诸如精氨酸、赖氨酸等)形成的盐。碱性含氮基团可用如下试剂季铵化，诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物，甲基、乙基、丙基和丁基溴化物以及甲基、乙基、丙基和丁基碘化物)、硫酸二烷基酯(例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯)、长链卤化物(例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物，癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基溴化物以及癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基碘化物)、芳烷基卤化物(例如苄基和苯乙基溴化物)等。优选的盐包括单盐酸盐、硫酸氢盐、甲磺酸盐、磷酸盐或硝酸盐。
前药的各种形式为本领域中熟知的且描述于以下中：
a) The Practice of Medicinal Chemistry, Camille G. Wermuth等人, Ch 31,(Academic Press, 1996)；
b) Design of Prodrugs, H. Bundgaard编辑, (Elsevier, 1985)；
c) A Textbook of Drug Design and Development, P. Krogsgaard-Larson和H.Bundgaard编辑 Ch 5, pgs 113 – 191 (Harwood Academic Publishers, 1991)；和
d) Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Bernard Testa和Joachim M.Mayer, (Wiley-VCH, 2003)。
此外，式(I)的化合物在其制备后可经分离和纯化以获得含有其量以重量计，等于或大于99%的式(I)的化合物("基本上纯")的组成，其随后如本文所述使用或配制。此类"基本上纯"的式(I)的化合物也作为本公开的部分涵盖在本文中。
"稳定的化合物"和"稳定的结构"旨在表明足够稳固，从而可以经受由反应混合物分离至可用纯度程度和配制为有效治疗剂的化合物。本公开旨在包括稳定的化合物。
"治疗有效量"旨在包括有效抑制PD-1/PD-L1蛋白/蛋白和/或CD80/PD-L1蛋白/蛋白相互作用或有效治疗或预防癌症或感染性疾病(诸如感染性休克、HIV或乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎)的本公开化合物单独的量、或要求保护的化合物的组合的量、或与其它活性成分组合的本公开化合物的量。
本文所用的"治疗(treating)"或"治疗(treatment)"涵盖治疗哺乳动物，尤其人类的疾病状态(disease-state)，且其包括：(a)预防哺乳动物出现所述疾病状态，尤其在此类哺乳动物易于患上所述疾病状态但尚未被诊断为患有所述疾病状态时；(b)抑制所述疾病状态，即遏制其发展；和/或(c)缓解所述疾病状态，即使得所述疾病状态消退。
本公开的化合物旨在包括本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括原子序数相同但质量数不同的那些原子。作为一般实例但非限制性地，氢的同位素包括氘(D)和氚(T)。碳的同位素包括13C和14C。本公开的同位素标记化合物一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本文所述方法的方法，使用适当的同位素标记试剂替代原先使用的未标记试剂来制备。例如，甲基(-CH3)也包括氘化甲基，诸如-CD3。
根据式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐可通过适合于待治疗的病况的任何方式给药，其可根据位点特异性治疗或待递送的式(I)的化合物的量的需要而定。如下类别的药物组合物也涵盖在本公开内，其包含式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐；和一种或多种无毒的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或辅助剂(在本文中统称为"载体"材料)和必要时其它活性成分。式(I)的化合物可通过任何适合的途径给药，优选为适于此类途径的药物组合物形式且剂量为对预期治疗有效的剂量。本公开的所述化合物和组合物可以以含有常规药学上可接受的载体、辅助剂和媒介物的剂量单位制剂例如经口服、经粘膜、经直肠或肠胃外(包括血管内、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内和胸骨内)给药。例如，所述药物载体可含有甘露糖醇或乳糖与微晶纤维素的混合物。所述混合物可含有其它组分，诸如润滑剂(例如硬脂酸镁)和崩解剂(诸如交联聚维酮(crospovidone))。载体混合物可填充至明胶胶囊中或压缩为片剂。所述药物组合物可例如以口服剂型或输注形式给药。
对于口服给药，所述药物组合物可呈例如片剂、胶囊、液体胶囊、悬浮液或液体形式。所述药物组合物优选以含有特定量活性成分的剂量单位形式制得。例如，所述药物组合物可以包含约0.1至1000 mg，优选约0.25至250 mg，且更优选约0.5至100 mg范围内的量的活性成分的片剂或胶囊提供。用于人类或其它哺乳动物的适合日剂量可根据患者的病况及其它因素而广泛变化，但可使用常规方法确定。
本文中涵盖的任何药物组合物均可例如经由任何可接受且适合的口服制剂经口服递送。示例性口服制剂包括(但不限于)例如片剂、糖锭剂、锭剂、水性和油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬和软胶囊、液体胶囊、糖浆和酏剂。旨在用于口服给药的药物组合物可根据本领域中已知的制备旨在用于口服给药的药物组合物的任何方法制备。为提供药学上适口的制剂，根据本公开的药物组合物可含有至少一种选自甜味剂、调味剂、着色剂、缓和剂、抗氧化剂和防腐剂的试剂。
片剂可例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或至少一种其药学上可接受的盐与至少一种适合于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合来制备。示例性赋形剂包括(但不限于)例如惰性稀释剂，诸如，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙和磷酸钠；造粒剂和崩解剂，诸如，例如微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉和海藻酸；粘合剂，诸如，例如淀粉、明胶、聚乙烯基-吡咯烷酮和阿拉伯胶；和润滑剂，诸如，例如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。此外，片剂可未被包衣或通过常规技术被包衣以掩盖口味使人不快的药物的不佳味道，或推迟活性成分在胃肠道中的崩解和吸收，从而使活性成分的作用维持更长的时间段。示例性水溶性掩味材料包括(但不限于)羟丙基-甲基纤维素和羟丙基-纤维素。示例性延时材料包括(但不限于)乙基纤维素和乙酸丁酸纤维素。
硬明胶胶囊可例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或至少一种其盐与至少一种惰性固体稀释剂(诸如，例如碳酸钙；磷酸钙；和高岭土)混合来制备。
软明胶胶囊可例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或至少一种其药学上可接受的盐与至少一种水溶性载体(诸如，例如聚乙二醇)和至少一种油性介质(诸如，例如花生油、液体石蜡和橄榄油)混合来制备。
可例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或至少一种其药学上可接受的盐与至少一种适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合来制备水性悬浮液。适用于制备水性悬浮液的示例性赋形剂包括(但不限于)例如助悬剂，诸如，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、海藻酸钠、海藻酸、聚乙烯基-吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂，诸如，例如天然存在的磷脂，例如卵磷脂；环氧烷与脂肪酸的缩合产物，诸如，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，诸如，例如十七亚乙基-氧基十六醇；环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，诸如，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；以及环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合产物，诸如，例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性悬浮液也可含有至少一种防腐剂，诸如，例如对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯；至少一种着色剂；至少一种调味剂；和/或至少一种甜味剂，包括(但不限于)例如蔗糖、糖精和阿斯巴甜。
油性悬浮液可例如通过使至少一种式(I)的化合物和/或至少一种其药学上可接受的盐悬浮于植物油(诸如，例如花生油；橄榄油；芝麻油；和椰子油)或矿物油(诸如，例如液体石蜡)中来制备。油性悬浮液也可含有至少一种增稠剂，诸如，例如蜂蜡；硬石蜡；和鲸蜡醇。为提供适口的油性悬浮液，可将至少一种上文已描述的甜味剂和/或至少一种调味剂添加至油性悬浮液中。油性悬浮液可进一步含有至少一种防腐剂，包括(但不限于)例如抗氧化剂，诸如，例如丁基化羟基茴香醚和α-生育酚。
可分散的粉末和颗粒可例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或至少一种其药学上可接受的盐与至少一种分散剂和/或湿润剂；至少一种助悬剂；和/或至少一种防腐剂混合来制备。适合的分散剂、湿润剂和助悬剂如上文已描述的。示例性防腐剂包括(但不限于)例如抗氧化剂，例如抗坏血酸。此外，可分散的粉末和颗粒也可含有至少一种赋形剂，包括(但不限于)例如甜味剂；调味剂；和着色剂。
至少一种式(I)的化合物和/或至少一种其药学上可接受的盐的乳剂可例如制备为水包油乳剂。包含式(I)的化合物的乳剂的油相可以已知方式由已知成分构成。所述油相可由例如(但不限于)以下提供：植物油，诸如，例如橄榄油和花生油；矿物油，诸如，例如液体石蜡；及其混合物。尽管所述相可仅包含乳化剂，但其也可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。适合的乳化剂包括(但不限于)例如天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯或偏酯，诸如，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；和偏酯与环氧乙烷的缩合产物，诸如，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。优选地，亲水性乳化剂与充当稳定剂的亲脂性乳化剂一起包括在内。还优选包括油和脂肪两者。总之，有或没有稳定剂的乳化剂组成所谓乳化蜡，且所述蜡连同所述油和脂肪组成所谓乳化软膏基质，其形成乳膏制剂的油性分散相。乳剂也可含有甜味剂、调味剂、防腐剂和/或抗氧化剂。适合用于本公开制剂中的乳化剂和乳剂稳定剂包括Tween 60、Span 80、鲸蜡硬脂醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯、月桂基硫酸钠、二硬脂酸甘油酯(单独或含蜡)或本领域中所熟知的其它物质。
式(I)的化合物和/或至少一种其药学上可接受的盐也可例如在静脉内、皮下和/或肌肉内经由任何药学上可接受且适合的可注射形式递送。示例性可注射形式包括(但不限于)例如包含可接受的媒介物和溶剂的无菌水溶液，所述媒介物和溶剂诸如，例如水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液；无菌水包油微乳液；和水性或油性悬浮液。
用于肠胃外给药的制剂可呈水性或非水性等渗无菌注射溶液或悬浮液形式。这些溶液和悬浮液可使用被提及用于口服给药的制剂中的一种或多种载体或稀释剂，或通过使用其它适合的分散剂或湿润剂和助悬剂，由无菌粉末或颗粒来制备。所述化合物可溶解于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其它辅助剂和给药模式在医药领域中深入且广泛地已知。活性成分也可作为具有适当的载体(包括盐水、葡萄糖或水)或具有环糊精(即Captisol)、共溶剂增溶(即丙二醇)或胶束增溶(即Tween 80)的组合物通过注射给药。
无菌可注射制剂也可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可采用的所述可接受的媒介物和溶剂有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的单-或二甘油酯。此外，诸如油酸的脂肪酸可用于制备可注射剂。
无菌可注射水包油微乳剂可例如通过以下来制备：1)使至少一种式(I)的化合物溶解于油相，诸如，例如大豆油与卵磷脂的混合物中；2)将含有式(I)的油相与水和甘油混合物组合；和3)加工所述组合以形成微乳剂。
无菌水性或油性悬浮液可根据本领域中已知的方法制备。例如，无菌水性溶液或悬浮液可用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(诸如，例如1,3-丁二醇)制备；和无菌油性悬浮液可用无菌无毒的可接受的溶剂或悬浮介质(诸如，例如无菌不挥发性油(例如合成单-或二甘油酯)；和脂肪酸(诸如，例如油酸))制备。
可用于本公开的药物组合物中的药学上可接受的载体、辅助剂和媒介物包括(但不限于)离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物递送系统(SEDDS)，诸如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，用于医药剂型的表面活性剂，诸如Tweens，聚乙氧基化蓖麻油，诸如CREMOPHOR表面活性剂(BASF)，或其它类似聚合物递送基质，血清蛋白，诸如人类血清白蛋白，缓冲物质，诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，诸如鱼精蛋白硫酸盐，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯基吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。环糊精(诸如α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精)或经化学改性的衍生物(诸如羟烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-环糊精)或其它溶解的衍生物也可有利地用于增强本文所描述的化学式的化合物的递送。
本公开的药物活性化合物可根据制药学常规方法进行处理以产生用于向包括人类及其它哺乳动物的患者给药的药剂。所述药物组合物可进行诸如灭菌的常规医药操作和/或可含有常规辅助剂，诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂等。片剂和丸剂可另外用肠溶包衣来制备。此类组合物也可包含辅助剂，诸如湿润剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
所给药的化合物的量和用本公开的化合物和/或组合物治疗疾病状况的给药方案取决于多种因素，所述因素包括对象的年龄、体重、性别、医学状况；疾病类型；疾病的严重性；给药途径和频率以及所采用的具体化合物。因此，所述给药方案可广泛变化，但可常规地使用标准方法确定。每kg体重约0.001至100 mg，优选每kg体重约0.0025至约50 mg且最优选每kg体重约0.005至10 mg的日剂量可以是适当的。日剂量可以每天一至四剂给药。其它给药方案包括每周一剂和每两天的周期一剂。
出于治疗目的，本公开的活性化合物通常与一种或多种适于所表明的给药途径的辅助剂组合。如果口服给药，则所述化合物可与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合且随后经压片或胶囊化以方便给药。此类胶囊或片剂可含有如活性化合物于羟丙基甲基纤维素中的分散体中可提供的控制释放制剂。
本公开的药物组合物包含至少一种式(I)的化合物和/或至少一种其药学上可接受的盐和任选的选自任何药学上可接受的载体、辅助剂和媒介物的其它试剂。本公开的替代性组合物包含本文所述的式(I)的化合物或其前药和药学上可接受的载体、辅助剂或媒介物。
本公开的化合物抑制PD-1/PD-L1蛋白/蛋白，从而阻断PD-L1。阻断PD-L1可增强哺乳动物(包括人类)中对癌细胞和感染性疾病的免疫应答。
在一个方面中，本公开涉及在体内使用式(I)的化合物或其盐治疗对象，从而抑制癌性肿瘤的生长。可单独使用式(I)的化合物或其盐以抑制癌性肿瘤的生长。或者，式(I)的化合物或其盐可与如下所述的其它免疫原性药剂或标准癌症治疗结合使用。
在一个实施方案中，本公开提供一种抑制对象中的肿瘤细胞生长的方法，其包含向对象给药治疗有效量的式(I)的化合物或其盐。
在一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者给药治疗有效量的式(I)的化合物或其盐。癌症的实例包括其生长可使用本公开化合物抑制的那些，包括通常对免疫疗法有应答的癌症。所治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，本公开包括其生长可使用本公开化合物抑制的难治性或复发性恶性肿瘤。
可使用本公开的方法治疗的其它癌症的实例包括骨癌；胰腺癌；皮肤癌；头颈癌；皮肤或眼内恶性黑素瘤；子宫癌；卵巢癌；直肠癌；肛门区癌；胃癌；睾丸癌；子宫癌；输卵管癌；子宫内膜癌；子宫颈癌；阴道癌；外阴癌；霍奇金病(Hodgkin's Disease)；非霍奇金淋巴瘤；食道癌；小肠癌；内分泌系统癌；甲状腺癌；甲状旁腺癌；肾上腺癌；软组织肉瘤；尿道癌；阴茎癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病；儿童实体肿瘤；淋巴细胞性淋巴瘤；膀胱癌；肾癌或输尿管癌；肾盂癌；中枢神经系统(CNS)肿瘤；原发性CNS淋巴瘤；肿瘤血管生成；脊髓轴肿瘤(spinalaxis tumor)；脑干神经胶质瘤；垂体腺瘤；卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)；表皮样癌；鳞状细胞癌；T细胞淋巴瘤；环境诱发癌，包括由石棉诱发的癌症；和所述癌症的组合。本公开也适用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人 (2005) Int. Immunol. 17:133-144)。
任选地，式(I)的化合物或其盐可与另一免疫原性剂组合，所述另一免疫原性剂诸如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和经编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He等人(2004) J. Immunol. 173:4919-28)。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。
在人类中，已经证明一些肿瘤具有免疫原性，诸如黑素瘤。预期通过利用PD-L1阻断提高T细胞激活的阈值，期望激活宿主中的肿瘤应答。
所述PD-L1阻断可与疫苗接种方案组合。已设计出针对肿瘤的许多实验性疫苗接种策略(参见Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCOEducational Book Spring: 60-62；Logothetis, C., 2000, ASCO Educational BookSpring: 300-302；Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428；Foon,K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738；也参见Restifo, N.和Sznol, M.,Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043，DeVita, V.等人(编辑), 1997, Cancer:Principles and Practice of Oncology. 第五版)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已证明这些细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已证明GM-CSF为用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效激活剂(Dranoff等人 (1993) Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43)。
对各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究已导致所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤中和出现肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要地，可证明许多这些抗原为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。PD-L1阻断可与许多在肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽结合使用以产生针对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白通常被免疫系统视为自身抗原且因此对其具耐受性。所述肿瘤抗原也可包括蛋白端粒酶，其是合成染色体端粒所需且在超过85%人类癌症中和仅有限数目的躯体组织中表达(Kim, N等人 (1994) Science 266: 2011-2013)。(可通过各种方法保护这些躯体组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原也可为由于改变蛋白序列或产生融合蛋白(在两个不相关序列(即费城染色体(Philadelphia chromosome)中的bcr-abl)之间)的躯体细胞突变而表达于癌细胞中的"新抗原"，或来自B细胞肿瘤的个体基因型。
其它肿瘤疫苗可包括来自人类癌症中所牵涉的病毒的蛋白，所述病毒诸如人乳头状瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV、HDV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可与PD-L1阻断结合使用的肿瘤特异性抗原的另一形式是从肿瘤组织自身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白片段且这些HSP高效地递送至抗原呈递细胞以引起肿瘤免疫力(Suot, R&Srivastava, P (1995) Science 269:1585-1588；Tamura,Y.等人(1997) Science 278:117-120)。
树突状细胞(DC)是可用于引发抗原特异性应答的有效抗原呈递细胞。DC可离体产生且载有各种蛋白和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle, F.等人(1998) NatureMedicine 4: 328-332)。DC也可通过基因方法转导以也表达这些肿瘤抗原。DC也已与肿瘤细胞直接融合用于达成免疫目的(Kugler, A.等人(2000) Nature Medicine 6:332-336)。作为接种疫苗的方法，DC免疫作用可与PD-L1阻断有效组合以激活更有效的抗肿瘤应答。
