CN102924621B

CN102924621B - 凉粉草多糖及其制备方法和其应用

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Publication number: CN102924621B
Application number: CN201210461709.2A
Authority: CN
Inventors: 冯涛; 庄海宁; 王旭
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2032-11-16
Also published as: CN102924621A

Abstract

本发明公开了一种凉粉草多糖的制备方法，即将凉粉草全草进行干燥、粉碎得到凉粉草全草粉和浓度为1.0～2.0%的碳酸钠水溶液混合后控制温度为93～97℃，时间为1.3～1.7h进行浸提后过滤，所得的滤液用10%的双氧水控制温度为45～55℃下进行脱色，脱色完成后使用10K中空纤维膜管进行超滤纯化，超滤纯化后所得的滤液加入为滤液体积70%的无水乙醇，然后控制温度为4℃，2-8h后，控制转速为5000rpm离心后收集沉淀并进行冻干即得凉粉草多糖。本发明所得的凉粉草多糖具有抗辐射作用。

Description

凉粉草多糖及其制备方法和其应用

技术领域

本发明涉及一种凉粉草多糖及其制备方法和其在抗辐射活性方面的应用。

背景技术

在我国凉粉草作为中草药和制作凉粉冻的原料已有悠久的历史。目前对凉粉草的研究大多限于全草，但对凉粉草中的具体成分，特别是凉粉草多糖的研究有限，目前关于提取凉粉草全草多糖的报道，主要采用水提取醇沉法，该方法的得率为20%，乙醇的用量大概为提取液体积的2.33倍，因此该方法制备的凉粉草全草多糖得率不高，而且所需乙醇量较大，纯化效率为5h/g，纯化得率20%，所得的凉粉草全草多糖的分子量约为16264 Da，其所含单糖的摩尔比组成为半乳糖：葡萄糖：阿拉伯糖：糖醛酸=3.1：2.3：2.3：1.4，其抗辐射等生物学活性不高。

发明内容

本发明的目的之一是为了解决上述的水提取醇沉法最终所得凉粉草多糖分子量低、抗辐射生物活性不高等的技术问题而提供一种利用弱碱液提取醇沉法制备的一种具有分子量高、抗辐射生物活性优良的凉粉草多糖，且该制备方法纯化得率高，乙醇用量少。

本发明的目的之二在于将上述所得的凉粉草多糖应用于抗辐射活性的研究，进而开拓凉粉草多糖的应用范围。

本发明的技术原理

多糖广泛存在于自然界，是来自高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是构成生命活动的四大基本物质之一，并与维持生命所需的多种生理功能密切相关。近20年来，由于生物学、化学等学科的飞速发展，大量研究表明多糖具有清除多种活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的抗氧化作用，其作用机理，可能的解释有如下几种：(1)直接作用于ROS本身。 (2)多糖分子作用于抗氧化酶。(3)多糖分子络合产生ROS所必需的金属离子。(4)促进SOD从细胞表面释放。多糖的抗辐射活性与抗氧化活性具有正相关关系。

本发明的技术方案

一种凉粉草多糖的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）、将凉粉草全草进行干燥、粉碎得到凉粉草全草粉，将凉粉草全草粉用浓度为1.0～2.0%的碳酸钠水溶液混合后控制温度为93～97℃，时间为1.3～1.7h进行浸提后过滤；

其中所述的凉粉草全草粉和浓度为1.0～2.0%的碳酸钠水溶液的用量按质量比计算，即凉粉草全草粉：浓度为1.0～2.0%的碳酸钠水溶液为9～11g：250mL；

（2）、步骤（1）所得的滤液用10%的双氧水进行脱色，脱色过程中控制温度为45～55℃；

滤液和10%的双氧水的量按体积比计算，即滤液：10%的双氧水为5：1；

（3）、步骤（2）脱色完成后使用10K中空纤维膜管进行超滤纯化；

（4）、步骤（3）超滤纯化后所得的滤液加入为滤液体积70%的无水乙醇，然后控制温度为4℃，2-8h后，控制转速为5000rpm进行离心15-20min后收集沉淀并进行冻干即得凉粉草多糖。

上述制备方法所得的凉粉草多糖，其分子量约为43672 Da，所得的凉粉草多糖中所含的单糖按摩尔百分比计算，其组成及含量如下：

半乳糖醛酸为15.17%，半乳糖为16.95%，甘露糖为2.158%，鼠李糖为 0.6135%，葡萄糖醛酸为1.187%，葡萄糖为45.38%，木糖为5.235%，阿拉伯糖为7.641%。

其中葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：葡萄糖醛酸：鼠李糖的摩尔比为38.2：14.3：12.8：6.44：4.41：1.82：1：0.52，特别是半乳糖：葡萄糖：阿拉伯糖：糖醛酸的摩尔比为14.3：38.2：6.44：13.8；

