CN110003351B - 一种硫酸化凉粉草多糖及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多糖的结构改造技术领域，具体涉及一种硫酸化凉粉草多糖及其制备方法，属于多糖的结构改造技术领域。提取、纯化凉粉草多糖，用氯磺酸‑吡啶法进行硫酸化修饰，以产物对RAW264.7细胞的保护作用为指标，用正交实验对试剂配比、反应温度和反应时间三个因素进行优选，确定最佳修饰条件为氯磺酸与吡啶的质量比1∶2，反应温度60℃，反应时间90min，所得硫酸化凉粉草多糖对RAW264.7细胞的保护作用最强，可以通过提高SOD的水平和降低MDA的含量发挥保护作用。本发明能显著提高凉粉草多糖对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用。

Description

一种硫酸化凉粉草多糖及其制备方法
技术领域
本发明属于多糖的结构改造技术领域，具体涉及一种硫酸化凉粉草多糖及其制备方法。
背景技术
多糖广泛存在于动物、植物和微生物组织中，是由单糖聚合而成的天然高分子化合物，是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等生物活性。多糖的生物活性与其结构有着密切的关系，特别是当引入某些化学基团时，使糖链的柔韧性和空间结构发生变化，从而引起多糖的生物学活性改变或使多糖产生新的活性。因此，对多糖结构进行适当的化学修饰是多糖领域研究的热点。
多糖的化学修饰主要有硫酸化、磷酸化、硒化等方法。由于硫酸化修饰能显著影响多糖的活性而倍受关注。常用硫酸化修饰方法有浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法、三氧化硫-吡啶法等。其中氯磺酸-吡啶法以其试剂易制备、反应条件相对简单、产物回收方便等优点而最为常用。
凉粉草又名仙草，在中国已被用作重要的医药和食用植物资源，通常用作草药茶和果酱型甜点和食用凝胶生产中的食品成分。多糖是凉粉草的主要成分之一，能同其他食用胶进行复配，具有功能互补、协同增效的作用，借此可以开发有增稠、胶凝、充当膳食纤维等许多功能的一系列食品添加剂，使其可以更经济、有效地应用于食品加工领域并发挥重要的作用。同时，凉粉草多糖具有多种生物活性，包括抗肿瘤，抗病毒，降血糖，免疫调节等功效，而凉粉草多糖对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用效果不太显著。在已有中国专利申请中，专利申请号为“201210461709.2”，名为“凉粉草多糖及其制备方法和其应用”的专利，申请号为“201810815176.0”名称为“一种凉粉草酸性多糖的脱色方法”的申请以及专利申请号为“201811113554.7”，名称为“一种凉粉草多糖含量的检测方法”的申请，主要是凉粉草多糖的制备，以及多糖精制及多糖含量的测定方面的研究。到目前为止，尚未见到凉粉草多糖化学修饰的文献报道，也未见通过化学修饰的方法提高凉粉草多糖对RAW264.7氧化应激的保护作用的文献报道。
本发明首次对凉粉草多糖进行硫酸化修饰，建立了凉粉草多糖的硫酸化修饰方法，基于产物对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用优化了修饰条件，发现硫酸化修饰能显著提高凉粉草多糖对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用。
发明内容
技术问题本发明针对多糖生物活性低的问题，提供一种提高凉粉草多糖对RAW264.7细胞氧化应激保护作用的硫酸化修饰方法，达到显著提高凉粉草多糖对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用的目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种硫酸化凉粉草多糖，所述硫酸化凉粉草多糖采用氯磺酸-吡啶法对凉粉草多糖进行硫酸化修饰，其取代度为0.52，可提高RAW264.7细胞氧化应激保护作用。
进一步地，所述氯磺酸-吡啶法的修饰条件为氯磺酸与吡啶的体积比1∶2，反应温度60℃，反应时间2h。
上述硫酸化凉粉草多糖的制备方法，包括以下步骤：
A.凉粉草多糖的提取：凉粉草粉碎后用9倍体积的80％乙醇浸泡20h，残渣阴凉处风干；预处理后的凉粉草加入15倍体积的水溶液，沸水提取2h，上清液用120目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩离心，得到凉粉草粗多糖溶液；