PD-L1阻断也可与标准癌症治疗组合。PD-L1阻断可与化学治疗方案有效组合。在这些情形下，可能减少所给药的化学治疗剂的剂量(Mokyr, M.等人(1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。此类组合的一个实例是本公开化合物与达卡巴嗪(dacarbazine)组合用于治疗黑素瘤。此类组合的另一个实例是本公开化合物与白细胞介素-2 (IL-2)组合用于治疗黑素瘤。支持所述PD-L1阻断与化学疗法组合使用的科学基本原理在于细胞死亡(所述细胞死亡作为大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用的结果)应使得抗原呈递路径中肿瘤抗原的含量增加。可通过细胞死亡而与PD-L1阻断产生协同作用的其它组合疗法为放射、手术和激素剥夺。这些方案中的每一种在宿主中产生肿瘤抗原源。血管生成抑制剂也可与PD-L1阻断组合。抑制血管生成引起肿瘤细胞死亡，其可将肿瘤抗原送至宿主抗原呈递路径中。
本公开的化合物也可与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性化合物组合使用(参加例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。可使用双特异性化合物靶向两个单独的抗原。例如，抗-Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)的双特异性抗体已用于使巨噬细胞靶向肿瘤位点。此靶向可更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂通过使用PD-L1阻断来增强。或者，可通过使用结合于肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标记物的双特异性化合物将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监督。许多这些机制可通过使肿瘤所表达且具免疫抑制性的蛋白失活来克服。这些尤其包括TGF-β (Kehrl, J.等人(1986) J. Exp. Med.163: 1037-1050)、IL-10 (Howard, M. & O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13:198-200)和Fas配体(Hahne, M.等人(1996) Science 274: 1363-1365)。结合于且阻断这些实体中的每一种的抑制剂可与本公开化合物组合使用以抵消免疫抑制剂的作用且有利于宿主的肿瘤免疫应答。
激活宿主免疫应答的化合物可与PD-L1阻断组合使用。这些包括树突状细胞表面上的激活DC功能和抗原呈递的分子。抗CD40化合物能够有效地取代辅助性T细胞活性(Ridge, J.等人(1998) Nature 393: 474-478)且可与PD-L1阻断结合使用(Ito, N.等人(2000) Immunobiology 201 (5) 527-40)。激活诸如CTLA-4 (例如美国专利号5,811,097)、OX-40 (Weinberg, A.等人 (2000) Immunol 164: 2160-2169)、4-1BB (Melero, I.等人(1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)和ICOS (Hutloff, A.等人(1999) Nature 397: 262-266)的T细胞共刺激分子的化合物也可提供增加的T细胞激活水平。
骨髓移植目前正用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主疾病是该治疗的后果，但可由移植物抗肿瘤应答获得治疗益处。PD-L1阻断可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
本公开的其它方法用于治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本公开的另一方面提供一种治疗对象的感染性疾病的方法，其包含向对象给药治疗有效量的式(I)的化合物或其盐。
类似于如上文所论述其对肿瘤的应用，式(I)的化合物或其盐可单独或作为辅助剂、与疫苗组合用于刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。该治疗方法可特别适用的病原体的实例包括当前无有效疫苗的病原体或常规疫苗不完全有效的病原体。其包括(但不限于) HIV、肝炎(甲型、乙型、丙型或丁型)、流感病毒、疱疹、贾第虫(Giardia)、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosa)。PD-L1阻断对于由在感染过程期间呈现改变的抗原的病原体(agent)(诸如HIV)建立的感染特别适用。这些新颖表位在给药时经识别为外源的，因此引起强烈T细胞应答，此T细胞应答不会被通过PD-1的负信号抑制。
引起可通过本公开方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲型、乙型、丙型或丁型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HHv-7、HHV-8、HSV-2、CMV和爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、cornovirus、呼吸道融合细胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒(arboviral encephalitis virus)。
引起可通过本公开方法治疗的感染的病原菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)和莱姆病(Lymes disease)细菌。
引起可通过本公开方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括念珠菌属(Candida) (白色念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌属(Aspergillus) (烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉目属(Genus Mucorales)(毛霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizophus))、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本公开方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴虫属(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫 (Giardialambia)、隐胞子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克鲁斯氏锥体虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、弓形虫(Toxoplasma gondi)和巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。
在所有上述方法中，PD-L1阻断可与免疫疗法的其它形式组合，所述免疫疗法的其它形式诸如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或提高肿瘤抗原的呈递的双特异性抗体疗法(参见例如Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak (1994) Structure 2:1121-1123)、疫苗或修饰基因表达的试剂。
本公开的化合物可引起且放大自身免疫应答。实际上，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱导抗肿瘤应答表明许多抗肿瘤应答涉及抗自身反应性(在上述van Elsas等人中抗-CTLA-4+GM-CSF-修饰的B 16黑素瘤中观测到的脱色素；经Trp-2疫苗接种的小鼠中的脱色素(Overwijk, W.等人(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987)；由TRAMP肿瘤细胞疫苗引起的自身免疫前列腺炎(Hurwitz, A. (2000) 上述)、在人类的临床试验中观测到的黑素瘤肽抗原疫苗接种和白斑症(vitilago)(Rosenberg, S A和White, D E(1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4)。
因此，可能考虑将抗-PD-L1阻断与各种自身蛋白结合使用从而设计高效产生针对这些自身蛋白的免疫应答用于疾病治疗的疫苗接种方案。例如，阿尔茨海默病涉及在脑中的淀粉状沉积物中A.β.肽的不当积聚；针对淀粉状蛋白的抗体应答能够清除这些淀粉状沉积物(Schenk等人, (1999) Nature 400: 173-177)。
其它自身蛋白也可用作靶标，诸如用于过敏和哮喘治疗的IgE和用于类风湿性关节炎治疗的TNFα。最后，对各种激素的抗体应答可通过使用式(I)的化合物或其盐诱导。针对生殖激素的中和抗体应答可用于避孕。针对特定肿瘤生长所需的激素及其它可溶性因子的中和抗体应答也可考虑为可能的疫苗接种靶标。
上文关于抗-PD-L1抗体的用途所述的类似方法可用于诱导治疗性自身免疫应答，以治疗具有其它自身抗原(诸如阿尔茨海默病中的淀粉状沉积物(包括A.β.)、细胞因子(诸如TNF α)和IgE)的不当积聚的患者。
本公开的化合物可通过共同给药式(I)的化合物或其盐与感兴趣的抗原(例如疫苗)而用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，在另一个方面中，本公开提供了一种提高对象中对抗原的免疫应答的方法，其包含向对象给药：(i)抗原；和(ii)式(I)的化合物或其盐，以提高对象对抗原的免疫应答。所述抗原可为例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括以上部分中所讨论的那些，诸如上文所讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)或者来自上文所述的病毒、细菌或其它病原体的抗原。
如先前所述，本公开的化合物可与一种或多种其它治疗剂(例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂)共同给药。本公开的化合物可在另一治疗剂之前、之后或同时给药，或可与其它已知疗法(例如抗癌疗法，例如放射)共同给药。此类治疗剂尤其包括本身仅在对患者具毒性或亚毒性的水平下才有效的抗肿瘤剂，诸如阿霉素(doxorubicin)(亚德里亚霉素(adriamycin))、顺铂(cisplatin)、硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达卡巴嗪(decarbazine)和环磷酰胺羟基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)。顺铂每四周以每剂100 mg静脉内给药一次，且亚德里亚霉素每21天以60-75 mg/mL剂量静脉内给药一次。共同给药式(I)的化合物或其盐与化学治疗剂提供两种经由不同机制起作用的抗癌剂，其对人类肿瘤细胞产生细胞毒性作用。此类共同给药可解决因耐药性出现或肿瘤细胞的抗原性变化而使其不与抗体起反应所引起的问题。
包含式(I)的化合物或其盐和使用说明书的试剂盒也属于本公开的范畴。所述试剂盒可进一步含有至少一种其它试剂。试剂盒通常包括说明试剂盒内含物的预期用途的标签。所述术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起供应或以其它方式伴随试剂盒的任何书面或记录材料。
以上其它治疗剂在与本公开化合物组合使用时可以例如Physicians' DeskReference (PDR)中所示或由本领域技术人员以其它方式确定的那些量使用。在本公开的方法中，此类其它治疗剂可在本发明化合物给药之前、与其同时或在其之后给药。
在一个实施方案中，所述式(I)的化合物抑制PD-1/PD-L1相互作用，其通过PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定测量的IC50值为20 μM或更低，例如0.48至20 μM。
实施例
在以下实施例中进一步限定本发明。应该理解的是，实施例仅以说明的方式给出。由以上讨论和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，能够作出各种改变和改进，从而使本发明适应于各种用途和条件。结果，本发明不受下文所述的说明性实施例的限制，而是由所附权利要求限定。
如本说明书中所用，下列术语具有所示含义：THF表示四氢呋喃，EtOAc表示乙酸乙酯，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，DCE表示1,2-二氯乙烷，DCM表示二氯甲烷，rt或RT或Rt表示室温或保留时间(上下文将指示)，EtOH表示乙醇，min表示分钟，h或hr表示小时，DMSO表示二甲基亚砜。
中间体：5-氯-2-羟基-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯甲醛
在0℃下，将偶氮二甲酸二异丙酯(1.793g，8.87mmol)的THF(50mL)溶液逐滴加入到(2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)甲醇(2g，8.06mmol)、5-氯-2,4-二羟基苯甲醛(1.391g，8.06mmol)和三苯基膦(2.326g，8.87mmol)的THF(50mL)溶液中。将得到的黄色溶液温热至室温并搅拌过夜。除去溶剂，并通过硅胶柱色谱法(Biotage40m，0至20％EtOAc/己烷)纯化残余物，得到1.95g(57.1％)的5-氯-2-羟基-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯甲醛，为白色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LC/Micromass Platform LC(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Phenomenex Luna 3μm C18, 2×50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B (B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt(保留时间)=2.147分钟，m/z 389.2(M+H)。1H NMR(400MHz，氯仿-d) δ ppm 11.45 (s, 1H), 9.72 (s, 1H), 7.83 - 7.79 (m, 1H), 7.57- 7.53 (m, 2H), 7.28 - 7.23 (m, 1H), 6.62 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 2.59 (s,3H), 1.40 - 1.37 (m, 12H)。
中间体：5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
将5-氯-2-羟基-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯甲醛(1.5g，3.73mmol)、5-(氯甲基)烟腈(0.739g，4.84mmol)和碳酸铯(1.760g，5.40mmol)的DMF(15mL)悬浮液在室温下搅拌过夜。除去溶剂，将残余物在二氯甲烷和水之间分配。水相使用二氯甲烷萃取一次。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，真空除去溶剂。通过硅胶柱色谱法(Biotage 40m，0至50％EtOAc/己烷)纯化得到的残余物，得到1.48g(77％)的5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈，为白色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LC/Micromass Platform LC(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Phenomenex Luna 3μm C18, 2×50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=2.147分钟，m/z 505.3(M+H)。1H NMR(500MHz，氯仿-d) δ ppm 10.29 (s, 1H), 8.93 (d, J=1.6 Hz, 1H), 8.91 (d, J=1.7 Hz, 1H), 8.08(s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.81 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.48 (d, J=7.4 Hz, 1H), 7.25(t, J=7.5 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 5.25 (s, 2H), 5.19 (s, 2H), 2.61 (s, 3H),1.40 (s, 12H)。
中间体：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
向小瓶中加入乙酸(55μL，0.964mmol)、DCE(1,2-二氯乙烷，2.0mL)、乙醇(6.0mL)、THF(2.0mL)、20mg烘箱干燥的研磨的4Å分子筛、(S)-哌啶-2-甲酸(124mg，0.964mmol)、5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基)-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈(250mg，0.482mmol)和氰基硼氢化钠(60.6mg，0.964mmol)。盖上小瓶，将混合物在室温下摇动过夜。除去挥发物，将所得混合物用60mL DCM(二氯甲烷)稀释，用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到301.0mg的粗品(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸。
为了纯化，将粗物质置于最少量的乙腈中并加载到Isco 100g C18金柱上，并使用Biotage Horizon使用乙腈/水/10mM乙酸铵纯化，其中溶剂A是5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵且溶剂B是5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为10-100％B。收集在55-60％B洗脱的产物。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.185分钟，m/z 632.0(M+H)。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6 ) δ9.00 (m, 2H), 8.44 (m, 1H), 7.63 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.54 (d, J=6.8 Hz, 1H),7.46 - 7.37 (m, 1H), 7.20 (m, 1H), 7.08 (m, 1H), 5.32 (br. s., 2H), 5.19 (m,2H), 3.75 (d, J=13.7 Hz, 1H), 3.57 (d, J=13.7 Hz, 1H), 3.09 (m, 1H), 2.88 (m,1H), 2.53 (s, 3H), 2.24 (m, 1H), 1.83 - 1.67 (m, 2H), 1.48 (m, 3H), 1.36 (m,1H), 1.32 (m, 12H)。
中间体：5-溴-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
在密封管中向2-氨基-4-溴苯酚(200mg，1.064mmol)和1-甲基哌啶-4-甲酸(152mg，1.064mmol)中加入多聚磷酸(5g)。将容器密封，将混合物在190℃下加热3.5小时。冷却反应混合物。在0℃向混合物中逐滴加入6mL水，然后加入10M NaOH直至pH达到~8。向浓稠的紫色混合物中加入30mL乙酸乙酯。将产物通过硅藻土过滤，萃取，用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到244.8mg(74％收率)的5-溴-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑，为棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7mm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt(保留时间)=1.340分钟，m/z 295.05, 297.00(M+H)，95％纯度。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.95 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.68 (d, J=8.6 Hz,1H), 7.53 (dd, J=8.6, 1.9 Hz, 1H), 3.02 - 2.93 (m, 1H), 2.79 (m, 2H), 2.19(s, 3H), 2.10 - 2.01 (m, 4H), 1.87 - 1.77 (m, 2H)。
实施例1001：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
向小密封管中加入(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸(40mg，0.063mmol)、5-溴-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(18.68mg，0.063mmol)、THF(3mL)、水(1mL)、磷酸三钾(26.9mg，0.127mmol)，最后是第二代XPhos预催化剂(2.490mg，3.16μmol)。将容器密封，将混合物脱气/用氮气冲洗，然后在70℃下加热过夜。使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μmC18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为15-55％B经20分钟，保持5分钟，流速20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为14.8mg(31％收率)，并且通过LCMS分析估计的其纯度为96％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.550分钟；ESI-MS(+)m/z=720.0(M+H)
分析条件2：保留时间=1.394分钟；ESI-MS(+)m/z=720.1(M+H)
1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.98 (s, 2H), 8.40 (s, 1H), 7.71 (d, J=8.5 Hz,1H), 7.59 (s, 1H), 7.51 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.33 - 7.22 (m, 3H),7.09 (s, 1H), 5.32 (m, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.74 (d, J=13.7 Hz, 1H), 3.58 (d, J=13.7 Hz, 1H), 3.14 (d, J=6.1 Hz, 1H), 2.99 (m, 1H), 2.89 (m, 1H), 2.82 (m,2H), 2.24 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.13 - 2.06 (m, 4H), 1.94 - 1.86 (m, 3H),1.77 (m, 2H), 1.49 (m, 3H), 1.41 - 1.33 (m, 1H).