上述所得的凉粉草多糖在抗辐射方面的应用

本发明以小鼠作为实验动物，研究了凉粉草多糖对小鼠的生存防护效力和对受辐射小鼠造血系统及免疫器官重量的影响。结果显示，通过口服凉粉草多糖的小鼠经辐照后的生理状态验证的。经辐射后，服用了凉粉草多糖的小鼠要比没有服用凉粉草多糖的小鼠有更高的存活率和更好的生理状态。而凉粉草多糖经部分酸水解、去酯化和羧基还原后生成MBG-P0.2H、MBG-D和MBG-R，其抗辐射能力均明显下降，由此表明了凉粉草多糖在抗辐射方面的性能。

本发明的有益效果

本发明的一种凉粉草多糖的制备方法，由于采用弱碱液提取醇沉法结合最佳的碳酸钠提取液的百分比浓度、凉粉草原料与碳酸钠提取液的料液比、水浴锅提取所需时间等三个因素，最终所得的凉粉草多糖的得率相对于现有的水提取醇沉淀法提高了20%，同时可节省70%乙醇的使用量。

进一步，本发明的一种凉粉草多糖的制备方法，由于采用了弱碱液提取醇沉法，较好地保留了凉粉草多糖中具有产生抗辐射能力的活性部位，如支链结构、甲酯化结构以及羧基（醛羧基），因此本发明的一种凉粉草多糖具有抗辐射能力，能够提高受辐射小鼠的存活率，能够降低辐射对小鼠的造血系统和免疫器官的伤害。

进一步，本发明的一种凉粉草多糖的制备方法，由于制备过程中采用了中空纤维管的超滤技术进行纯化，因此大大提高了凉粉草多糖的纯化效率和纯化得率，其纯化效率提高50%以上，纯化得率提高约20%，且该纯化技术不会对环境造成污染，因此适于工业化生产。

进一步，对凉粉草多糖的由于制备过程中使用弱碱液提取醇沉技术以及采用超滤装置，所以最终的凉粉草多糖中不含有机溶剂及树脂中的单体残留物，因此不会产生含大量有机溶剂的废水及树脂洗脱液，对环境有益，适于规模化生产。

附图说明

图1、经过10K膜管超滤后溶液的分子量分布色谱；

图2、标准单糖的高效液相色谱图；

图3、10K膜管超滤处理的凉粉草多糖溶液单糖组成的高效液相色谱测定图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

本发明的实施例中所得的凉粉草多糖中总糖含量用苯酚-硫酸法测定，具体参见：张双风，林香娟，于村．苯酚－硫酸法测定胖大海凉茶中多糖的研究.河南预防医学杂志.2000，11(3)：144-145．；

本发明的实施例中所得的凉粉草多糖中还原糖含量用3，5-二硝基水杨酸（DNS）显色法测定，具体参见：宋占午，王莱，刘艳玲．3,5-二硝基水杨酸测定还原糖含量的条件探讨．西北师范大学学报（自然科学版）.1997，33(2)：52-55．；

凉粉草多糖含量=总糖含量-还原糖含量。

本发明所用的各种设备的型号及生产厂家的信息如下表。

名称	型号	厂家
			电子天平	JY2002型	上海精密科学仪器有限公司
精密电子天平	RS-232型	上海恒平科学仪器有限公司
			电热恒温水浴锅	H.H.S型	上海医疗器械五厂
电热恒温鼓风干燥箱	DHG-9146A型	上海精宏试验设备有限公司
			粉碎机	JFSD-100型	上海嘉定粮油仪器有限公司
离心分离机	Anke TDL-5型	上海安亭科学仪器厂
			可见分光光度计	722S型	上海精密科学仪器有限公司
真空冷冻干燥机	LGS-4试验型	江苏省海门市轻工机械四厂
			紫外可见分光光度计	UV757CRT	上海精密科学仪器有限公司
西门子电冰箱	KK26E28TI型	西门子中国有限公司
			中空纤维素超滤膜管	10K型	华东理工大学膜工程研究所
高效液相色谱仪	Waters 600 HPGPC	美国Waters公司

本发明中所指的凉粉草多糖的纯化效率是指采用该技术纯化每单位凉粉草多糖样品，即采用乙醇沉淀后所得凉粉草多糖样品所需要的时间（是指制备步骤中的第4步骤）；

所指的凉粉草多糖的纯化得率是指采用从每单位凉粉草全草粉经本发明制备方法后最终得到的凉粉草多糖的质量的百分比。

实施例 1

一种凉粉草多糖，其制备过程包括如下步骤：

（1）、将凉粉草全草进行干燥、粉碎，控制粉碎粒度为50～100目；

在水浴锅中将9g凉粉草全草粉和250mL浓度为1.5%的碳酸钠水溶液混合后控制温度为95℃浸提1.5h，所得的提取液用医用纱布，两层纱布过滤进行过滤使凉粉草渣过滤干净；

