CN110051780A - 一种具有增强免疫力功能的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有增强免疫力功能的组合物及其制备方法，属于医药、保健食品加工技术领域，所述组合物由下列重量份的组分制成：三七2～3份、当归2～3份、白芍2～3份、黄芪2～3份、党参3～5份、山药3～5份、黄精3～5份、甘草1～2份；上述组分经提取、过滤、精制、浓缩、干燥等工艺制备得到提取物。本发明按照中医理论组方，通过补血活血、健脾益气、养阴生精，增强人体免疫力，帮助免疫力低下的人群改善畏寒肢冷、精神萎靡、疲倦无力、心悸气短等亚健康状况；所采用的制备工艺能保证原药材中多种活性成分提取完全，同时，提取物日服用量降低，药物引湿性降低。

Description

一种具有增强免疫力功能的组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药、保健食品加工技术领域，具体地说，涉及一种具有增强免疫力功能的组合物及其制备方法。

背景技术

免疫力是指机体抵抗外来侵袭，维护体内环境稳定的能力。久病不愈、长期精神紧张、劳累过度、熬夜、体力劳动减少、运动量小、营养不良、饮食不当等因素，可导致人体免疫力低下，最直接的表现就是容易受到细菌、病毒、真菌等感染而生病。近年来，随着经济社会发展，人们工作生活方式改变，精神压力加大，体力劳动和运动量减少，免疫力低下人群数量逐年上升，人群健康状况较差，引发医疗成本增加、耐用性增强、抗生素滥用等系列社会问题。因此，增强免疫力成为健康产业需要重点解决的问题之一，增强免疫力产品具有较大市场价值。

免疫力低下的临床表现，与中医所说虚症，尤其是气血两虚较为相似，可因气虚不能生血而致血虚，亦可因血虚而致气虚。中医认为，气血乃人之根本，气虚无力、血虚发燥，气血两虚或血气不和，则脏腑经络、形体官窍失之濡养，百病乃变化而生，临床上主要表现为肌体失养失常的病理征象，如面色淡白或萎黄、少气懒言、疲乏无力、形体瘦怯、头晕眼花、心悸失眠、肌肤干燥、手足麻木、妇女月经不调等。此外，中医还认为，血者，水谷之精气也，而肾为先天之本，肾藏精，精血同源，血为精所化，脾胃亏虚、化源不足，则新血不生，故健脾益胃、益肾生精为其治则。

目前，增强免疫力产品较多，大多数产品强调补气或气血同补，多以大补药材为主要成分，这些产品在大补身体的同时，长期使用容易导致上火、脾胃失调、心率加快、血压升高等不良反应。根据中医理论基础，通过补血活血、健脾益气、养阴生精，全面调理人体精、气、血，增强人体免疫力，并降低不良反应发生率的产品，市场上并不多见。此外，现有的中药提取物制备最常用的有水提取和乙醇提取两种方法，采用水提取，大多数成分能被提取，但成分转移率低，提取效率较低，制备提取物引湿性较高，日服用量较大；采用乙醇提取，中药中皂苷、黄酮、内脂等成分转移率高，提取效率较高，但同样具有增强免疫力功效的多糖成分则无法提取，成分提取不完全。因此，在开发补血活血、健脾益气、养阴生精，增强人体免疫力的产品时应当考虑产品质量、稳定性等问题。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种具有增强免疫力功能的组合物及其制备方法，所提供的组方按照君臣佐使配伍，既使中表之气得补，又健脾养胃、养阴生津，具有增强免疫力功能，且安全性较高；同时，制备工艺的改进使得药材活性成分提取完全，日服用量降低，药物引湿性降低，保证产品质量稳定、可控，方便目标人群使用，提高长期服用的依从性。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种具有增强免疫力功能的组合物，组合物各组分的重量份数为：三七2～3份、当归2～3份、白芍2～3份、黄芪2～3份、党参3～5份、山药3～5份、黄精3～5份、甘草1～2份。