B.凉粉草多糖的纯化：凉粉草粗多糖溶液用80％乙醇在4℃下醇沉20h，重复4次后上D301大孔树脂层析柱，用0.2M的NaCl溶液洗脱树脂柱，流速控制在1.8mL/min，收集洗脱液；浓缩、透析去除小分子物质，冷冻干燥，得中性均一的凉粉草多糖(MP)；
C.酯化试剂制备：将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰浴中，按氯磺酸与吡啶的体积比1∶2的配比加入预冷的无水吡啶，快速搅拌，充分冷却后，逐滴加入氯磺酸，于40min内加完，见烧瓶中出现大量固体时停止反应；
D.修饰操作：取凉粉草多糖(MP)混悬于N，N-二甲基甲酰胺后，加入到酯化试剂中，反应温度60℃，反应时间2h在水浴中振荡反应；反应结束后冷却至室温，用饱和氢氧化钠溶液中和pH至7，80％醇沉20h，离心，取沉淀用水透析，透析液冷冻干燥，得到硫酸化凉粉草多糖，取代度为0.52。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.建立了凉粉草多糖的硫酸化修饰方法，以产物对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用为指标，通过正交实验优化了凉粉草多糖的硫酸化修饰条件。
2.证明硫酸化修饰能够显著提高凉粉草多糖对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用，并筛选出一种对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用最好的硫酸化凉粉草多糖，为研制抑制氧化应激剂提供材料。
附图说明
图1为MP和SMP3的红外光谱图；
图2为SMP3对SOD和MDA的影响。
具体实施方式
1.凉粉草多糖的提取
凉粉草粉碎后用9倍体积的80％乙醇浸泡20h，残渣阴凉处风干。预处理后的凉粉草加入15倍体积的水溶液，沸水提取2h，上清液用120目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩离心，得到凉粉草粗多糖溶液。
2.凉粉草多糖的纯化
凉粉草粗多糖溶液用80％乙醇在4℃下醇沉20h，重复4次后上D301大孔树脂层析柱，用0.2M的NaCl溶液洗脱树脂柱，流速控制在1.8mL/min，收集洗脱液。浓缩、透析去除小分子物质，冷冻干燥，得中性均一的凉粉草多糖(MP)。
3.凉粉草多糖的硫酸化修饰
(1)修饰条件优化：由于试剂配比、反应温度、反应时间是影响多糖硫酸酯化的主要因素，在预实验的基础上，以氯磺酸与吡啶的体积比(A)、反应温度(B)和反应时间(C)为因素，按3因素3水平试验设计9种修饰条件(表1)。
表1.因素和水平设计
Figure BDA0002020215900000041
(2)酯化试剂制备：将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰浴中，按表2设定的试剂配比加入预冷的无水吡啶8mL，快速搅拌，充分冷却后，逐滴加入氯磺酸，于40min内加完，见烧瓶中出现大量固体时停止反应。共制备9种酯化试剂。
(3)修饰操作：取凉粉草多糖(MP)5.4g平均分成9份，分别混悬于N，N-二甲基甲酰胺后，加入到酯化试剂中，按表2设定的反应温度和时间在水浴中振荡反应。反应结束后冷却至室温，用饱和氢氧化钠溶液中和pH至7，80％醇沉20h，离心，取沉淀用自来水透析2天、蒸馏水透析1天，透析液冷冻干燥，分别得到9个硫酸化凉粉草多糖(SulfatedMPs，SMPs)，依次标记为SMP1-SMP9。用苯酚-硫酸法测定多糖含量，氯化钡-明胶法测定硫酸根含量，按下式计算取代度(DS)：DS＝(1.62×S％)/(32-1.02×S％)
表2.修饰实验设计
Figure BDA0002020215900000042
Figure BDA0002020215900000051
试验结果显示，SMPs的产物量、取代度和糖含量均不同。
4.硫酸化凉粉草多糖对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用比较
首先测定9个SMPs和未修饰的MP对RAW264.7细胞的安全浓度，然后比较它们对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用。
(1)SMPs对RAW264.7的安全浓度