（2）、步骤（1）所得的滤液每100mL用20mL 10%的双氧水进行脱色，脱色过程中控制温度为50℃；

（4）、步骤（3）超滤纯化后所得的滤液加入料液体积70%的无水乙醇，然后控制温度为4℃，2-8h后，控制转速为5000rpm，时间为15-20min离心，收集沉淀置于-30℃的冷柜中进行冻干即得3.6g的凉粉草多糖。

上述的一种凉粉草多糖制备方法，凉粉草多糖的纯化效率为2.5h/g，纯化得率为40%。

通过Waters 600高效凝胶过滤色谱(HPGPC)测定上述所得的凉粉草多糖的相对分子量，结果如图1所示，从图1中可以看出该多糖由4种不同分子量的级分组成，其中46372为多糖部分，其余为低聚糖或小分子杂质。

上述测定过程中具体操作条件为：色谱柱 Ultrahydrogel™ Linear 300mm×7.8mmid×2；流动相：0.1mol/L 硝酸钠；流速：0.9mL/min；柱温：45℃；检测器：2410差式折光检测器。

测定过程中分别选用右旋糖苷 T-2000 (Mw2,000,000), 右旋糖酐 T-190 (Mw188,000), 右旋糖酐T-10 (Mw10,000), 右旋糖酐 T-3 (Mw2,800), 右旋糖酐 T-0.3 (Mw280) (Pharmacosmos Co. Ltd.,Denmark)作为标准分子量。

通过高效液相排阻色谱对实施例1步骤（3）经过10K膜管超滤后溶液进行分子量分布的测定，获得该多糖的分子量分布特征，结果如表1所示：

表1、经过10K膜管超滤后溶液色谱分析数据

峰名	数均分子量Mn	重均分子量Mw	尖峰分子量Mp	含量%
					Peak3	48679	77040	46372	6.64
Peak2	1216	3372	1015	31.25
					Peak1	85	114	95	35.44
Peak4	15	20	26	26.67

从表1可以得出，经过10K膜管超滤后溶液中多糖(Mw=77040)的保留量为6.64%。

通过Agilent 1200仪器（美国安捷伦公司）对上述所得的凉粉草多糖溶液中的单糖组成进行测定，具体的测定方法如下：

称取经截留分子量10K的中空纤维素膜超滤所得的凉粉草多糖23mg，再加入4mL 2mol/L的三氟乙酸并于121℃，0.1MPa下水解1h，将水解液旋转蒸发至干后，再加入10mL色谱纯的甲醇溶解，最后将此甲醇溶液置于真空度为0.1MPa，40℃的真空干燥箱内蒸干，得到凉粉草多糖干样；

将上述所得的凉粉草多糖干样加入5mL色谱级甲醇溶解后取100μL并加100μL还原胺化试剂(0.7g对氨基苯甲酸+0.1gNaCNCH₃+1mL HAc)，在70℃反应30min，冷却稀释至1mL，最后加甲醇定容到10mL，即可进行测定。

　　测定过程的色谱条件：柱温30℃，流速0.8mL/min，色谱柱为Atlantis C18，柱长4.6×250mm，检测波长203nm，进样量5μL。

　　测定过程的洗脱条件：流动相缓冲液为0.05mol/L，流动相采用50mmol/L四丁基硫酸氢胺溶液(A)和50%的四丁基硫酸氢胺甲醇溶液(B)在不同时间按不同体积混合后梯度洗脱，梯度条件为：0min，A/B=95/5；40min，A/B=90/10；45min，A/B=80/20；49min，A/B=50/50；60 min，A/B=95/5。

　　选取的标准单糖的高效液相色谱图如图2所示，其单糖及其对应的质量浓度分别如下：

D-Man(4.077mg/mL)，D-Gal(4.052mg/mL)，D-Glc(4.096mg/mL)，D-Xyl(4.041mg/mL)，D-Rha(3.991mg/mL)，D-Rib(3.723mg/mL)，Ara(1.004mg/mL)，Fuc(1.005mg/mL)，GlcA(1.975mg/mL)，GalA(3.935mg/mL)。

最终凉粉草多糖中单糖的高效液相色谱图如图3所示，从图3中可以看出凉粉草多糖中的主要单糖组成为葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖，其摩尔百分比分别为45.38、16.95、15.17和7.641%。其余单糖组成的具体结果如表2所示：