组方中，三七性温，味甘、微苦，归肝、胃经，具有补血活血、疏肝理气、散瘀止痛之功效。当归温甘辛，归肝、心、脾经，补血活血、疏肝理气、调经止痛；白芍微寒苦酸，归肝、脾经，平肝止痛、养血调经、敛阴止汗。黄芪温甘，归肺、脾经，补气升阳、益卫固表；党参甘平，归脾、肺经，补中益气、健脾益肺；山药甘平，归脾、肺、肾经，补脾养胃、生津益肺、补肾涩精；黄精甘平，归脾、肺、肾经，补气养阴、健脾益肾。甘草甘平，归心、肺、脾、胃经，既补脾益气，又调和诸药。全方配伍，精、气、血同补，共奏补血活血、健脾益气、补肾生精之功。

上述组合物制备的具体步骤为：

1)按配方量进行备料，三七采用干燥根、根茎，破碎为3～5mm细块；

2)取三七、当归、白芍、黄芪，以药材质量10～20倍的70～80％乙醇分2～3次提取，每次30～60min，合并提取液，过滤；

3)取步骤2)的药渣，以药材质量8～15倍的水分1～2次提取，每次30～60min，合并提取液，过滤，弃药渣；

4)取党参、山药、黄精、甘草，以药材质量10～20倍的水分2～3次提取，每次30～60min，合并提取液，过滤，弃药渣，并将提取液与步骤3)所得提取液合并，浓缩10～20倍；

5)将步骤2)所得乙醇提取液与步骤4)所得浓缩液合并，调整乙醇浓度不低于60％，静置8h以上，分别收集上清液和沉淀；

6)将步骤5)所得的上清液浓缩回收乙醇至无乙醇味，过弱极性大孔吸附树脂，先水洗，再以70～80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩回收乙醇；

7)取步骤5)所得的沉淀，与步骤6)的浓缩液合并，混合均匀，喷雾干燥或真空干燥即得。

本发明的有益效果：

(1)本发明组方以中医理论为基础进行配伍，副作用降低，安全性高，在滋补肝、脾、肾，调理精、气、血等方面，达到药物协同增效作用，具有增强免疫力功能；

(2)本发明提供的制备工艺技术方案，能保证原药材中三七总皂苷、阿魏酸、芍药苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、多糖等多种活性成分提取完全，同时，提取物日服用量降低，药物引湿性降低，可满足不同制剂工艺要求，保证制剂产品的质量稳定、可控，方便目标人群使用，提高长期服用的依从性。

具体实施方式

实施例1

一种具有增强免疫力功能的组合物，通过以下步骤制备：

1)取三七(药材预先破碎至10-20目)40g、当归40g、白芍60g、黄芪60g，加入80％乙醇溶液1000ml，浸泡30min，60～70℃搅拌中保温1h，过滤，滤渣以80％乙醇溶液800ml同法提取2次，合并3次滤液，减压过滤，得滤液1850ml；

2)取经乙醇提取的三七、当归、白芍、黄芪药渣，加入纯化水提取2次，每次加水1000ml、煮沸30min，合并提取液，弃药渣，减压过滤，得滤液870ml；

3)取党参60g、山药60g、黄精60g、甘草20g，加入纯化水1600ml，浸泡30min，煮沸30min，过滤，滤渣分别以1200ml水同法提取2次，合并3次滤液，弃药渣，减压过滤，得滤液2300ml；

4)将步骤2)、3)所得滤液合并，-0.08Mpa、60℃减压浓缩至300ml，然后将步骤1)所得滤液加入到浓缩液中，静置过夜，4000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀；

5)将步骤4)所得上清液-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至200ml，过D101型大孔吸附树脂(柱床体积150ml，预先处理待用)，以纯化水洗至无色，再以70％乙醇600ml洗脱，收集洗脱液，-0.075Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至稠膏状；

6)将步骤4)所得沉淀、步骤5)所得稠膏合并，-0.085Mpa、65℃减压干燥，粉碎过60目筛，即得。

通过上述方法制备得提取物36.48g，计算得提取率为9.12％，人体推荐用量为1.82g/d。

实施例2

一种具有增强免疫力功能的组合物，通过以下步骤制备：

1)取三七(药材预先破碎至10-20目)60g、当归60g、白芍60g、黄芪60g，加入70％乙醇溶液2000ml，浸泡30min，60～70℃搅拌中保温1h，过滤，滤渣以70％乙醇溶液1500ml同法提取2次，合并3次滤液，减压过滤，得滤液3700ml；