以类似方式合成以下中间体和实施例。
中间体：6-溴-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
得到144.8mg(33％收率)的6-溴-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑，为棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters AquityBEH 1.7mm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.005分钟，m/z 295.10, 297.10 (M+H)，75％纯度。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.66 (d, J=1.7 Hz, 1H), 7.55 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.44 (dd, J=8.5, 1.7 Hz, 1H), 3.02 - 2.85 (m, 3H), 2.34 (s, 3H), 2.24 - 2.14 (m, 4H),2.11 - 1.97 (m, 2H)。
实施例1002：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-6-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为30-70％B经25分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。使用以下条件通过制备型LC/MS进一步纯化化合物：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为12-52％B经22分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为11.7mg(17％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为94％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.432分钟；ESI-MS(+)m/z=720.1(M+H)
分析条件2：保留时间=1.462分钟；ESI-MS(+)m/z=720.0(M+H)
1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.97 (d, J=1.8 Hz, 2H), 8.40 (s, 1H), 7.73 (d,J=7.9 Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.50 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.33 -7.21 (m, 3H), 7.08 (s, 1H), 5.32 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.77 (d, J=13.7 Hz,1H), 3.60 (d, J=13.7 Hz, 1H), 3.17 - 3.09 (m, 2H), 3.05 - 2.95 (m, 1H), 2.92- 2.86 (m, 1H), 2.81 (m, 2H), 2.28 (m, 1H), 2.24 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.13- 2.03 (m, 4H), 1.90 (m, 1H), 1.77 (m, 2H), 1.49 (m, 3H), 1.37 (m, 1H)。
中间体:(外消旋)-5-溴-2-(1-甲基哌啶-3-基)苯并[d]噁唑
得到289.4mg(55％收率)的(外消旋)-5-溴-2-(1-甲基哌啶-3-基)苯并[d]噁唑，为红色油状物。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7mm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.032分钟，m/z 295.10, 297.10 (M+H)，70％纯度。1HNMR (500MHz, CDCl3) δ 7.81 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.42 (dd, J=1.9, 8.7 Hz, 1H),7.36 (d, J=8.7 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.82 (m, 1H), 2.35 (s, 3H), 2.25 - 2.17(m, 1H), 2.07 (m, 2H), 1.90 - 1.82 (m, 1H), 1.79 - 1.63 (m, 3H)。
实施例1003：(2S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为20-60％B经20分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为14.3mg(21％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为97.0％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.636分钟；ESI-MS(+)m/z=720.0(M+H)
分析条件2：保留时间=1.500分钟；ESI-MS(+)m/z=720.0(M+H)
1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.98 (s, 2H), 8.40 (s, 1H), 7.72 (d, J=8.2 Hz,1H), 7.58 (s, 1H), 7.51 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.33 - 7.23 (m, 3H),7.09 (s, 1H), 5.33 (d, J=2.7 Hz, 2H), 5.27 (s, 2H), 3.77 (d, J=13.7 Hz, 1H),3.60 (d, J=13.7 Hz, 1H), 3.17 - 3.11 (m, 2H), 3.06 (m, 1H), 2.93 - 2.86 (m,1H), 2.67 (m, 1H), 2.37 (t, J=10.4 Hz, 1H), 2.27 (m, 1H), 2.24 (br. s., 6H),2.14 - 2.01 (m, 2H), 1.78 (m, 3H), 1.69 - 1.59 (m, 2H), 1.49 (m, 3H), 1.38(m, 1H)。
中间体：5-溴-2-(哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
得到699.7mg(70％收率)的5-溴-2-(哌啶-4-基)苯并[d]噁唑，为棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH1.7mm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.027分钟，m/z 281.10, 283.10 (M+H)，90％纯度。1H NMR (500MHz,DMSO-d 6 ) δ 7.95 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.68 (d, J=8.7 Hz, 1H), 7.53 (dd, J=8.7,1.9 Hz, 1H), 3.09 (s, 1H), 2.99 (dt, J=12.4, 3.6 Hz, 2H), 2.60 (td, J=11.9,2.5 Hz, 2H), 1.99 (dd, J=12.7, 2.6 Hz, 2H), 1.75 - 1.61 (m, 2H)。
实施例1004：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为15-55％B经20分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为11.5mg(20％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为97.1％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.348分钟；ESI-MS(+)m/z=706.1(M+H)
分析条件2：保留时间=1.494分钟；ESI-MS(+)m/z=706.0(M+H)
1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.99 (m, 2H), 8.46 (s, 1H), 7.73 (d, J=8.2 Hz,1H), 7.60 (d, J=1.2 Hz, 1H), 7.50 (d, J=7.0 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.33 -7.21 (m, 3H), 7.10 (s, 1H), 5.33 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.84 (d, J=13.4 Hz,1H), 3.76 - 3.72 (m, 1H), 3.29 - 3.21 (m, 1H), 3.19 - 3.11 (m, 2H), 3.07 -3.00 (m, 1H), 2.94 - 2.85 (m, 1H), 2.81 (m, 2H), 2.22 (m, 4H), 2.13 (m, 2H),1.87 - 1.75 (m, 3H), 1.72 - 1.64 (m, 1H), 1.47 (m, 3H), 1.37 - 1.26 (m, 1H)。
中间体：5-溴-2-(1-环丙基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
得到283.4mg(46％收率)的5-溴-2-(1-环丙基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑，为棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7mm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.049分钟，m/z 321.15, 323.10(M+H)，70％纯度。1H NMR(500MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.95 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.68 (d, J=8.6 Hz 1H), 7.53 (dd,J=8.6, 1.9 Hz, 1H), 3.08 - 2.93 (m, 3H), 2.34 (td, J=11.5, 2.4 Hz, 2H), 2.11- 2.04 (m, 2H), 1.80 - 1.59 (m, 3H), 0.47 - 0.38 (m, 2H), 0.35 - 0.28 (m,2H)。
实施例1005：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(1-环丙基哌啶-4-基)苯并[d]]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型HPLC纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 30x100mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，复杂梯度为30-50％B经25分钟，在50％B保持10分钟，然后50-100％B经10分钟，流速为30mL/分钟。蒸发含有所需产物的级分。产物的产量为21.5mg(18％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为99％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.83分钟；纯度99％。
分析条件2：保留时间=6.09分钟；纯度99％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.129分钟，m/z 746.20和748.20(M+H)。
1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 8.96 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.40 (s, 1H),7.67 (m, 2H), 7.57 (s, 1H), 7.54 - 7.46 (m, 1H), 7.32 (m, 3H), 7.06 (s, 1H),5.39 (s, 2H), 5.34 (s, 2H), 4.51 - 4.40 (m, 1H), 4.40 - 4.23 (m, 1H), 3.59 -3.45 (m, 1H), 3.28 - 3.10 (m, 3H), 3.03 - 2.85 (m, 1H), 2.64 - 2.44 (m, 2H),2.28 (m, 6H), 1.98 (m, 2H), 1.92 - 1.76 (m, 4H), 1.76 - 1.62 (m, 1H), 1.62 -1.44 (m, 1H), 1.39 - 1.23 (m, 1H), 0.51 (m, 4H)。
中间体：2-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-5-溴苯并[d]噁唑
得到110.7mg的2-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-5-溴苯并[d]噁唑(38％收率)，为棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.140分钟，m/z 307.10和309.10 (M+H)，100％纯度。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.96 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.69 (d, J=8.7 Hz, 1H),7.54 (dd, J=8.7, 1.9 Hz, 1H), 3.96 (m, 2H), 3.55 (m, 1H), 2.20 - 2.04 (m,4H), 2.02 - 1.90 (m, 4H)。
实施例1006：(2S)-1-(4-((3-(2-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型HPLC纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 30x100mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为30-100％B经25分钟，保持10分钟，流速为30mL/分钟。蒸发含有所需产物的级分。产物的产量为24mg(21％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为99％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.11分钟；纯度98％。
分析条件2：保留时间=6.01分钟；纯度98％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.165分钟，m/z 732.20和734.20(M+H)。
1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 8.96 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.93 (d, J=2.0 Hz,1H), 8.42 - 8.37 (m, 1H), 7.67 (m, 2H), 7.57 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.49 (dd, J=6.8, 1.9 Hz, 1H), 7.34 (dd, J=8.4, 1.7 Hz, 1H), 7.32 - 7.24 (m, 2H), 7.05 (s,1H), 5.39 (s, 2H), 5.33 (s, 2H), 4.44 (d, J=13.1 Hz, 1H), 4.31 (d, J=13.1 Hz,1H), 4.19 (m, 2H), 3.77 - 3.63 (m, 1H), 3.55 - 3.44 (m, 1H), 2.91 (m, 1H),2.42 - 2.29 (m, 6H), 2.27 (s, 3H), 2.25 - 2.19 (m, 3H), 1.91 - 1.74 (m, 3H),1.74 - 1.63 (m, 1H), 1.60 - 1.48 (m, 1H), 1.40 - 1.27 (m, 1H)。
中间体：5-溴-2-(吡啶-4-基)苯并[d]噁唑
得到235mg 5-溴-2-(吡啶-4-基)苯并[d]噁唑(42％收率)，为粉红色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7μmC18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.137分钟，m/z 275.05,277.05(M+H)，65％纯度。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ8.88 (m, 2H), 8.16 (d, J=1.9 Hz, 1H), 8.11 (m, 2H), 7.87 (d, J=8.7 Hz, 1H),7.69 (dd, J=8.7, 1.9 Hz, 1H)。
实施例1007：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(吡啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型HPLC纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 30x100mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为10-100％B经20分钟，保持10分钟，流速为30mL/分钟。蒸发含有所需产物的级分。产物的产量为18mg(31％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为95％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度：
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.27分钟；纯度95％。
分析条件2：保留时间=8.18分钟；纯度95％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.400分钟，m/z 700.20(M+H)。
1H NMR (500MHz, CD3OD) δ8.94 (d, J=1.9 Hz, 1H), 8.91 (d, J=1.9 Hz,1H), 8.80 (m, 2H), 8.38 (t, J=2.0 Hz, 1H), 8.22 (m, 2H), 7.88 - 7.76 (m, 1H),7.73 - 7.66 (m, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.48 (m, 1H), 7.46 - 7.37 (m, 1H), 7.29(m, 2H), 7.04 (s, 1H), 5.37 (s, 2H), 5.32 (s, 2H), 4.44 (d, J=13.1 Hz, 1H),4.30 (d, J=13.1 Hz, 1H), 3.50 (d, J=7.7 Hz, 1H), 3.33 (m, 1H), 2.98 - 2.87(m, 1H), 2.29 (s, 3H), 2.25 - 2.16 (m, 1H), 1.90 - 1.73 (m, 3H), 1.68 (m,1H), 1.52 (m, 1H)。
中间体：5-溴-2-(1-甲基吡咯烷-3-基)苯并[d]噁唑
得到171mg的5-溴-2-(1-甲基吡咯烷-3-基)苯并[d]噁唑(40％收率)，为红色油状固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.092分钟，m/z 281.15和283.15(M+H)，70％纯度。1H NMR(500MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.93 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.69 - 7.65 (d, J=8.6 Hz,1H),7.52 (dd, J=8.6, 2.0 Hz, 1H), 3.71 (m, 1H), 2.89 (m, 1H), 2.81 (m, 1H), 2.58(m, 2H), 2.32 - 2.17 (m, 5H)。
实施例1008：(2S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基吡咯烷-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为20-60％B经25分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。使用以下条件通过制备型LC/MS进一步纯化该物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为25-65％B经15分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为21.6mg(35％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为91％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.319分钟；ESI-MS(+)m/z=706.1(M+H)
分析条件2：保留时间=1.372分钟；ESI-MS(+)m/z=706.1(M+H)
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.89 (m, 2H), 8.35 (s, 1H), 7.70 (d, J=8.5 Hz,1H), 7.53 (s, 2H), 7.39 (d, J=6.7 Hz, 1H), 7.32 - 7.17 (m, 3H), 6.99 (s, 1H),5.34 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 3.98 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.77 (m, 1H), 3.51(m, 1H), 2.98 (m, 1H), 2.84 (m, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.47 (m, 2H), 2.41 (s,3H), 2.28 (m, 1H), 2.23 (m, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.01 (m, 2H), 1.60 (m, 3H),1.38 (m, 1H)。
中间体：5-溴-7-甲基-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
得到196mg的5-溴-7-甲基-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(43％收率)，为橙色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.167分钟，m/z 309.15, 311.11 (M+H)，85％纯度。1H NMR(500MHz, CD3OD) δ 7.59 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.32 (d, J=1.4 Hz, 1H), 3.10 - 2.94(m, 3H), 2.48 (s, 3H), 2.35 (s, 3H), 2.29 (t, J=11.1 Hz, 2H), 2.24 - 2.15 (m,2H), 2.06 - 1.93 (m, 2H)。
实施例1009：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(7-甲基-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用Shimadzu制备型HPLC，使用Waters XBridge 5μm C18 30x100mm柱，使用乙腈/水/乙酸铵纯化粗物质，其中溶剂A是5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B是5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为10-100％B经20分钟，保持10分钟，流速为30 mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为38mg(62％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为94％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.57分钟；纯度94％。
分析条件2：保留时间=7.64分钟；纯度94％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.244分钟，m/z 734.25和735.25(M+H)。
1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 8.94 (d, J=1.9 Hz, 1H), 8.92 (d, J=1.9 Hz,1H), 8.37 (t, J=1.9 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.47 (dd, J=6.9, 2.1 Hz, 1H), 7.35(d, J=0.8 Hz, 1H), 7.31 - 7.22 (m, 2H), 7.11 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 5.37 (s,2H), 5.30 (s, 2H), 4.42 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.31 (m, 4H),2.97 - 2.78 (s, 3H), 2.65 (m, 3H), 2.56 (s, 3H), 2.46 - 2.34 (m, 2H), 2.31 -2.16 (m, 5H), 1.92 - 1.75 (m, 4H), 1.70 (m, 1H), 1.52 (m, 1H)。