取对数生长期RAW264.7细胞，以2×105个/mL的细胞浓度以每孔100μL均匀铺于96孔板。用DMEM培养基培养，在5％CO2存在下37℃培养箱中培育4h至细胞贴壁。
将9个SMPs和未修饰的MP分别用DMEM培养基稀释至10-1000μg/mL共10个浓度。待RAW264.7细胞贴壁后移除培养基，分别加入各浓度的多糖，每孔100μL，每个浓度重复6孔，37℃、5％CO2存在下继续培养，按CCK-8法用酶联免疫检测仪测定450nm波长处的吸光值(A450值)。选择A450值不显著低于细胞对照组的多糖最大浓度作为该多糖的最大安全浓度。
结果显示测得各多糖的最大安全浓度在20-100μg/mL之间。
(2)SMPs对RAW264.7细胞氧化损伤的保护能力比较
将9个SMPs和未修饰的MP用DMEM培养基分别稀释为20，40，60，80，100μg/mL共5个浓度，待RAW264.7贴壁后，移除培养基，先加多糖、培育24h后加入H2O2(200μM)。每孔100μL，同时设置阴性和空白对照组。37℃、5％CO2存在下继续培养，按CCK-8法测定细胞A450值，作为保护氧化应激的指标。当多糖组的A450值显著大于阴性对照组时，表明多糖显著保护RAW264.7免受氧化应激损伤。当SMPs组的A450值显著大于MP组时，表明硫酸化修饰显著提高MP对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用。
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100％
结果表明，大多数硫酸化凉粉草多糖对RAW264.7细胞的保护作用强于未修饰的凉粉草多糖，其中SMP3组对于RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用最好，在糖浓度为100μg/mL时，细胞存活率可达到95.73±0.42％。
表3.SMP3对H2O2诱导RAW264.7氧化损伤的保护作用结果
Figure BDA0002020215900000061
5.硫酸化凉粉草多糖SMP3的红外光谱分析
结果如图1所示，SMP3的红外光谱中出现了1260cm-1是S-O不对称伸缩振动峰和814cm-1代表C-O-S对称伸缩振动峰，这些吸收峰证实硫酸酯基团成功地结合到MP的结构中。
6.超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量测定
使用市售碧云天试剂盒(碧云天)测定SOD和MDA的水平。通过BCA蛋白质测定试剂盒(碧云天)定量蛋白质浓度。
结果如图2所示，SMP3相比于MP可以提高SOD的水平，降低MDA的含量。表明SMP3可以提高对细胞氧化损伤的保护作用。
以上结果表明，硫酸化修饰能显著提高凉粉草多糖对RAW264.7细胞氧化应激的保护作用，其中SMP3的保护作用最强，并且SMP3可以提高细胞SOD水平和MDA含量。其硫酸化修饰条件可以作为最佳修饰条件，即氯磺酸与吡啶的体积比1∶2，反应温度60℃，反应时间90min。

Claims (1)

1.一种硫酸化凉粉草多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.凉粉草多糖的提取：凉粉草粉碎后用9倍体积的80％乙醇浸泡20h，残渣阴凉处风干；预处理后的凉粉草加入15倍体积的水溶液，沸水提取2h，上清液用120目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩离心，得到凉粉草粗多糖溶液；
B.凉粉草多糖的纯化：凉粉草粗多糖溶液用80％乙醇在4℃下醇沉20h，重复4次后上D301大孔树脂层析柱，用0.2M的NaCl溶液洗脱树脂柱，流速控制在1.8mL/min，收集洗脱液；浓缩、透析去除小分子物质，冷冻干燥，得中性均一的凉粉草多糖(MP)；
C.酯化试剂制备：将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰浴中，按氯磺酸与吡啶的体积比1∶2的配比加入预冷的无水吡啶，快速搅拌，充分冷却后，逐滴加入氯磺酸，于40min内加完，见烧瓶中出现大量固体时停止反应；
D.修饰操作：取凉粉草多糖(MP)混悬于N，N-二甲基甲酰胺后，加入到酯化试剂中，反应温度60℃，反应时间2h在水浴中振荡反应；反应结束后冷却至室温，用饱和氢氧化钠溶液中和pH至7，80％醇沉20h，离心，取沉淀用水透析，透析液冷冻干燥，得到硫酸化凉粉草多糖，取代度为0.52。
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