2)取经乙醇提取的三七、当归、白芍、黄芪药渣，加入纯化水3000ml，煮沸60min，合并提取液，弃药渣，减压过滤，得滤液1200ml；

3)取党参100g、山药100g、黄精100g、甘草40g，加入纯化水2000ml，浸泡30min，煮沸30min，过滤，滤渣以1500ml水同法提取1次，合并2次滤液，弃药渣，减压过滤，得滤液1800ml；

4)将步骤2)、3)所得滤液合并，-0.08Mpa、60℃减压浓缩至400ml，然后将步骤1)所得滤液加入到浓缩液中，再补加95％乙醇500ml，静置过夜，4000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀；

5)将步骤4)所得上清液-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至400ml，过D101型大孔吸附树脂(柱床体积150ml，预先处理待用)，以纯化水洗至无色，再以80％乙醇1000ml洗脱，收集洗脱液，-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至稠膏状；

6)将步骤4)所得沉淀、步骤5)所得稠膏合并，-0.085Mpa、60℃减压干燥，粉碎过60目筛，即得。

通过上述方法制备得提取物41.23g，计算得提取率为6.65％，人体推荐用量为2.06g/d。

实施例3

一种具有增强免疫力功能的组合物，通过以下步骤制备：

1)取三七(药材预先破碎至10-20目)200g、当归300g、白芍200g、黄芪300g，加入75％乙醇溶液6000ml，浸泡30min，60～70℃搅拌中保温1h，过滤，滤渣以75％乙醇溶液4000ml同法提取1次，合并2次滤液，减压过滤，得滤液7400ml；

2)取经乙醇提取的三七、当归、白芍、黄芪药渣，加入纯化水提取两次，每次5000ml，煮沸40min，合并提取液，弃药渣，减压过滤，得滤液4800ml；

3)取党参300g、山药500g、黄精300g、甘草100g，加入纯化水8000ml，浸泡30min，煮沸30min，过滤，滤渣以6000ml水同法提取1次，合并2次滤液，弃药渣，减压过滤，得滤液8600ml；

4)将步骤2)、3)所得滤液合并，-0.08Mpa、60℃减压浓缩至1200ml，然后将步骤1)所得滤液加入到浓缩液中，再补加95％乙醇1000ml，静置过夜，4000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀；

5)将步骤4)所得上清液-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至600ml，过D101型大孔吸附树脂(柱床体积400ml，预先处理待用)，以纯化水洗至无色，再以80％乙醇1800ml洗脱，收集洗脱液，-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至稠膏状；

6)将步骤4)所得沉淀、步骤5)所得稠膏合并，-0.085Mpa、70℃减压干燥，粉碎过60目筛，即得。

通过上述方法制备得提取物163.46g，计算得提取率为7.43％，人体推荐用量为1.63g/d。

实施例4

一种具有增强免疫力功能组合物，通过以下步骤制备：

1)取三七(药材预先破碎至10-20目)200g、当归200g、白芍200g黄芪300g，加入80％乙醇溶液5400ml，浸泡30min，60～70℃搅拌中保温1h，过滤，滤渣依次以80％乙醇溶液4500ml、3600ml同法提取2次，合并3次滤液，减压过滤，得滤液9500ml；

2)取经乙醇提取的三七、当归、白芍、黄芪药渣，加入纯化水提取2次，每次加水3600ml、煮沸30min，合并提取液，弃药渣，减压过滤，得滤液3200ml；

3)取党参300g、山药500g、黄精300g、甘草100g，加入纯化水8000ml，浸泡30min，煮沸30min，过滤，滤渣分别以6000ml、5000ml水同法提取2次，合并3次滤液，弃药渣，减压过滤，得滤液13000ml；

4)将步骤2)、3)所得滤液合并，-0.08Mpa、60℃减压浓缩至900ml，然后将步骤1)所得滤液加入到浓缩液中，静置过夜，4000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀；