中间体：5-溴-4-甲基-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
得到197.9mg的5-溴-4-甲基-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(45％收率)，为红色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.105分钟，m/z 309.10和311.10(M+H)，70％纯度。 1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.45 (d, J=8.7 Hz, 1H), 7.20 (d, J=8.7 Hz, 1H), 2.99 - 2.90(m, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 2.20 - 1.99 (m, 6H)。
实施例1010：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4-甲基-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用Shimadzu制备型HPLC，使用Waters XBridge 5u C18 30x100mm柱，使用乙腈/水/乙酸铵纯化粗物质，其中溶剂A是5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B是5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为10-100％B经20分钟，保持10分钟，流速为30 mL/分钟。使用以下条件通过制备型LC/MS再次纯化产物：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为15-100％B经15分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为17mg(29％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为99％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.45分钟；纯度99％。
分析条件2：保留时间=7.39分钟；纯度99％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.149分钟，m/z 734.25(M+H)，99％纯度。
1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 8.88 (m, 1H), 8.82 (m, 1H), 8.31 (m, 1H),7.55 (s, 1H), 7.40 (m, 1H), 7.37 (m, 1H), 7.18 (m, 1H), 7.08 - 6.91 (m, 3H),5.28 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 4.34 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 3.40 (m, 1H), 3.24(m, 1H), 3.18 (m, 1H), 2.85 - 2.67 (m, 3H), 2.56 (m, 4H), 2.32 - 2.22 (m,2H), 2.20 - 2.07 (m, 6H), 1.99 (s, 3H), 1.82 (m, 2H), 1.80 - 1.63 (m, 2H),1.63 - 1.54 (m, 1H), 1.47 - 1.35 (m, 1H)。
中间体：5-溴-2-(4-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
得到243.2mg的5-溴-2-(4-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(56％收率)，为棕褐色油状固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.119分钟，m/z 295.10和297.10(M+H)，90％纯度。1H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ 7.97 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.69 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.53 (dd,J=8.5, 1.4 Hz, 1H), 2.83 (m, 2H), 2.58 (m, 2H), 2.19 (m, 2H), 1.60 (m, 2H),1.36 (s, 3H)。
实施例1011：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为15-100％B经15分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为6.4mg(15％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为98％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经20分钟，在100％B保持5分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Xbridge 3.5μm Phenyl，3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经20分钟，在100％B保持5分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=7.40分钟，纯度98％。
分析条件2：保留时间=8.17分钟，纯度98％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.152分钟，m/z 720.20和722.25(M+H)，98％纯度。1H NMR(500MHz, CD3OD) δ 8.93 (d, J=1.9 Hz, 1H), 8.96 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.39 (t, J=1.9 Hz, 1H), 7.70 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.61 (d, J=1.1 Hz, 1H),7.49 (dd, J=6.9, 2.1 Hz, 1H), 7.36 (dd, J=8.4, 1.7 Hz, 1H), 7.32 - 7.25 (m,2H), 7.05 (s, 1H), 5.39 (s, 2H), 5.34 (s, 2H), 4.44 (d, J=13.1 Hz, 1H), 4.31(d, J=13.1 Hz, 1H), 3.50 (dd, J=10.6, 3.5 Hz, 1H), 3.42 - 3.35 (m, 2H), 3.32- 3.12 (m, 2H), 3.01 - 2.85 (m, 1H), 2.65 (m, 2H), 2.29 (s, 3H), 2.26 - 2.16(m, 1H), 2.03 (m, 2H), 1.96 - 1.91 (m, 1H), 1.90 - 1.68 (m, 4H), 1.59 - 1.45(m, 4H)。
中间体：4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)-N,N-二乙基环己胺
得到407.8mg的4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)-N,N-二乙基环己胺(74％收率)，为红色油状固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.182分钟，m/z 351.15和353.15(M+H)，85％纯度。 1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.80 (m, 1H), 7.42 (m, 1H), 7.35 (m, 1H), 3.08 - 2.84 (m,6H), 2.45 - 2.32 (m, 2H), 2.25 (m, 2H), 1.96 - 1.60 (m, 4H), 1.30 (m, 6H)。
实施例1012：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(4-(二乙基氨基)环己基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用Shimadzu制备型HPLC，使用Waters XBridge 5μm C18 OBD 30 x 100mm柱，使用乙腈/水/10mM乙酸铵纯化粗物质，其中溶剂A是5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B是5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为5-100％B经20分钟，保持10分钟，流速为30 mL/分钟。使用以下条件通过制备型LC/MS再次纯化产物：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为10-50％B经30分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。产物的产量为12.5mg(20％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为98％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经20分钟，在100％B保持5分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Xbridge 3.5μm Phenyl，3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经20分钟，在100％B保持5分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=8.78分钟，纯度98％。
分析条件2：保留时间=10.09分钟，纯度98％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.092分钟，m/z 776.30(M+H)，100％纯度。
1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 8.96 (d, J=1.9 Hz, 1H), 8.93 (d, J=1.9 Hz,1H), 8.40 (t, J=1.9 Hz, 1H), 7.68 - 7.65 (m, 2H), 7.57 (m, 1H), 7.49 (dd, J=6.4, 2.4 Hz, 1H), 7.34 (dd, J=8.4, 1.6 Hz, 1H), 7.30 - 7.26 (m, 2H), 7.06 (s,1H), 5.39 (s, 2H), 5.34 (s, 2H), 4.45 (d, J=12.9 Hz, 1H), 4.32 (d, J=12.9 Hz,1H), 3.54 - 3.45 (m, 2H), 3.36 (m, 1H), 3.32 - 3.27 (m, 3H), 3.22 (m, 1H),3.13 (m, 1H), 2.97 - 2.89 (m, 1H), 2.49 (m, 2H), 2.28 (m, 6H), 1.92 - 1.77(m, 7H), 1.70 (m, 1H), 1.55 (m, 1H), 1.40 (t, J=7.3 Hz, 6H)。
中间体：5-溴-2-(1-异丙基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
得到264mg的5-溴-2-(1-异丙基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(76％收率)，为粉红色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters AquityBEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=0.972分钟，m/z 323.15和325.15(M+H)，99％纯度。1H NMR (500MHz,CD3OD) δ 7.82 (dd, J=1.7, 0.5 Hz, 1H), 7.53 (d, J=0.5 Hz, 1H), 7.52 (d, J=1.7Hz, 1H), 3.12 - 3.00 (m, 3H), 2.82 (m, 1H), 2.45 (td, J=11.7, 2.4 Hz, 2H),2.27 - 2.17 (m, 2H), 2.06 - 1.94 (m, 2H), 1.18 - 1.09 (m, 6H)。
实施例1013：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(1-异丙基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型HPLC纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 30x100mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为0-75％B经25分钟，保持10分钟，流速为30mL/分钟。蒸发含有所需产物的级分。产物的产量为15.2mg(25％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为97％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.77分钟；纯度97％。
分析条件2：保留时间=6.35分钟；纯度99％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=0.890分钟，m/z 749.10(M+H)。
1H NMR (500MHz, C D3OD) δ 8.96 (d, J=1.9 Hz, 1H), 8.92 (d, J=1.9 Hz,1H), 8.39 (s, 1H), 7.66 (m, 2H), 7.54 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.48 (dd, J=6.9, 1.9Hz, 1H), 7.33 (dd, J=8.4, 1.6 Hz, 1H), 7.27 (m, 2H), 7.04 (s, 1H), 5.38 (s,2H), 5.31 (s, 2H), 4.46 (d, J=13.1 Hz, 1H), 4.31 (d, J=13.1 Hz, 1H), 3.56 -3.35 (m, 6H), 3.14 (t, J=11.3 Hz, 2H), 2.92 (td, J=12.0, 3.2 Hz, 1H), 2.48(dd, J=14.2, 3.0 Hz, 2H), 2.35 - 2.18 (m, 6H), 1.92 - 1.75 (m, 3H), 1.70 (m,1H), 1.59 - 1.48 (m, 1H), 1.44 - 1.28 (m, 6H)。
中间体：5-溴-2-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯并[d]噁唑
向2-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-5-溴苯并[d]噁唑(78.2mg，0.255mmol)在DCE(1,2-二氯乙烷，3mL)与三乙胺(0.106mL，0.764mmol)中的溶液中加入2.5当量的37％的甲醛水溶液(0.047mL，0.636mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。然后向反应混合物中加入纯净的三乙酰氧基硼氢化钠(216mg，1.018mmol)并将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物进一步用10mL的DCM(二氯甲烷)稀释，用2mL的 1.5M 磷酸钾水溶液、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，在氮气下蒸发，得到96mg红色油状物。将粗产物置于10mL甲醇中并推过Biotage5g SCX-2离子交换筒。将该筒用3个柱体积(30mL)的甲醇冲洗，碱性产物用30mL的2M氨/甲醇洗脱。得到49.6mg的5-溴-2-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯并[d]噁唑(收率60％)，为红棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=0.925分钟，m/z 321.15和323.15(M+H)，99％纯度。1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.79 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.40 (dd, J=8.5, 1.9 Hz,1H), 7.33 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.34 - 3.24 (m, 3H), 2.36 (s, 3H), 2.22 - 2.10(m, 4H), 1.93 - 1.84 (m, 2H), 1.74 - 1.66 (m, 2H)。
实施例1014：(2S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用Shimadzu制备型HPLC，使用Xbridge 5μm 30x 100mm C18柱，使用乙腈/水/乙酸铵纯化粗物质，其中溶剂A是5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B是5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为30-100％B经25分钟，保持10分钟，流速为30 mL/分钟。蒸发含有所需产物的级分。产物的产量为46.5mg(38％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为98％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.12分钟；纯度99％。
分析条件2：保留时间=6.15分钟；纯度98％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.159分钟，m/z 746.20和748.15(M+H)。
1H NMR (400MHz, CD3OD) δ 8.96 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.38 (s, 1H),7.71 - 7.62 (m, 2H), 7.54 (s, 1H), 7.49 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.33 (dd, J=8.3,1.7 Hz, 1H), 7.31 - 7.24 (m, 2H), 7.04 (s, 1H), 5.38 (s, 2H), 5.32 (s, 2H),4.45 (d, J=13.2 Hz, 1H), 4.31 (d, J=13.2 Hz, 1H), 3.96 (br. s., 2H), 3.73 -3.62 (m, 1H), 3.55 - 3.46 (m, 1H), 2.99 - 2.87 (m, 1H), 2.79 (s, 3H), 2.49 -2.34 (m, 6H), 2.27 (s, 3H), 2.19 (d, J=8.6 Hz, 3H), 1.80 (m, 3H), 1.73 - 1.64(m, 1H), 1.61 - 1.46 (m, 1H), 1.31 (m, 1H)。
中间体：3-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)双环[1.1.1]戊-1-胺
得到54mg的3-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)双环[1.1.1]戊-1-胺(43％收率)，为棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=0.794分钟，m/z 278.85和280.90(M+H)，90％纯度。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.79 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.41 (dd, J=8.7, 1.9 Hz, 1H), 7.34(d, J=8.7 Hz, 1H), 2.35 (s, 6H)。
实施例1015：(S)-1-(4-((3-(2-(3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用Shimadzu制备型HPLC，使用XTERRA 5μm C18 30x100mm柱，使用乙腈/水/乙酸铵纯化粗物质，其中溶剂A是5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B是5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为30-100％B经25分钟，保持10分钟，流速为30 mL/分钟。使用Shimadzu制备型HPLC，使用XTERRA 5μm C18 30x100mm柱，使用乙腈/水/乙酸铵再次纯化产物，其中溶剂A是5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B是5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为30-50％B经25分钟，保持5分钟，然后经10分钟50-100％B，流速为30 mL/分钟。合并含有所需产物的级分并蒸发。产物的产量为6mg(11％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为100％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=13.15分钟；100％纯度。
分析条件2：保留时间=5.76分钟；100％纯度。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.090分钟，m/z 704.20和706.15(M+H)。
1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 8.86 (d, J=1.4 Hz, 2H), 8.21 (br.s., 1H),7.60 (d, J=1.1 Hz, 1H), 7.52 (m, 2H), 7.41 (m, 1H), 7.29 - 7.22 (m, 3H), 6.64(s, 1H), 5.29 - 5.23 (m, 1H), 5.22 - 5.15 (m, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.33 (br.s., 2H), 3.54 - 3.41 (m, 2H), 2.68 (m, 1H), 2.39 (s, 6H), 2.22 (s, 3H), 1.95- 1.71 (m, 5H), 1.49 - 1.32 (m, 1H)。
中间体：2-(4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)哌啶-1-基)乙酸
在0℃下，在氮气下，向5-溴-2-(哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(245mg，0.871mmol)和碳酸铯(315mg，0.967mmol)在DMF(3mL)中的混合物中逐滴加入2-溴乙酸叔丁酯(0.135mL，0.915mmol)。除去冰浴并将该混合物温热至室温。2.5小时后，将反应混合物用2mL水和20mL乙酸乙酯稀释。萃取有机物，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到粗油。将粗产物用3mL水稀释并推过Waters 1g HLB萃取筒。将该筒用另外10mL水冲洗，产物用30mL甲醇洗脱。除去溶剂，得到304mg的2-(4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)哌啶-1-基)乙酸叔丁酯，为橙色固体(88％收率)。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.224分钟，m/z 395.15, 397.10(M+H)，> 90％纯度。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.96 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.69 (d, J=8.7 Hz, 1H),7.53 (dd, J=8.7, 1.9 Hz, 1H), 3.14 (s, 2H), 3.05 - 2.97 (m, 1H), 2.89 (m,2H), 2.38 (m, 2H), 2.12 - 2.00 (m, 2H), 1.83 (m, 2H), 1.42 (s, 9H)。
在室温下在氮气下，向2-(4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)哌啶-1-基)乙酸叔丁酯(50mg，0.126mmol)/DCE(2.5mL)中加入三氟乙酸(0.078mL，1.012mmol)。将紫色混合物搅拌16小时。将挥发物在真空下除去(旋转蒸发仪)，加入10mL DCM并重复蒸发过程，得到57.9mg(100％收率)的2-(4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)哌啶-1-基)乙酸TFA盐，为红色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.024分钟，m/z 339.0和341.05(M+H)，99％纯度。1H NMR (500MHz,CDCl3) δ 9.32 (br. s., 1H), 7.88 (s, 1H), 7.53 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.49 - 7.38(m, 1H), 3.97 (m, 2H), 3.74 (m, 1H), 3.42 (m, 2H), 3.22 (m, 2H), 2.48 (m,2H), 1.50 (m, 2H)。
实施例1016：(S)-1-(4-((3-(2-(1-(羧甲基)哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为10-50％B经25分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为19.1mg(26％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为94％。
一次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件：保留时间=1.268分钟；ESI-MS(+)m/z=764.1(M+H)。
1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.98 (s, 2H), 8.41 (s, 1H), 7.72 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.51 (d, J=7.0 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.33 - 7.22 (m,3H), 7.10 (s, 1H), 5.33 (d, J=2.6 Hz, 2H), 5.27 (s, 2H), 3.74 (d, J=13.9 Hz,1H), 3.57 (d, J=13.9 Hz, 1H), 3.18 (s, 2H), 3.15 - 3.00 (m, 4H), 2.89 (m,1H), 2.57 (m, 2H), 2.25 (m, 4H), 2.15 (m, 2H), 1.95 (m, 2H), 1.77 (m, 2H),1.49 (m, 3H), 1.44 - 1.33 (m, 1H)。
中间体：5-溴-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯并[d]噁唑
在氮气下，在0℃下，向四氢-2H-吡喃-4-甲酸(0.690g，5.3mmol)/DCM(10mL)中加入DMF(0.041mL，0.530mmol)，并逐滴加入草酰氯(1.180mL，7.9mmol)。移去冰浴，将混合物搅拌45分钟。在旋转蒸发仪上除去挥发物，将粗油用10mL DCM稀释并重复蒸发。
向RBF(圆底烧瓶)中加入2-氨基-4-溴苯酚(1097mg，5.83mmol)/DCM(20mL)以及吡啶(0.429mL，5.30mmol)。将混合物在氮气下搅拌15分钟。在室温下，在第二个含有上述新鲜合成的四氢-2H-吡喃-4-碳酰氯(788mg，5.30mmol)的RBF中，加入2mL DCM，然后加入含有2-氨基-4-溴苯酚/吡啶/DCM的上述混合物。将合并的粉红色非均相混合物在室温下在氮气下搅拌过夜。将粗产物混合物用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将分离的粗产物用4：1冰冷的乙醚/己烷研磨，得到1.512g的N-(5-溴-2-羟基苯基)四氢-2H-吡喃-4-甲酰胺(88％收率)，为粉红色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.190分钟，m/z 300.15, 302.15 (M+H)，90％纯度。1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 8.37 (br. s., 1H), 7.58 (br. s., 1H),7.39 (d, J=2.4 Hz, 1H), 7.20 (dd, J=8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.87 (d, J=8.7 Hz, 1H),4.09 (m, 2H), 3.47 (m, 2H), 2.62 (m, 1H), 1.98 - 1.77 (m, 4H)。
向密封管中加入2mL二氧杂环己烷、N-(5-溴-2-羟基苯基)四氢-2H-吡喃-4-甲酰胺(200mg，0.666mmol)和3当量的三氯氧磷(0.186mL，1.999mmol)。将管密封并将混合物在110℃下加热2小时。冷却混合物，蒸发二氧杂环己烷，得到粗油。将粗产物用水研磨并在真空下干燥，得到160mg(51％收率)的5-溴-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯并[d]噁唑，为粉红色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.427分钟，m/z 282.15, 284.10 (M+H)，65％纯度。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.83 (d, J=1.7 Hz, 1H), 7.44 (dd, J=1.7, 8.7 Hz, 1H), 7.37(d, J=8.7 Hz, 1H), 4.08 (dt, J=11.7, 3.5 Hz, 2H), 3.58 (td, J=11.7, 3.5 Hz,3H), 3.29 - 3.15 (m, 1H), 2.11 - 1.98 (m, 4H)。
实施例1017：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用Shimadzu制备型HPLC，使用Waters XBridge 5μm C18 OBD 30 x 100mm柱，使用乙腈/水/10mM乙酸铵纯化粗物质，其中溶剂A是5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B是5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为10-100％B经20分钟，保持10分钟，流速为30 mL/分钟。蒸发含有所需物质的级分。产物的产量为22mg(39％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为99％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经20分钟，在100％B保持5分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Xbridge 3.5μm Phenyl，3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经20分钟，在100％B保持5分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=7.15分钟，纯度99％。
分析条件2：保留时间=7.66分钟，纯度99％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.360分钟，m/z 707.20(M+H)，100％纯度。
1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 8.96 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.92 (d, J=2.0 Hz,1H), 8.39 (t, J=2.0 Hz, 1H), 7.65 (m, 2H), 7.56 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.48 (m,1H), 7.31 (dd, J=8.4, 1.7 Hz, 1H), 7.27 (m, 2H), 7.06 (s, 1H), 5.39 (s, 2H),5.32 (s, 2H), 4.46 (d, J=13.1 Hz, 1H), 4.32 (d, J=13.1 Hz, 1H), 4.06 (dt, J=11.2, 3.6 Hz, 2H), 3.64 (td, J=11.2, 3.6 Hz, 2H), 3.52 (dd, J=10.5, 3.1 Hz,1H), 3.39 - 3.35 (m, 2H), 2.93 (m, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.24 (m, 1H), 2.14 (m,2H), 2.08 - 2.00 (m, 2H), 1.93 - 1.75 (m, 3H), 1.70 (m, 1H), 1.59 - 1.49 (m,1H)。
中间体：以类似方式合成2-(8-氧杂双环[3.2.1]辛-3-基)-5-溴苯并[d]噁唑。
得到375mg的N-(5-溴-2-羟基苯基)-8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酰胺(81％收率)，为棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7µm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.862分钟，m/z 381.20和383.15(M+H)，90％纯度。1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 9.11 (br. s., 1H), 7.99 (m, 1H), 7.10 (dd, J=8.6, 2.4Hz, 1H), 6.78 (d, J=8.6 Hz, 1H), 4.45 (m, 2H), 3.11 - 2.98 (m, 1H), 2.08 -1.86 (m, 6H), 1.69 (m, 2H)。
得到31.4mg的2-(8-氧杂双环[3.2.1]辛-3-基)-5-溴苯并[d]噁唑(23％收率)，为浅黄色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.502分钟，m/z 308.10和310.10(M+H)，90％纯度。1HNMR (500MHz, CDCl3) δ 7.79 (s, 1H), 7.40 (m, 1H), 7.34 (m, 1H), 4.52 (br. s.,2H), 3.48 - 3.33 (m, 1H), 2.17 (m, 2H), 2.07 (m, 2H), 1.99 - 1.77 (m, 4H)。
实施例1018：(2S)-1-(4-((3-(2-(8-氧杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
使用以下条件通过制备型HPLC纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 30x100mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，复杂梯度为30％B经25分钟、然后50％B保持10分钟、最后50-100％B经5分钟，流速为30mL/分钟。合并含有所需产物的级分并蒸发。产物的产量为10.4mg(18％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为98％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.08分钟；纯度98％。
分析条件2：保留时间=9.13分钟；纯度99％。
LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：WatersAquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.485分钟，m/z 733.20和734.20(M+H)。
1H NMR (400MHz, CD3OD) δ 8.94 (m, 2H), 8.39 (m, 1H), 7.66 (m, 2H),7.55 (m, 1H), 7.48 (m, 1H), 7.27 (m, 3H), 7.05 (m, 1H), 5.38 (s, 2H), 5.33(s, 2H), 4.54 (m, 2H), 4.45 (m, 1H), 4.32 (m, 1H), 3.59 (m, 1H), 3.49 (m,1H), 2.92 (m, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.14 - 1.94 (m, 9H), 1.78 (m, 3H), 1.66 (m,1H), 1.53 (m, 1H), 1.30 (m, 1H)。
根据以下方案制备实施例1019和实施例1020。
实施例1019：5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
向密封管中加入5-溴-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(85mg，0.289mmol)，5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈(150mg，0.289mmol)、THF(4.5mL)、水(1.5mL)、磷酸三钾(245mg，1.157mmol)和第二代XPhos预催化剂(22.75mg，0.029mmol)。将混合物脱气/用氮气冲洗，然后在80℃下加热过夜。冷却反应混合物，蒸发溶剂。将残余物置于乙酸乙酯中，用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将得到的油状物用3：1冷乙醚/己烷研磨，得到148.8mg的5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈(85％收率)，为浅棕褐色粉末。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7μm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.437分钟，m/z607.20, 609.20 (M+H)，93％纯度。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.24 (s, 1H), 9.04(d, J=1.9 Hz, 2H), 8.56 (s, 1H), 7.74 (m, 2H), 7.63 (d, J=1.1 Hz, 1H), 7.54(d, J=6.1 Hz, 1H), 7.40 - 7.20 (m, 4H), 5.50 (s, 2H), 5.44 (s, 2H), 3.43 (m,1H), 3.04 - 2.96 (m, 1H), 2.81 (m, 2H), 2.67 - 2.58 (m, 1H), 2.24 (s, 3H),2.20 (s, 3H), 2.14 - 2.03 (m, 3H), 1.86 (m, 1H)。
实施例1020：(R)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)-3-羟基-2-甲基丙酸
向小瓶中加入5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈(25mg，0.041mmol)/DMF(1mL)以及乙酸(0.100mL)和(R)-2-氨基-3-羟基-2-甲基丙酸(12.26mg，0.103mmol)。将小瓶密封，将混合物在室温下搅拌1小时。然后向反应混合物中加入硼烷-2-甲基吡啶复合物(5.29mg，0.049mmol)并将混合物在室温下搅拌过夜。使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μmC18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为15-80％B经25分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物(R)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)-3-羟基-2-甲基丙酸的产量为4.3mg(14％收率)，通过LCMS分析估计其纯度为94％。两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.394分钟；ESI-MS(+)m/z=710.1(M+H)
分析条件2：保留时间=1.435分钟；ESI-MS(+)m/z=710.0(M+H)
1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.95 (m, 1H), 8.89 (m, 1H), 8.39 (m, 1H), 7.70(m, 1H), 7.52 (m, 2H), 7.40 (m, 1H), 7.31 - 7.18 (m, 3H), 7.02 (m, 1H), 5.33(m, 2H), 5.24 (m, 2H), 4.00 (m, 4H), 3.07 (m, 1H), 2.92 (m, 2H), 2.41 - 2.24(m, 4H), 2.22 - 2.07 (m, 4H), 1.88 (m, 2H), 1.76 (m, 2H), 1.24 (s, 3H)。
实施例1021：5-((4-氯-2-(羟甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
从实施例1020的反应混合物中分离实施例1021。使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为15-80％B经25分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物5-((4-氯-2-(羟甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈的产量为2.6mg(收率10％)，LCMS分析估计其纯度为96.2％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.944分钟；ESI-MS(+)m/z=609.0(M+H)
分析条件2：保留时间=1.884分钟；ESI-MS(+)m/z=609.0(M+H)。
中间体：5-溴-2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑
向2-氨基-4-溴苯酚(300mg，1.596mmol)和1-苯基哌啶-4-甲酸盐酸盐(386mg，1.596mmol)中加入多聚磷酸(5g)。将混合物在190℃下加热3.5小时。在0℃下向反应混合物中逐滴加入6mL水并手动搅拌。向反应混合物中逐滴加入2M NaOH水溶液直至pH达到~7。向浓稠的紫色混合物中加入30mL乙酸乙酯，萃取产物，用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到158.9mg的 5-溴-2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑，为红色固体(28％收率)，通过LCMS测得其纯度为95％。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7 μm C18, 2.1 x 50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.202分钟，m/z 357.15和359.15(M+H)，95％纯度。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.96 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.70 (d, J=8.6Hz, 1H), 7.55 (d, J=1.9, 8.6 Hz, 1H), 7.27 - 7.19 (m, 2H), 6.99 (d, J=8.0 Hz,2H), 6.78 (t, J=7.2 Hz, 1H), 3.74 (dt, J=12.7, 3.4 Hz, 2H), 3.25 (m, 1H),2.98 - 2.88 (m, 2H), 2.19 (dd, J=13.3, 2.9 Hz, 2H), 1.98 - 1.88 (m, 2H)。
实施例1022：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
向密封管中加入5-溴-2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(28.3mg，0.079mmol)、THF(3mL)、(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸(50mg，0.079mmol)、磷酸三钾(42.0mg，0.198mmol)、水(1mL)和第二代XPhos预催化剂(7.80mg，9.91μmol)。将容器密封，将混合物脱气/用氮气冲洗，然后在75℃下加热过夜。使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为50-90％B经20分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为17.5mg(收率28.1％)，并且通过LCMS分析估计其纯度为99％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=2.494分钟；ESI-MS(+)m/z=782.0(M+H)
分析条件2：保留时间=1.846分钟；ESI-MS(+)m/z=782.0(M+H)
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (m, 2H), 8.47 (s, 1H), 7.77 (d, J=8.5 Hz,1H), 7.64 (s, 1H), 7.53 (d, J=6.7 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.36 - 7.20 (m, 5H),7.14 (s, 1H), 7.01 (d, J=7.9 Hz, 2H), 6.79 (t, J=7.2 Hz, 1H), 5.35 (br. s.,2H), 5.29 (s, 2H), 3.85 - 3.73 (m, 4H), 3.62 (d, J=13.7 Hz, 1H), 3.13 (m,1H), 2.94 (m, 4H), 2.33 - 2.15 (m, 5H), 1.97 (m, 2H), 1.80 (m, 1H), 1.73 (m,1H), 1.49 (m, 3H), 1.37 (m, 1H)。
实施例1023：(S)-1-(5-氯-2-甲氧基-4-((2-甲基-3-(2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
实施例1023根据上述方案和以下步骤制备：在氮气氛下，向5-氯-2-羟基-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯甲醛(1.41g，3.50mmol)/DMF(23mL)中加入碳酸钾(1.113g，8.05mmol)和碘甲烷(0.436ml，7.00mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将粗产物用75mL DCM稀释，用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到1.4g(88％)的5-氯-2-甲氧基-4-((2-甲基-3)-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯甲醛，为浅棕褐色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7mm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=2.044分钟，m/z 417.25, 419.25(M+H)，90％纯度。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.16 (s,1H), 7.69 - 7.65 (m, 2H), 7.64 - 7.59 (m, 1H), 7.25 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.11(s, 1H), 5.38 (s, 2H), 4.01 (s, 3H), 2.54 (s, 3H), 1.32 (s, 12H)。
向RBF中加入乙酸(27.5μl，0.480mmol)、DCE(1mL)、乙醇(3mL)、THF(1mL)、20mg烘箱干燥的研磨4A分子筛、L-哌啶甲酸(62.0mg，0.480mmol)和5-氯-2-甲氧基-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯甲醛(100mg，0.240mmol)。密封RBF，将混合物置于氮气氛下，将混合物在室温下搅拌1小时。向小瓶中加入THF(1ml)和氰基硼氢化钠(30.2mg，0.480mmol)。将混合物短暂超声处理成溶液，然后置于注射器中。将所得溶液经4小时手动滴入到上述反应混合物中。然后将反应混合物在氮气下搅拌过夜。粗产物用乙酸乙酯稀释，用1.5M磷酸钾、水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到134.7mg的(S)-1-(5-氯-2-甲氧基-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸，为白色固体(85％收率，80％纯度)。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters AquityBEH 1.7mm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.554分钟，m/z 530.35(M+H)，80％纯度。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 )δ 7.64 (m, 1H), 7.59 (m, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.28 - 7.21 (m, 1H), 6.95 (S,1H), 5.23 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.77 - 3.71 (m, 1H), 3.69 - 3.62 (m, 1H),3.13 (m, 1H), 2.90 (m, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.32 (m, 1H), 1.82 (m, 1H), 1.76 -1.68 (m, 1H), 1.52 (m, 3H), 1.41 - 1.36 (m, 1H), 1.32 (s, 12H)。