5)将步骤4)所得上清液-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至800ml，过D101型大孔吸附树脂(柱床体积400ml，预先处理待用)，以纯化水洗至无色，再以70％乙醇2000ml洗脱，收集洗脱液，-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至稠膏状；

6)将步骤4)所得沉淀、步骤5)所得稠膏合并，-0.085Mpa、60～70℃减压干燥，粉碎过60目筛，即得。

通过上述方法制备得提取物194.67g，计算得提取率为9.27％，人体推荐用量为1.95g/d。

实施例5

一种具有增强免疫力功能组合物，通过以下步骤制备：

1)取三七(药材预先破碎至10-20目)2kg、当归3kg、白芍2kg、黄芪3kg，加入75％乙醇溶液75L，浸泡30min，60～70℃搅拌中保温1h，过滤，滤渣以75％乙醇溶液50L同法提取2次，合并3次滤液，减压过滤，得滤液130L；

2)取经乙醇提取的三七、当归、白芍、黄芪药渣，加入纯化水提取2次，每次加水40L、煮沸30min，合并提取液，弃药渣，减压过滤，得滤液65L；

3)取党参3kg、山药3kg、黄精5kg、甘草2kg，加入纯化水70L，浸泡60min，煮沸30min，过滤，滤渣分别以50L水同法提取2次，合并3次滤液，弃药渣，减压过滤，得滤液120L；

4)将步骤2)、3)所得滤液合并，-0.08Mpa、60℃减压浓缩至3L，然后将步骤1)所得滤液加入到浓缩液中，静置过夜，倾出上清液，分别收集上清液和沉淀；

5)将步骤4)所得上清液-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至20L，过D101型大孔吸附树脂，以纯化水洗至无色，再以80％乙醇50L洗脱，收集洗脱液，-0.08Mpa、60℃减压回收乙醇，并浓缩至稠膏状；

6)将步骤4)所得沉淀、步骤5)所得稠膏合并，-0.085Mpa、65℃减压干燥，粉碎过80目筛，即得。

通过上述方法制备得提取物1.98kg，计算得提取率为8.67％，人体推荐用量为1.98g/d。

实验分析

一、样品分析检测

1.提取物制备

根据实施例2配方准备物料，即取三七(药材预先破碎至10-20目)60g、当归60g、白芍60g、黄芪100g、党参100g、山药100g、黄精100g、甘草40g，共2份，分别采用水提取法和醇提取法制备提取物，具体操作如下：

水提取物制备：取上述药材，共620g，加入纯化水5L，浸泡1h，煮沸1h，倾出药液，药渣继续提取2次，每次加水5L、煮沸30min，合并提取液，以200目滤布过滤，-0.08Mpa、60～65℃减压浓缩至稠膏状，-0.085Mpa、60～70℃真空干燥箱中减压干燥，粉碎过60目筛，制备得水提取物173.84g。

乙醇提取物制备：取上述药材，共620g，置电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h，粉碎过20目筛，加入75％乙醇5L，浸泡1h，加热保持微沸1h，以200目滤布过滤，滤渣同法再提取2次，合并滤液，-0.08Mpa、60～65℃回收乙醇并浓缩至稠膏状，-0.085Mpa、60～70℃真空干燥箱中减压干燥，粉碎过60目筛，制备得乙醇提取物136.45g。

对照药材制备：三七15g、当归15g、白芍15g、黄芪25g、党参25g、山药25g、黄精25g、甘草10g，共155g，置电热鼓风干燥箱中60℃干燥3h，粉碎过40目筛，作为对照药材，用于成分含量测定和转移率计算。

2.提取物样品检测

通过上述方法制备的3个样品，以及实施例2制备的样品，分别参照《中国药典》(2015年版一部)三七、当归、白芍、黄芪的含量测定方法，检测样品中三七总皂苷、阿魏酸、芍药苷、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量；参照《保健食品功效成分检测方法》(2011年，白鸿主编)粗多糖的含量测定方法检测样品中多糖含量，并在该方法基础上，省略乙醇沉淀处理步骤，检测得样品中总糖含量，通过计算得单糖或低聚糖含量；参照《中国药典》(2015年版四部)药物引湿性试验指导原则测定样品引湿性。

3.实验结果及分析

对各组样品进行提取的得率和日服用量计算，结果见表1。

表1提取得率和日服用量计算

从表1可以看出，与水提取和乙醇溶液提取相比，实施例2制备的样品提取物总量降低，日服用量降低。按照日服用药材31g计算，水提取工艺制备的样品日服用量为8.69g，乙醇提取工艺制备的样品为6.85g，而实施例2制备的样品仅需2.06g。

对各组样品的几种主要功效成分进行检测，并计算转移率，结果见表2。

表2几种主要功效成分检测及转移率

从表2可以看出，与水提取工艺相比，本发明提供的工艺三七总皂苷、阿魏酸、芍药苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷等成分提取转移率高；与乙醇提取工艺相比，本发明提供的工艺多糖转移率高。即本发明提供的工艺，多种功效成分提取完全，转移率较高。

对各组样品的引湿性和糖分含量进行测定，结果见表3。

表3引湿性和糖分含量测定

单糖、低聚糖作为非功效成分，常导致产品引湿性增加，产品不稳定，也给制剂工艺操作带来不便。在引湿性测定过程中，粉末样品称量后置于培养皿中，水提取物、乙醇提取物在实验室环境下放置约30min，即可见表面出现吸潮，粉末颜色由淡黄色变为浅棕色，而实施例2样品未发生变化。在25℃、RH80％条件下放置24h，水提取物、乙醇提取物因吸湿严重，已潮解变为浸膏状；实施例2制备的样品仍然为粉末状。

从表3中可以看出，与水提取和乙醇溶液提取相比，本发明实施例2制备的样品多糖含量较高，而单糖、低聚糖含量较低，样品引湿性降低。

二、增强免疫力功能动物试验

1.实验材料

采用清洁级ICR小鼠，单一性别，体重18～22g，实验前在动物房环境中适应性饲养5天，环境温度20～25℃、相对湿度40～70％。

受试物为本发明实施例3制备的提取物，每个试验项目均设立对照组和不同剂量的实验组，每组10～15只小鼠，其中，实验组按人体推荐用量1.63g/d(60kg·bw)的5倍、10倍、20倍，分别设低、中、高3个实验组(剂量分别为0.14、0.27、0.54g/kg·bw，样品以纯化水配制，配制后2～8℃下保存不超过3d)，所有实验组经口灌胃给予不同剂量的受试样品，灌胃容积为0.2ml/10g·bw，每天1次，连续15～30d，每周称量体重1次，并根据动物体重调整灌胃体积，对照组给予同等容积的纯化水。

2.实验方法

DNFB诱导小鼠迟发变态反应：

选用18～22g雄性小鼠，按体重随机分为5组，每组15只，各组动物每日按剂量灌胃给药1次，连续10d，除空白对照组外，其余各组动物首次给药后1h，在经氯化钡脱毛的腹部皮肤上均匀涂抹1％DNFB(二硝基氟苯)混合液50ul致敏，给药第15天，各鼠右耳两面均匀涂抹1％DNFB混合液10ul进行攻击，24h后颈椎脱臼处死动物，剪下左右两耳，用直径8mm打孔器于同部位切下双耳，称重，左右耳片重量之差即为肿胀度，以肿胀度反映迟发型变态反应程度；同时摘取胸腺和脾脏称重，计算脏器系数。

小鼠血清溶血素测定：

选用18～22g雌性小鼠，按体重随机分为5组，每组15只，各组动物每日按剂量灌胃给药1次，连续25d，每鼠腹腔注射2％绵羊红细胞悬液0.2ml进行免疫，继续给药5d，末次给药后30min，于眼眶静脉取血，放置1h，4000rpm离心10min，取血清用SA缓冲液稀释100倍，取血清稀释液0.25ml、10％绵羊红细胞悬液0.25ml、补体0.25ml依次加入试管中，混合后于37℃恒温30min，置0～4℃冰水中终止反应，离心，取上清液用酶标仪于540nm波长处比色，以不加小鼠血清(以SA缓冲液代替)的空白管调零，测定OD值，计算半数溶血值(HC50)。