向密封管中加入5-溴-2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑(35.4mg，0.099mmol)、THF(3mL)、(S)-1-(5-氯-2-甲氧基-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸(68.25mg，0.129mmol)、磷酸三钾(52.6mg，0.248mmol)、水(1mL)和第二代XPhos预催化剂(7.80mg，9.91μmol)。将容器密封，将混合物脱气/用氮气冲洗，然后在75℃下加热过夜。使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为47-87％B经23分钟，保持4分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。使用以下条件通过制备型LC/MS进一步纯化该物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A为5:95甲醇：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为50-90％B经25分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。实施例1023(S)-1-(5-氯-2-甲氧基-4-((2-甲基-3-(2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸的产量为1.1mg(2％收率)，通过LCMS分析估计其纯度为92％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18,2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。分析条件1：保留时间=2.567分钟；ESI-MS(+)m/z=680.0(M+H)；分析条件2：保留时间=1.866分钟；ESI-MS(+)m/z=680.0(M+H)；1H NMR (400MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.76 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.62(d, J=1.7 Hz, 1H), 7.57 (d, J=6.8 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.33 - 7.19 (m, 5H),7.03 - 6.97 (m, 2H), 6.92 (s, 1H), 6.78 (t, J=7.2 Hz, 1H), 5.27 (s, 2H), 3.82(s, 3H), 3.79 - 3.67 (m, 2H), 3.30 - 3.21 (m, 2H), 2.94 (t, J=10.9 Hz, 3H),2.84 (m, 1H), 2.65 (dd, J=8.1, 3.9 Hz, 1H), 2.28 - 2.16 (m, 4H), 2.05 - 1.86(m, 3H), 1.74 - 1.50 (m, 3H), 1.42 (m, 2H), 1.24 (m, 2H)。
中间体：4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)环己烷甲酸甲酯和4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)环己烷甲酸
在0℃在氮气下，向RBF中加入4-(甲氧基羰基)环己烷甲酸(0.484g，2.60mmol)、干燥DCM(10mL)、干燥DMF(0.040mL，0.520mmol)并逐滴加入草酰氯(0.854mL，5.72mmol)。移去冰浴，将混合物在氮气下搅拌45分钟。在旋转蒸发仪上除去挥发物，将粗油用干燥DCM稀释并重复蒸发，得到粗4-(氯羰基)环己烷甲酸甲酯。向小瓶中加入新合成的4-(氯羰基)环己烷甲酸甲酯(假定2.60mmol)、PhCl(2mL)、5-溴苯并噁唑(257mg，1.3mmol)和碳酸钾(27.6mg，0.200mmol)/水(0.667mL)。将小瓶密封，将混合物在140℃下搅拌过夜。冷却混合物并除去挥发物。将粗产物置于1：1乙酸乙酯/DCM中，用最少量的水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。然后将粗反应混合物置于6mL乙腈/DMF中，并使用Shimadzu制备型HPLC使用WatersSunfire 5µm C18 30x100mm柱使用乙腈/水/乙酸铵纯化，其中溶剂A为5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B为5%水/95%乙腈/10mM乙酸铵，梯度为25-100％B经15分钟，保持5分钟，流速为40mL/分钟。通过NMR分析获得 4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)环己烷甲酸甲酯，为顺式和反式异构体的~1：1混合物，为桃色固体(100.8mg，23％收率)。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7 µ m C18, 2.1 x50mm柱，梯度为2分钟内2-98％B(B=100％HPLC级乙腈/0.05%三氟乙酸)，(A=100％HPLC级水/0.05%三氟乙酸)，梯度时间1.5分钟，流速为0.8mL/分钟。LCMS Rt=1.334分钟，m/z337.9和339.9(M+H)。
向小瓶中加入4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)环己烷甲酸甲酯(20mg，0.059mmol)/THF(2mL)以及氢氧化锂(7.08mg，0.296mmol)/水(0.400mL)。将混合物在室温下搅拌过夜。除去挥发物，将得到的白色残余物置于乙酸乙酯中，用NH4Cl、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到18.7mg的4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)环己烷甲酸，为白色固体。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7mmC18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=2.114分钟，m/z 324.15, 326.15(M+H)，95％纯度。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ7.82 (m, 1H), 7.54 (m, 1H), 7.51 (m, 1H), 3.20 (m, 1H), 3.02 (m, 1H), 2.61(m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 2.16 (m, 1H), 2.03 (m, 2H), 1.81 (m,1H), 1.75 - 1.59 (m, 1H)。
实施例1024：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(4-(甲氧基羰基)环己基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
向密封管中加入(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸(30mg，0.047mmol)、THF(3mL)、水(1mL)、4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)环己烷甲酸甲酯(16.05mg，0.047mmol)、磷酸三钾(25.2mg，0.119mmol)和第二代XPhos预催化剂(3.74mg，4.75μmol)。将容器密封，将混合物脱气/用氮气冲洗，然后在80℃下加热过夜。将粗反应混合物浓缩，置于4mL乙腈中，并使用Shimadzu制备型HPLC使用Phenomenex Axia C18 30x100mm 10μm柱使用乙腈/水/乙酸铵纯化，其中溶剂A为5％乙腈/95％水/10mM乙酸铵，溶剂B为5％水/95％乙腈/10mM乙酸铵，梯度为20-100％B经12分钟，保持10分钟，流速为40mL/分钟。合并级分并在氮气流下除去溶剂，得到8.0mg(22％收率)的(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(4-(甲氧基羰基)环己基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸，为白色固体，纯度为96％。LC/MS数据在Shimadzu分析型LCMS(ESI+)上在220nm下使用下组条件获得：Waters Aquity BEH 1.7mm C18, 2.1x50mm柱，梯度为2分钟内0-100％B(B=90％HPLC级乙腈/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级水)，(A=90％HPLC级水/0.1%三氟乙酸/10％HPLC级乙腈)，保持1分钟，速率为1mL/分钟。LCMS Rt=1.234分钟，m/z 763.15,764.10(M+H)。两次分析型LC/MS进样用来确定最终纯度。进样1条件：Waters Xbridge 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。进样2条件：Waters Sunfire 3.5μm C18, 3.0×150mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为10-100％B经15分钟，在100％B保持5分钟，流速为0.5mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=14.68分钟；纯度95％。
分析条件2：保留时间=11.30分钟；纯度97％。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.96 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.40 (t, J=1.8Hz, 1H), 7.70 - 7.61 (m, 2H), 7.57 - 7.47 (m, 3H), 7.34 - 7.24 (m, 2H), 7.06(s, 1H), 5.39 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 4.44 (d, J=12.9 Hz, 1H), 4.30 (d, J=13.1Hz, 1H), 3.73 - 3.68 (m, 3H), 3.51 (br d, J=7.9 Hz, 1H), 3.29 - 3.15 (m, 1H),3.05 (m, 1H), 2.94 (br t, J=11.0 Hz, 1H), 2.73 - 2.64 (m, 1H), 2.55 - 2.41(m, 1H), 2.36 - 2.27 (m, 4H), 2.25 - 2.12 (m, 3H), 2.10 - 2.00 (m, 3H), 1.87- 1.76 (m, 3H), 1.74 - 1.66 (m, 2H), 1.59 - 1.43 (m, 1H)。
实施例1025和实施例1026：(S)-1-(4-((3-(2-(4-羧基环己基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
向密封管中加入(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸(40mg，0.063mmol)、THF(3mL)、水(1mL)、4-(5-溴苯并[d]噁唑-2-基)环己烷甲酸(17.10mg，0.053mmol)、磷酸三钾(28.0mg，0.132mmol)和第二代XPhos预催化剂(4.15mg，5.27μmol)。将容器密封，将混合物脱气/用氮气冲洗，然后在80℃下加热过夜。使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，流动相B是95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，梯度为15-55％B经20分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。
实施例1025(异构体-1，第一洗脱异构体)：产物的产量为 11.1mg(28％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为100％。
两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。
进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，ＵＶ波长为220nm。进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，ＵＶ波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.474分钟；ESI-MS(+)m/z=749.2(M+H)
分析条件2：保留时间=1.839分钟；ESI-MS(+)m/z=749.2(M+H)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.98 (dd, J=3.2, 2.0 Hz, 2H), 8.41 (m, 1H),7.71 (m, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.50 (m, 1H), 7.44 (m, 1H), 7.36 - 7.22 (m, 3H),7.10 (m, 1H), 5.34 (s, 2H), 5.27 (s, 2H), 3.85 - 3.76 (m, 1H), 3.68 - 3.59(m, 1H), 3.18 - 3.11 (m, 1H), 3.08 - 2.98 (m, 1H), 2.96 - 2.88 (m, 1H), 2.36- 2.26 (m, 2H), 2.26 - 2.18 (m, 5H), 2.10 - 2.02 (m, 2H), 1.86 - 1.60 (m,4H), 1.59 - 1.45 (m, 5H), 1.43 - 1.32 (m, 1H)。
实施例1026(异构体-2，第二洗脱异构体)：产物的产量为 6.3mg(16％ 收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为99％。两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。进样2条件：WatersAcquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。分析条件1：保留时间=1.596分钟；ESI-MS(+)m/z=749.2(M+H)；分析条件2：保留时间=1.906分钟；ESI-MS(+)m/z=749.2(M+H)；1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.97 (dd, J=3.2, 2.0 Hz, 2H), 8.40 (m,1H), 7.72 - 7.68 (m, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.52 - 7.48 (m, 1H), 7.44 (s, 1H),7.33 - 7.21 (m, 3H), 7.08 (s, 1H), 5.33 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.87 - 3.79(m, 1H), 3.70 - 3.62 (m, 1H), 3.22 (m, 1H), 3.17 - 3.10 (m, 1H), 2.97 - 2.87(m, 1H), 2.36 - 2.27 (m, 1H), 2.24 (s, 3H), 2.12 - 2.01 (m, 2H), 1.99 - 1.69(m, 9H), 1.57 - 1.46 (m, 3H), 1.42 - 1.30 (m, 1H)。
以下方案说明实施例1027至实施例1031的合成。
中间体：5-(7-溴喹喔啉-2-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯
将XPhos第二代预催化剂(40.5mg，0.051mmol)加入到含有7-溴-2-氯喹喔啉(250mg，1.027mmol)、3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(317mg，1.027mmol)和磷酸钾(545mg，2.57mmol)在THF(5mL)和水(1mL)中的氩气脱气溶液的厚壁螺旋盖管中。将管密封，将混合物在室温下搅拌16小时，然后用乙酸乙酯和水稀释。分离水层，有机层用乙酸乙酯再萃取两次。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到浅焦糖色残余物。将残余物置于少量二氯甲烷中并加入RediSepRf正相硅胶Teledyne ISCO 40g一次性柱中，该柱首先用己烷洗脱120mL，然后用0-50％B洗脱1400mL，其中溶剂B=乙酸乙酯，溶剂A=己烷。浓缩洗脱物后，分离出所需产物3-(7-溴喹喔啉-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(56.0mg，14％收率)，为淡黄色固体。LCMS：tR(保留时间)=1.51分钟；LCMS (ESI )m/z C18H21BrN3O2的计算值：390.08，实测值：389.95和391.95 [M+H]+。LCMS条件：进样量=3uL；梯度=2-98％B；梯度时间=1.5分钟；流速=0.8ml/分钟；波长=220nm；流动相A=0：100乙腈：水(含有0.05％三氟乙酸)；流动相B=100：0乙腈：水(含有0.05％三氟乙酸)；柱=Waters Aquity BEH C18, 2.1 x 50 mm，1.7 U(= μm)；烘箱温度=40℃。1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 9.10 (s, 1H), 8.25 (br. s., 1H),7.94 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.80 (dd, J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.04 (br. s., 1H), 4.59(br. s., 2H), 3.66 (t, J=5.7 Hz, 2H), 2.50 (br. s., 2H), 1.55 (s, 9H)。
中间体：7-溴-2-(1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)喹喔啉
在室温下将三氟乙酸(0.4mL，5.19mmol)加入到3-(7-溴喹喔啉-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(50mg，0.128mmol)的干燥DCM(2mL)溶液中。将混合物在室温下搅拌2小时，然后将其蒸发至干。使用1.0g SCX筒(MeOH：2N NH3：MeOH)使残余物成为游离碱(free-based)，得到7-溴-2-(1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)喹喔啉，为焦糖色油状物，其原样"使用并直接用于下一步。LCMS：tR=0.77分钟；LCMS (ESI) m/z C13H13BrN3的计算值：290.03，实测值：289.85和291.85 [M+H]+。LCMS条件：进样量=3uL；梯度=2-98％B；梯度时间=1.5分钟；流速=0.8ml/分钟；波长=220nm；流动相A=0：100乙腈：水(含有0.05％三氟乙酸)；流动相B=100：0乙腈：水(含有0.05％三氟乙酸)；柱=Waters Aquity BEH C18, 2.1 x 50 mm，1.7 U；烘箱温度=40℃。
实施例1027：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(3-(1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)喹喔啉-6-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
将XPhos第二代预催化剂(10.09mg，0.013mmol)加入到含有7-溴-2-(1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)喹喔啉(37.2mg，0.128mmol)、(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)-苄基)哌啶-2-甲酸和(S)-1-(4-((3-硼-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸(70.5mg，0.128mmol，基于硼酸，以与上述类似的方式制备)的混合物(1：4)和磷酸钾(68.0mg，0.321mmol)在THF(1mL)和水(0.5mL)中的氩气脱气溶液的1打兰(dram)小瓶中。将小瓶密封，将混合物在80℃下搅拌16小时。冷却至室温后，分离有机层并浓缩至接近干燥，将得到的残余物置于MeOH(1mL)和DMF(1mL)中，并通过制备型LCMS在以下条件下纯化：柱：XBridge C18, 19 x 200 mm，5 U；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：14-54％B经19分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为25.4mg(27％)，通过LCMS分析估计其纯度为97％。分析型LCMS用于测定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1×50mm，1.7U；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：98.3％；实测质量：714.97；保留时间：1.44分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1×50mm，1.7U；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：96.7％；实测质量：714.98；保留时间：1.46分钟。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 9.34 (s, 1H), 9.02 (d, J=1.8 Hz, 1H), 9.01 (d, J=1.8 Hz,1H), 8.47 (s, 1H), 8.12 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.88 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.76 (dd,J=8.4, 1.8 Hz, 1H), 7.59 (dd, J=6.2, 2.6 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.40 - 7.34(m, 2H), 7.24 (br s, 1H), 7.12 (s, 1H), 5.34 (s, 2H), 5.31 (s, 2H), 3.87 (brs, 2H), 3.81 (br d, J=13.6 Hz, 1H), 3.61 (br d, J=13.6 Hz, 1H), 3.13 - 3.07(m, 1H), 2.98 - 2.83 (2m, 3H), 2.37 (br s, 2H), 2.30 (s, 3H), 2.29 - 2.24 (m,1H), 1.83 - 1.78 (m, 1H), 1.75 - 1.68 (m, 1H), 1.55 - 1.45 (m, 3H), 1.41 -1.30 (m, 1H)。
中间体：3-(7-溴喹喔啉-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-8-甲酸叔丁酯
将XPhos第二代预催化剂(11.76mg，0.015mmol)加入到含有7-溴-2-氯喹喔啉(72.6mg，0.298mmol)、3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-8-甲酸叔丁酯(100mg，0.298mmol)和磷酸钾(158mg，0.746mmol)在THF(2mL)和水(1.0mL)中的氩气脱气溶液的厚壁螺旋盖管中。将管密封，将混合物在室温下搅拌16小时，然后用乙酸乙酯和水稀释。分离水层，水层用乙酸乙酯再萃取两次。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到焦糖色残余物。将四分之三的该残余物置于少量二氯甲烷中，并加入RediSepRf正相硅胶Teledyne ISCO 24g一次性柱中，该柱首先用己烷洗脱80mL，然后用0-50％B洗脱280mL，其中溶剂B=乙酸乙酯，溶剂A=己烷。浓缩洗脱物后，分离所需产物3-(7-溴喹喔啉-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-8-甲酸叔丁酯(21.2mg，收率17％)，为浅黄色薄膜。剩余的四分之一的粗残余物用于制备型LCMS纯化以用于表征目的，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5U；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：50-100％B经22分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为6.2mg(5％)，通过LCMS分析估计其纯度为100％。分析型LCMS用于测定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1×50mm，1.7U；流动相A：5：95乙腈：水(含有10 mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10 mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：416.06；保留时间：2.5分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1×50mm，1.7U；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：100.0％；实测质量：416.07；保留时间：2.51分钟。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.32 (s, 1H), 8.24 (d, J=2.2 Hz, 1H),8.04 - 7.99 (m, 1H), 7.93 (dd, J=8.8, 1.8 Hz, 1H), 7.49 (br. s., 1H), 4.54(br. s., 1H), 4.49 - 4.37 (m, 1H), 3.13 - 2.98 (m, 1H), 2.65 - 2.54 (m, 1H),2.28 - 2.09 (m, 1H), 1.98 (br. s., 2H), 1.77 - 1.64 (m, 1H), 1.39 (s, 9H)。