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验：

选用18～22g雌性小鼠，按体重随机分为4组，每组12只，各组动物每日按剂量灌胃给药1次，连续30d，末次给药1h，每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml，间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃育温30min，生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞，晾干，以1:1丙酮-甲醇溶液固定，4％Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用纯化水漂洗，晾干，油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，计算吞噬率。

统计分析：

计量资料以X±SD表示，采用方差分析，方差齐，计算F值≥0.05，P≤0.05，用多个试验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计(采用LSD方法)比较试验组与对照组差异性，试验组显著水平取P＝0.05，极显著水平P＝0.01；对非正态分布或方差不齐的数据采用变量转换，或改用秩和检验进行统计分析。

3.实验结果

表4对小鼠脏器系数的影响

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，^△P＜0.05。

由表4可看出，与对照组比较，受试物3个剂量组小鼠脾脏系数无显著性差异；与空白对照组比较，模型对照组小鼠胸腺系数显著降低；与模型对照组比较，受试物中、高2个剂量组小鼠胸腺系数显著升高。

表5对DNFB诱导小鼠迟发变态反应的影响

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，^△P＜0.05。

由表5可看出，与空白对照组比较，模型对照组小鼠耳肿胀度显著增加；与模型对照组比较，受试物低、中2个剂量组小鼠耳肿胀度显著增加。

表6对小鼠血清溶血素的影响

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，^△△P＜0.01。

由表6可看出，与空白对照组比较，模型对照组半数溶血值显著提高；与模型对照组比较，受试物低、高2个剂量组半数溶血值显著降低。

表7对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

注：与空白对照组比较，^△△P＜0.01，^△P＜0.05。

由表7可看出，与空白对照组比较，受试物低、中2个剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力显著提高。

本发明实施例3制备的提取物，按0.14、0.27、0.54g/kg·bw剂量经口给予小鼠15～30d，不同程度提高迟发变态反应小鼠的胸腺指数，能促进免疫器官维持功能；提高DNFB诱导小鼠迟发变态反应程度，具有增强小鼠细胞免疫功能；促进小鼠血清溶血素生成，具有增强小鼠体液免疫功能；提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力，具有增强小鼠单核-巨噬细胞的吞噬功能，据此可以判定，受试样品具有增强免疫力的功能。

三、安全性评价试验

1、实验材料

选用SPF级昆明种小鼠，体重18～22g，实验前适应性饲养1周，饲养环境温度20～26℃(日温差≤3℃)，相对湿度40～70％，换气次数10～20次/h，气流速度0.1～0.2m/s，噪音≤60dB，工作照度＞300lx，动物照度15～20lx，12h明暗交替照明。

受试物为本发明实施例4制备的提取物，人体推荐用量1.95g/d，以纯化水配制为0.1625g/ml悬液，作为最大剂量浓度，并根据实验设计以纯化水稀释为所需给药浓度，样品配制后2～8℃下保存不超过3d。

参照《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》要求，给药方式为灌胃，小鼠急性毒性试验最大给药量为人体推荐用量的200倍，给药体积0.4mL/10g；30天喂养亚急性毒性试验给药剂量分别为人体推荐用量的25、50、100倍，给药体积0.2mL/10g。

2、实验方法

小鼠急性毒性试验：

小鼠适应性饲养1周，禁食不禁水12h，随机分为2组，每组20只，雌雄各半，按照最大给药量法，灌胃给予受试物1次，对照组给予等体积纯化水，给药后2h后投喂饲料，小鼠灌胃给予各样品后连续观察4小时，以后每天至少观察一次，共14天。观察期满后，眼眶静脉取血，用于检测动物肝肾功能；处死动物，解剖检查脏器损伤情况。

小鼠30天喂养亚急性毒性试验：

小鼠适应性饲养1周，随机分为4组，每组20只，雌雄各半，按照人体推荐用量的25、50、100倍每天灌胃给药1次，对照组给予等体积纯化水，每3d称量体重1次，并根据体重调整灌胃体积，连续给药30d，眼眶静脉取血，用于检测动物肝肾功能；处死动物，解剖检查脏器损伤情况。

3、观察指标

试验期间，主要观察动物饮食、外观、行为活动、分泌物、排泄物等是否异常，以及死亡情况、中毒反应症状及其起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆及恢复时间等。

观察期满后，眼眶静脉取血，4000rpm离心10min，分离血清，比色法测定ALT、AST、BUN、Cre；处死动物，解剖检查脏器损伤情况。

对观察期死亡动物进行解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、卵巢、子宫、精囊、前列腺、睾丸、胃、肠及胸腔、腹腔，观察各脏器、器官的体积、颜色、质地等有无异常，查找死亡原因，并对异常脏器进行组织病理学检查，记录动物死亡数。

4、实验结果

在小鼠急性毒性实验中，受试物组有1只雌性小鼠在实验第2天死亡，经解剖检查，发现食道和呼吸道有损伤，胸腔充血明显，主要脏器未发现异常，死亡原因为灌胃失误致死。在试验期间，其它动物饮食、外观、行为活动、分泌物、排泄物正常，未出现中毒反应症状，至观察期结束未出现死亡情况，因此，受试物LD50＞6.50g/kg。

试验观察期间，每3～4d称量动物体重1次，与对照组相比，小鼠体重增长无显著性差异(P＞0.05)，0、7、14d体重称量结果见表8。

表8急性毒性试验小鼠体重观察

观察期满后，与对照组相比，小鼠ALT、AST、BUN、Cre等指标无显著性差异(P＞0.05)，结果见表9。

表9急性毒性试验小鼠肝肾功能检测

在30天喂养亚急性毒性试验中，受试物50倍剂量组有1只雄性小鼠、受试物100倍剂量组有1只雌性小鼠在试验第23天死亡，经解剖检查，为灌胃失误致死；其它动物饮食、外观、行为活动、分泌物、排泄物正常，未出现中毒反应症状，至观察期结束未出现死亡情况。

试验观察期间，每天称量动物体重1次，与对照组相比，小鼠体重增长无显著性差异(P＞0.05)，0、15、30d体重称量结果见表10。

表10 30天喂养亚急性毒性试验小鼠体重

观察期满后，取血检测动物肝肾功能情况。与对照组相比，小鼠ALT、AST、BUN、Cre等指标无显著性差异(P＞0.05)，结果见表11。

表11 30天喂养亚急性毒性试验小鼠肝肾功能检测

动物处死后，解剖取肝、肾、脾等主要脏器，称重，计算脏器系数。与对照组相比，小鼠脏器系数无显著性差异(P＞0.05)，结果见表12。

表12 30天喂养亚急性毒性试验小鼠脏器系数测定

上述试验中采用本发明实施例4制备的提取物，按人体推荐用量200倍单次灌胃给予正常小鼠，未发现与受试物有关的急性毒性反应；按人体推荐用量25、50、100倍灌胃给予正常小鼠30d，未发现与受试物有关的亚急性毒性反应，说明受试样品具有较高安全性。

四、人体试食试验

1、样品制备

取实施例5制备的提取物1600g，加入10％淀粉浆120g，快速湿制粒机上制成软材，过24目筛制粒，电热鼓风干燥箱中60℃下干燥，加入羧甲基淀粉钠80g、硬脂酸镁8g，混合均匀，压片机上压制成0.55g/片，供口服用，人体推荐用量每天2次、每次2片。

2、人群选择

选取18～55岁志愿者，排除患有严重心脑血管疾病人群、妊娠或哺乳期妇女，主诉近期具有畏寒肢冷、疲倦无力、精神萎靡、心悸气短、失眠多梦、头晕耳鸣、易患感冒等免疫力低下症状，受试者30人，其中，男性9人，女性21人。

3、试食方法

采用自身对照设计，参试志愿者试验期间不改变原来的生活习惯，按人体推荐用量服用本品15～30天，试验前、后随访免疫力低下症状改善情况和不良反应发生情况，以免疫力低下症状完全消失、明显改善、有一定改善的例数计算总有效率。