以2mmol规模制备并使用正相硅胶Teledyne ISCO柱以类似方式进行纯化：LCMS：tR=1.55分钟；LCMS (ESI) m/z C20H23BrN3O2的计算值：416.10，实测值：415.95和417.95[M+H]+。LCMS条件：进样量=3uL；梯度=2-98％B；梯度时间=1.5分钟；流速=0.8mL/分钟；波长=220nm；流动相A=0：100乙腈：水(含有0.05％三氟乙酸)；流动相B=100：0乙腈：水(含有0.05％三氟乙酸)；柱=Waters Aquity BEH C18, 2.1 x 50 mm，1.7 U；烘箱温度=40℃.
实施例1028：(2S)-1-(4-((3-(3-(8-(叔丁氧基羰基)双环[3.2.1]辛-2-烯-3-基)喹喔啉-6-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
以与实施例1027类似的方式制备实施例1028。通过制备型LCMS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5U；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：20-85％B经25分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为2.5mg(3.2％)，通过LCMS分析估计其纯度为97％。分析型LCMS用于测定最终纯度。进样1条件：柱：WatersXBridge C18, 2.1×50mm，1.7U；流动相A：5：95乙腈：水(含有10 mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10 mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：841.05；保留时间：2.21分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1×50mm，1.7U；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：96.6％；实测质量：841.06；保留时间：2.26分钟。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 9.32 (s, 1H), 9.04 - 9.03 (m, 1H), 9.02 - 9.00 (m, 1H),8.48 (s, 1H), 8.13 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.77 (dd, J=8.4, 1.8 Hz,1H), 7.59 (dd, J=5.9, 2.9 Hz, 1H), 7.48 (br s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.39 - 7.36(m, 2H), 5.36 (br s, 2H), 5.32 (s, 2H), 4.55 (br s, 1H), 4.50 - 4.38 (m, 1H),3.80 (br d, J=13.9 Hz, 1H), 3.63 (br d, J=13.2 Hz, 1H), 3.19 - 3.02 (2m, 2H),2.95 - 2.83 (m, 1H), 2.74 - 2.59 (m, 1H), 2.31 (s, 3H), 2.31 - 2.26 (m, 1H),2.26 - 2.08 (m, 1H), 2.03 - 1.96 (m, 2H), 1.86 - 1.77 (m, 1H), 1.76 - 1.65(m, 2H), 1.49 (br s, 3H), 1.42 - 1.34 (m, 2H), 1.39 (s, 9H)。
中间体：2-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-3-基)-7-溴喹喔啉
在室温下，将三氟乙酸(200μL，2.60mmol)一次性加入到3-(7-溴喹喔啉-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-8-甲酸叔丁酯(50mg，0.12mmol)的干燥二氯甲烷(1mL)溶液中。将混合物在室温下搅拌1.5小时，然后将其用氮气流浓缩并置于高真空下16小时。使用1gVarian Mega Bond Elut Flash SCX筒(MeOH，然后2M NH3/MeOH；各3个柱体积)使得到的残余物成为游离碱。然后，分离出所需产物2-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-3-基)-7-溴喹喔啉(35.7mg，94％收率)，为浅焦糖色玻璃，其直接用于下一步。LCMS：tR=1.06分钟；LCMS(ESI) m/z C15H15BrN3的计算值：316.05，实测值：316.15和318.15 [M+H]+。LCMS条件：进样量=1uL；梯度=0-100％B；梯度时间=2分钟；流速=1mL/分钟；波长=220nm；流动相A=10:90乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B=90:10乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；柱=WatersAquity BEH C18, 2.1 x 50 mm，1.7 U；烘箱温度=40℃。
实施例1029：(2S)-1-(4-((3-(3-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-3-基)喹喔啉-6-基)-2-甲基苄基)-氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
以与实施例1027类似的方式制备实施例1029。通过制备型LCMS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5U；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：12-52％B经22分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为20.8mg(25％)，通过LCMS分析估计其纯度为97％。分析型LCMS用于测定最终纯度。进样1条件：柱：WatersXBridge C18, 2.1×50mm，1.7U；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：97.3％；实测质量：741.02；保留时间：1.43分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1×50mm，1.7U；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：97.3％；实测质量：741.05；保留时间：1.41分钟。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.28 (s, 1H), 9.02 (d, J=1.8 Hz, 1H), 9.01 (d, J=1.5 Hz, 1H),8.47 (s, 1H), 8.11 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.75 (dd, J=8.6, 1.7 Hz,1H), 7.58 (dd, J=6.2, 1.8 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.41 (br d, J=5.5 Hz, 1H),7.39 - 7.35 (m, 2H), 7.12 (d, J=3.3 Hz, 1H), 5.34 (br s, 2H), 5.31 (s, 2H),3.94 - 3.90 (m, 1H), 3.89 - 3.85 (m, 1H), 3.80 (br d, J=14.3 Hz, 1H), 3.61(br d, J=13.6 Hz, 1H), 3.13 - 3.05 (m, 1H), 2.99 - 2.96 (m, 1H), 2.95 -2.92(m, 1H), 2.92 - 2.86 (m, 1H), 2.30 (s, 3H), 2.33 - 2.22 (m, 1H), 2.06 - 1.95(m, 2H), 1.90 - 1.85 (m, 1H), 1.82 - 1.75 (m, 1H), 1.75 - 1.66 (m, 1H), 1.65- 1.56 (m, 1H), 1.55 - 1.43 (m, 3H), 1.41 - 1.29 (m, 1H)。
实施例1030：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(3-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)喹喔啉-6-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
以与实施例1027类似的方式制备实施例1030。使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，流动相B是95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，梯度为15-55％B经20分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为7.3mg(9％收率)，通过LCMS分析估计其纯度为94％。两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。分析条件1：保留时间=1.328分钟；ESI-MS(+)m/z=715.0(M+H)。分析条件2：保留时间=1.298分钟；ESI-MS(+)m/z=715.0(M+H)。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.36 (s, 1H), 9.06 - 8.95 (m,1H), 8.42 (s, 1H), 8.16 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.92 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.79 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.58 - 7.50 (m, 2H), 7.41 - 7.33 (m, 2H), 7.28 (s, 1H),7.17 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.09 (m, 2H), 5.38 (d, J=6.4 Hz, 2H), 5.34 (s, 2H),4.25 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.40 (m, 2H), 3.33 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 2.94(m, 2H), 2.89 - 2.81 (m, 1H), 2.32 - 2.24 (m, 4H), 2.08 (m, 1H), 1.65 (m,4H), 1.47 (m, 1H)。
实施例1031：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)喹喔啉-6-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
以与实施例1027类似的方式，由7-溴-2-(4-甲基哌嗪-1-基)喹喔啉制备实施例1031。使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：Waters XBridge 5μm C18, 19×200mm，其中流动相A是5:95乙腈：水(含有0.1％TFA)，流动相B是95：5乙腈：水(含有0.1％TFA)，梯度为15-55％B经20分钟，保持5分钟，流速为20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为6.1mg(6％收率)，并且通过LCMS分析估计其纯度为93％。两次分析型LC/MS进样用于确定最终纯度。进样1条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B为95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。进样2条件：Waters Acquity UPLC BEH 1.7μm C18, 2.1×50mm，其中流动相A为5:95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B为95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)，温度为50℃，梯度为0-100％B经3分钟，在100％B保持0.75分钟，流速为1.0mL/分钟，UV波长为220nm。
分析条件1：保留时间=1.387分钟；ESI-MS(+)m/z=732.1(M+H)
分析条件2：保留时间=1.434分钟；ESI-MS(+)m/z=732.1(M+H)
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (m, 2H), 8.93 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.96(d, J=8.2 Hz, 1H), 7.58 - 7.52 (m, 3H), 7.43 (m, 1H), 7.33 (m, 2H), 7.27 (br.s., 1H), 7.21 (s, 1H), 7.16 (br. s., 1H), 7.06 (br.s., 1H), 5.39 (d, J=7.3Hz, 2H), 5.35 (s, 2H), 4.82 - 4.61 (m, 1H), 4.28 (m, 3H), 4.04 - 3.86 (m,2H), 3.34 - 3.24 (m, 5H), 2.86 (m, 5H), 2.28 (s, 3H), 2.18 - 2.05 (m, 2H),1.67 (m, 3H), 1.49 (m, 1H)。
实施例2001-2018以实施例2001例举并类似于上述那些的方式制备。
实施例2001：5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基丙-2-基)(甲基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
步骤1：向(1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷二氢溴酸盐(300mg，1.154mmol)、5-溴-2-氯苯并[d]噁唑(179mg，0.769mmol)在DMF(4mL)中的混合物中加入Hunig氏碱(0.403mL，2.308mmol)。将反应溶液搅拌2小时，用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤，用MgSO4干燥后浓缩。通过快速柱色谱法在硅胶上用10-30％MeOH/DCM洗脱来纯化残余物，得到60mg的2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-5-溴苯并[d]噁唑，为固体。LC/MS (ESI) m/z295.8 (M+1)+。
步骤2：在N2鼓泡下将5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈(0.088g，0.17mmol)、2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-5-溴苯并[d]噁唑(0.050g，0.170mmol)和0.5MK3PO4(1.020mL，0.510mmol)在THF(6mL)和1,4-二氧杂环己烷(1.200mL)中的混合物搅拌15分钟，然后用第二代XPhos预催化剂(6.69mg，8.50μmol)处理。将混合物鼓泡10分钟，然后在氮气下搅拌16小时。用EtOAc稀释该混合物，用水、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩。通过快速色谱法在硅胶上纯化粗分离物，得到80mg所需产物5-((5-((3-(2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-4-氯-2-甲酰基苯氧基)甲基)烟腈，为固体。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridge C18,2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100％；实测质量：606.1；保留时间：1.86分钟。
步骤3：将5-((5-((3-((3-(2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-4-氯-2-甲酰基苯氧基)甲基)烟腈(18.18mg，0.03mmol)、2-氨基丙烷-1,3-二醇(10.93mg，0.120mmol)和乙酸(0.012mL，0.210mmol)在DCE(2mL)和EtOH(2mL)和氰基硼氢化钠(1M于THF中)(0.120mL，0.120mmol)中的混合物在室温下搅拌16小时。向反应混合物中加入0.02mL的37％甲醛水溶液，然后搅拌16小时。除去溶剂后，通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：20-60％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产量为7.0mg，通过LCMS分析估计其纯度为89％。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：89.1％；实测质量：709.09；保留时间：1.64分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：90.3％；实测质量：709.12；保留时间：1.32分钟。
实施例2002：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：15-55％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：733.05；保留时间：1.51分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：97.0％；实测质量：733.1；保留时间：1.38分钟。
实施例2003：5-((5-((3-(2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-4-氯-2-(((1,3-二羟基丙-2-基)氨基)甲基)苯氧基)甲基)烟腈
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：15-55％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridge C18,2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：99.2％；实测质量：681；保留时间：1.3分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：100.0％；实测质量：681.06；保留时间：1.43分钟。
实施例2004：5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)(甲基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：20-60％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：95.0％；实测质量：723.08；保留时间：1.63分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：94.6％；实测质量：723.12；保留时间：1.35分钟。
实施例2005：(S)-1-(4-((3-(2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：10-50％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：96.6％；实测质量：719.02；保留时间：1.38分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：100.0％；实测质量：719；保留时间：1.39分钟。
实施例2006：5-((5-((3-(2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-4-氯-2-(((1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)氨基)甲基)苯氧基)甲基)烟腈
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：15-55％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。通过制备型LC/MS进一步纯化该物质，条件如下：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；梯度：10-50％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。通过制备型LC/MS进一步纯化该物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95甲醇：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5甲醇：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：45-85％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：695.1；保留时间：1.33分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：100.0％；实测质量：695.05；保留时间：1.43分钟。
实施例2007：(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：22-62％B经23分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：721.04；保留时间：1.9分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：100.0％；实测质量：721.02；保留时间：1.47分钟。
实施例2008：5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基丙-2-基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：26-66％B经25分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：98.9％；实测质量：683.01；保留时间：1.95分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：99.2％；实测质量：682.99；保留时间：1.4分钟。
实施例2009：5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；梯度：10-50％B经25分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：WatersXBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：98.2％；实测质量：697.03；保留时间：1.95分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：97.8％；实测质量：697.02；保留时间：1.44分钟。
实施例2010：(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)-L-丝氨酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：15-55％B经22分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：93.0％；实测质量：696.93；保留时间：1.8分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：93.6％；实测质量：696.98；保留时间：1.41分钟。
实施例2011：(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)-3-羟基-2-甲基丙酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：20-60％B经20分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：98.6％；实测质量：710.97；保留时间：1.84分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：98.8％；实测质量：710.98；保留时间：1.44分钟。
实施例2012：(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)戊酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：22-62％B经22分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：709.05；保留时间：1.91分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：100.0％；实测质量：709.01；保留时间：1.53分钟。
实施例2013：(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)-3-甲基丁酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：22-62％B经22分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：709.01；保留时间：1.9分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：100.0％；实测质量：709；保留时间：1.5分钟。
实施例2014：5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基丙-2-基)(甲基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：35-75％B经20分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。
进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：697.01；保留时间：2.11分钟。
进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：97.7％；实测质量：696.98；保留时间：1.46分钟。
实施例2015：5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)(甲基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：35-75％B经19分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：99.2％；实测质量：711.03；保留时间：2.04分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：99.4％；实测质量：711.03；保留时间：1.49分钟。
实施例2016：N-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)-N-甲基-L-丝氨酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：20-60％B经22分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：96.4％；实测质量：711.02；保留时间：1.88分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：96.1％；实测质量：710.97；保留时间：1.45分钟。
实施例2017：(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)(甲基)氨基)-3-羟基-2-甲基丙酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：22-62％B经20分钟，然后在100％B保持4分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：100.0％；实测质量：725.21；保留时间：1.43分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：100.0％；实测质量：725.22；保留时间：1.57分钟。
实施例2018：(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)(甲基)氨基)戊酸
通过制备型LC/MS纯化粗物质，条件如下：柱：XBridge C18, 19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；梯度：25-65％B经20分钟，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/分钟。合并含有所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。分析型LC/MS用于确定最终纯度。进样1条件：柱：Waters XBridgeC18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；流动相B：95：5乙腈：水(含有10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样1结果：纯度：94.7％；实测质量：723.25；保留时间：1.68分钟。进样2条件：柱：Waters XBridge C18, 2.1mm×50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5：95乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；流动相B：95：5乙腈：水(含有0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％B至100％B经3分钟，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1 mL/分钟；检测：MS和UV(220nm)。进样2结果：纯度：96.4％；实测质量：723.23；保留时间：1.52分钟。
生物测定
使用PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定研究式(I)的化合物结合于PD-L1的能力。
均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定
PD-1与PD-L1的相互作用可使用这两种蛋白的胞外域的可溶的经纯化制剂来评定。PD-1和PD-L1蛋白胞外域被表达为与检测标签的融合蛋白，对于PD-1，该标签为免疫球蛋白的Fc部分(PD-1-Ig)，且对于PD-L1，其为6组氨酸基序(6 histidine motif)(PD-L1-His)。所有结合研究均在由补充有0.1% (w/v)牛血清白蛋白和0.05% (v/v) Tween-20的dPBS组成的HTRF测定缓冲液中进行。对于h/PD-L1-His结合测定，将抑制剂与PD-L1-His (最终10nM)一起在4 µl测定缓冲液中预培育15分钟，接着添加在1 µl测定缓冲液中的PD-1-Ig (最终20 nM)且进一步培育15分钟。使用铕穴状化合物标记的抗Ig (最终1 nM)和别藻蓝蛋白(APC)标记的抗His (最终20 nM)实现HTRF检测。在HTRF检测缓冲液中稀释抗体且将5 µl分配于结合反应顶部。使反应混合物平衡30分钟且使用EnVision荧光计获得所得信号(665nm/620 nm的比率)。在人类蛋白PD-1-Ig/PD-L2-His (分别为20&5 nM)和CD80-His/PD-L1-Ig (分别为100&10 nM)之间进行额外的结合测定。
重组蛋白：使具有免疫球蛋白G (Ig)表位标记的C端人类Fc域的人类PD-1 (25-167) [hPD-1 (25-167)-3S-IG]和具有C端His表位标记的人类PD-L1 (18-239) [hPD-L1(18-239)-TVMV-His]于HEK293T细胞中表达且通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法依次纯化。人类PD-L2-His和CD80-His经由市售来源获得。
重组人PD-1-Ig的序列
SEQ ID No 1:
重组人PD-L1-His的序列
SEQ ID No 2:
下表列出PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定中所测量的本公开的代表性实施例的IC50值。范围如下：A = 0.18 nM-0.99 nM；B = 1.0 nM-5.0 nM；C = 5.01 nM-10.1nM；D = 10.2 nM-200 nM；E = 201 nM->10 µM。
式(I)的化合物具有作为PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂的活性，并因此可用于治疗与PD-1/PD-L1相互作用相关的疾病或缺陷。经由抑制PD-1/PD-L1相互作用，本公开化合物可用于治疗感染性疾病，诸如HIV、感染性休克、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或丁型肝炎和癌症。
序列表
<110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY
<120> 可用作免疫调节剂的化合物
<130> 12804WOPCT
<150> US 62/436,674
<151> 2016-12-20
<160> 2
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 384
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
145 150 155 160
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
180 185 190
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
195 200 205
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
210 215 220
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
225 230 235 240
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
245 250 255
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
260 265 270
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
275 280 285
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
290 295 300
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
305 310 315 320
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
325 330 335
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
340 345 350
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
355 360 365
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 2
<211> 238
<212> PRT
<213> 人类
<400> 2
Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile
35 40 45
Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr
50 55 60
Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg
85 90 95
Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys
100 105 110
Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp
115 120 125
Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro
130 135 140
Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly
145 150 155 160
Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val
165 170 175
Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys
180 185 190
Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val
195 200 205
Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Gly Ser
210 215 220
Ser Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly His His His His His His
225 230 235

Claims (15)

1.式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
m是0、1或2；
Z选自-OCH3和-O(CH2)nAr；其中，
n是1、2、3或4；
Ar选自苯基和吡啶基，其中每个环任选地被1、2、3或4个取代基取代，所述取代基独立地选自C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、酰氨基、羧基、氰基、甲酰基、卤素、卤代C1-C4烷基、卤代C1-C4烷氧基和硝基；
A选自-CH2O-、-OCH2-、-(CH2)2-、-CH=CH-、-C(O)NH-和-NHC(O)-，其中每个基团绘制为其左侧连接到R2上并且其右侧连接到苯环上；
R2选自
其中
Rm和Rn独立地选自氢、C1-C3烷基和卤素；
Y选自氢、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基、氰基和卤素；
R5是任选含有一个或两个独立地选自氮和氧的杂原子并含有零个、一个、两个或三个双键的三至十元单环或双环，其中所述环任选地被一个、两个或三个独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷氧基C1-C4烷基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基、二(C1-C4)烷基氨基、氨基、氨基C1-C4烷基、羧基、羧基C1-C4烷基、C3-C4环烷基和苯基的基团取代；
每个R3独立地选自C1-C4烷基、氰基、卤素和卤代C1-C4烷基；
R4选自-CH2OH、-CHO和-(CH2)nNRqR8；其中
n是1、2、3或4；
Rq选自氢和C1-C4烷基；
R8选自氢、C1-C4烷基、-(CH2)nN(CH3)2、
R9选自氢和C1烷基；
每个R9'独立地选自氢和C1-C3烷基；且
R10选自氢和C1-C4烷基；或
R8和Rq与它们所连接的氮原子一起形成环，所述环是；其中
s是0、1 或2；
z是1、2或3；且
每个R14独立地选自C1-C4烷氧基羰基、C1-C6烷基、羧基、卤素、羟基和羟基C1-C4烷基。
2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中m是1且R3是卤素。
3.权利要求2的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z是-OCH2Ar，其中Ar是被氰基取代的吡啶基。
4.权利要求3的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是-CH2O-。
5.权利要求4的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R2是
Y选自氢和C1烷基；
Rn选自氢和C1烷基；且
R5是含有一个氮原子和零个双键的六至八元单环或双环，其中所述环任选被一个选自C1烷基、二(C1-C4)烷基氨基、氨基、羧基C1-C4烷基和C3-C4环烷基的取代基取代。
6.权利要求5的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4是-(CH2)NRqR8；其中，
Rq选自氢和C1烷基；
R8选自和
R9选自氢和C1烷基；
每个R9'独立地选自氢和C1烷基；且
R10选自氢和C1-C4烷基；或
R8和Rq与它们所连接的氮原子一起形成环，所述环是；其中，
s是1；
z是3；且
R14是羧基。
7.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中
m是1；
Z是-O(CH2)nAr；
n是1；
Ar是被一个氰基取代的吡啶基；
A是-CH2O；
R2选自
其中
Rm和Rn独立地选自氢和C1-C3烷基；
Y选自氢和C1-C3烷基；
R5是任选含有一个或两个独立地选自氮和氧的杂原子并且含有零个、一个、两个或三个双键的五至八元单环或双环，其中所述环任选地被一个选自C1-C4烷基、二(C1-C4)烷基氨基、氨基、羧基C1-C4烷基和C3-C4环烷基的基团取代；
R3是卤素；
R4选自-CH2OH、-CHO和-(CH2)nNRqR8；其中
n是1；
Rq选自氢和C1-C4烷基；
R8选自
R9选自氢和C1烷基；
每个R9'独立地选自氢和C1-C3烷基；且
R10选自氢和C1-C4烷基；或
R8和Rq与它们所连接的氮原子一起形成环，所述环是；其中
s是1；
z是1 3；且
R14是羧基。
8.化合物，其选自
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-6-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(2S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(1-环丙基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(2S)-1-(4-((3-(2-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(吡啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(2S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基吡咯烷-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(7-甲基-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(4-甲基-2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(4-(二乙基氨基)环己基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(1-异丙基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(2S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(4-((3-(2-(3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(4-((3-(2-(1-(羧甲基)哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(2S)-1-(4-((3-(2-(8-氧杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
5-((4-氯-2-甲酰基-5-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈；
(R)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)-3-羟基-2-甲基丙酸；
5-((4-氯-2-(羟甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(1-甲基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈；
5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基丙-2-基)(甲基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
5-((5-((3-(2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-4-氯-2-(((1,3-二羟基丙-2-基)氨基)甲基)苯氧基)甲基)烟腈；
5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)(甲基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈；
(S)-1-(4-((3-(2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
5-((5-((3-(2-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-4-氯-2-(((1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)氨基)甲基)苯氧基)甲基)烟腈；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基丙-2-基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈；
5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈；
(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)-L-丝氨酸；
(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)-3-羟基-2-甲基丙酸；
(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)戊酸；
(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)氨基)-3-甲基丁酸；
5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基丙-2-基)(甲基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈；
5-((4-氯-2-(((1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)(甲基)氨基)甲基)-5-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苯氧基)甲基)烟腈；
N-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)-N-甲基-L-丝氨酸；
(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)(甲基)氨基)-3-羟基-2-甲基丙酸；
(S)-2-((5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)(甲基)氨基)戊酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸
(S)-1-(5-氯-2-甲氧基-4-((2-甲基-3-(2-(1-苯基哌啶-4-基)苯并[d]噁唑-5-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((3-(2-(4-(甲氧基羰基)环己基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(4-((3-(2-(4-羧基环己基)苯并[d]噁唑-5-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(3-(1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)喹喔啉-6-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(2S)-1-(4-((3-(3-(8-(叔丁氧基羰基)双环[3.2.1]辛-2-烯-3-基)喹喔啉-6-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(2S)-1-(4-((3-(3-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-3-基)喹喔啉-6-基)-2-甲基苄基)-氧基)-5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(3-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)喹喔啉-6-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；和
(S)-1-(5-氯-2-((5-氰基吡啶-3-基)甲氧基)-4-((2-甲基-3-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)喹喔啉-6-基)苄基)氧基)苄基)哌啶-2-甲酸；
或其药学上可接受的盐。
9.药物组合物，其包含权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
10.增强、刺激和/或增加有此需要的对象中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗可接受的盐。
11.抑制有此需要的对象中的癌细胞生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗可接受的盐。
12.治疗有此需要的对象中的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗可接受的盐。
13.权利要求12的方法，其中所述感染性疾病是由病毒引起的。
14.治疗有此需要的对象中的感染性休克的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗可接受的盐。
15.阻断对象中的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗可接受的盐。
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