4、试验结果

参与试验人员30人，有1人无法取得联系，作脱离试验处理；参与统计的29人中，免疫力低下症状完全消失6人、明显改善18人、有一定改善4人，无明显改善1人，总有效率96.55％。参与统计的29人中，未出现上火、口腔溃疡、便秘、消化不良、心率加快、血压升高等不良反应。典型病例如下：

刘某，男，46岁，试验前近1个月出现畏寒肢冷、疲倦无力、失眠多梦症状，按人体推荐用量服用本品30天，症状完全消失，经询问，未出现任何与受试物有关的副作用。

邓某，女，36岁，出现精神萎靡、心悸气短、头晕耳鸣等免疫力低下症状2年，半年前曾服用中药方剂气血双补汤，症状改善，但服用15天左右出现口腔溃疡、便秘等上火症状，后停服。现按照每天2次、每次2片服用本品30天，精神萎靡、心悸气短症状明显改善，头晕耳鸣症状有一定改善，未出现上火症状及其它不良反应。

郭某，女，22岁，形体偏瘦，畏寒怕冷，劳累后易感头晕目眩，按照每天2次、每次2片服用本品20天，畏寒怕冷症状消失，劳累后头晕症状明显改善，未出现任何与受试物有关的副作用。

黄某，女，52岁，近1年来易患感冒，劳累后出现心悸气短、头晕耳鸣，3个月前服用中药方剂保元汤，共30天，症状改善，但出现心率加快、血压升高等不良反应，后停服。现按照每天2次、每次2片服用本品30天，心悸气短、头晕耳鸣症状明显改善，未出现心率加快、血压升高及其它不良反应。

李某，男，49岁，出现畏寒肢冷、疲倦无力症状1年余，参与试验前2个月服用中成药人参养荣丸20天，症状明显改善，但出现咽干、咳嗽、便秘、消化不良等不良反应，后停药。参与试验30天，畏寒肢冷、疲倦无力症状明显改善，未出现咽干、咳嗽、便秘、消化不良等不良反应。

从上述4项试验可看出，本发明提供的组合物，能改善畏寒肢冷、疲倦无力、精神萎靡、心悸气短、失眠多梦、头晕耳鸣等免疫力低下症状，使用后不会出现阴虚上火、口腔溃疡、便秘、消化不良、心率加快、血压升高等副作用，能提高免疫力，无毒副作用，安全性高；采用本发明方法制备的提取物，提取效率和功效成分转移率较高，日服用量少，方便人群服用，而且样品引湿性降低，有利于制剂工艺操作和保证质量稳定。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的。

Claims (3)

1.一种具有增强免疫力功能的组合物，其特征在于：所述的具有增强免疫力功能的组合物的组分包括三七、当归、白芍、黄芪、党参、山药、黄精、甘草。

2.根据权利要求1所述的一种具有增强免疫力功能的组合物，其特征在于：组合物各组分的重量份数为：三七2～3份、当归2～3份、白芍2～3份、黄芪2～3份、党参3～5份、山药3～5份、黄精3～5份、甘草1～2份。

3.根据权利要求1或2所述的一种具有增强免疫力功能的组合物的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

1）按配方量进行备料，三七采用干燥根、根茎，破碎为3～5mm细块；

2）取三七、当归、白芍、黄芪，以药材质量10～20倍的70～80%乙醇分2～3次提取，每次30～60min，合并提取液，过滤；

3）取步骤2）的药渣，以药材质量8～15倍的水分1～2次提取，每次30～60min，合并提取液，过滤，弃药渣；

4）取党参、山药、黄精、甘草，以药材质量10～20倍的水分2～3次提取，每次30～60min，合并提取液，过滤，弃药渣，并将提取液与步骤3）所得提取液合并，浓缩10～20倍；

5）将步骤2）所得乙醇提取液也步骤4）所得浓缩液合并，调整乙醇浓度不低于60%，静置8h以上，分别收集上清液和沉淀；

6）将步骤5）所得的上清液浓缩回收乙醇至无乙醇味，过弱极性大孔吸附树脂，先水洗，再以70～80%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩回收乙醇；

7）取步骤5）所得的沉淀，与步骤6）的浓缩液合并，混合均匀，喷雾干燥或真空干燥即得。