应用实施例 1

将实施例1所得的凉粉草多糖用于抗辐射活性的研究

（1）、凉粉草多糖抗辐射效力即生存防护效力的测定

将小鼠随机分为三组：

正常对照组：正常饲养，不作辐射；

辐射对照组：每只小鼠口服0.9%生理盐水(与凉粉草多糖等体积)后，置于 7.5Gy剂量的γ-射线下进行辐射；

(凉粉草多糖（MBG）+辐射)组：小鼠连续口服凉粉草多糖(每天10mg/kg 体重)3天。第3天，当服用凉粉草多糖30min后，置于7.5Gy剂量的γ-射线下进行辐射。

每天观察三组小鼠的死亡率。辐射30天后，分别计算在每组的小鼠存活率和生存防护效力的测定，其中生存防护效力=(凉粉草多糖+辐射组)30d平均存活天数／辐射组30d平均存活天数，结果见表3：

与正常对照组比较：·^*P<0.05 ··^**P<0.01 ···^***P<0.001（其中P是指在不同显著性水平上的概率，若P小于该显著性水平，表明两组数据之间差异显著）

从表3中可以看出正常对照组小鼠30d存活率为100%，且体重明显增加，辐射对照组小鼠则出现食欲下降、松毛、活动减少、稀便、体重无增加或显著下降等情况。（MBG+辐射）组的动物上述情况均明显改善，30d存活时间及存活率均明显高于辐射对照组，且在12.5～50mg/kg范围内呈剂量-效应关系，最高生存防护效力达3.46，最高存活率为辐射对照组的8.6倍，由此表明了凉粉草多糖对辐射具有生存防护能力。

（2）、凉粉草多糖对受辐射小鼠造血系统及免疫器官重量的影响

凉粉草多糖对小鼠受辐射后造血系统的影响：

小鼠40只，随机分为3组：正常对照组、辐射对照组、（MBG+辐射）组；

正常对照组（即不经辐射及喂养凉粉草多糖），分别于开始算起、第4天和第10天分别以静脉取血，并采用Cell-Dyn3500R全自动血球分析仪检测白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)和血小板数(PLT)，结果见表4；

辐射对照组，每只小鼠口服0.9%生理盐水(与凉粉草多糖等体积)后，置于 7.5Gy剂量的γ-射线下进行辐射，于辐射照射开始、辐射照射后第4天和第10天分别以静脉取血并采用Cell-Dyn3500R全自动血球分析仪检测白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)和血小板数(PLT)，结果见表4；

（MBG+辐射）组，每只小鼠连续口服凉粉草多糖(每天10mg/kg体重)3天，第3天，当服用凉粉草多糖35min后，置于7.5Gy剂量的γ-射线下进行辐射，于辐射照射开始、辐射照射后第4天和第10天分别以静脉取血并采用Cell-Dyn3500R全自动血球分析仪检测白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)和血小板数(PLT)，结果见表4；

同时在末次取血后分别对正常对照组、辐射对照组、（MBG+辐射）组称重，处死动物，称脾重和胸腺重，结果见表4。

与正常对照组比较：·^ΔP<0.05 ··^ΔΔP<0.01与辐射对照组比较：·^*P<0.05 ··^**P<0.01（其中P是指在不同显著性水平上的概率，若P小于该显著性水平，表明两组数据之间差异显著）

从表4中可以看出辐射照射后第4天和第10天，辐射对照组和（凉粉草多糖（MBG）+辐射）组的WBC、RBC和PLT与正常对照组的WBC、RBC和PLT比较均有显著降低，其中（MBG+辐射）组则能显著抑制上述各指标的降低，表明凉粉草多糖对辐射所致造血系统损伤有显著防护作用。

进一步，辐射对照组小鼠脾指数和胸腺指数均明显低于正常对照组，（MBG+辐射）组动物脾指数也有所降低。但显著高于辐射对照组，由此表明凉粉草多糖对动物胸腺指数也有轻度提高，但与辐射对照组无显著差异，由此表明了凉粉草多糖对于受到辐射的小鼠的造血系统和免疫器官具有保护能力。

（3）、凉粉草多糖抗辐射损伤机制的研究

为了解凉粉草多糖抗辐射的活性中心的结构与功能之间的对应关系。对凉粉草多糖（MBG）进行相应的改性：

采用5mL的0.2mol/L TFA(三氟乙酸)对按照实施例1的制备方法所得的100 g的凉粉草多糖进行水解，凉粉草多糖水解所得产物记为MBG-P0.2H；

取按照实施例1的制备方法所得的150g的凉粉草多糖于具塞反应瓶中，加入0.2mol/L NaOH溶液15mL于室温反应1h(充N₂)，乙酸中和，透析(截留Mw 12,000 Da)，浓缩后冻干，得去酯的凉粉草多糖样品命名为MBG-D；

采用5mL量的浓度为0.5mol/L NaBH₄对按照实施例1的制备方法所得的200g的凉粉草多糖进行羧基还原，凉粉草多糖的羧基还原样品命名为MBG-R；

分别按（1）所述的凉粉草多糖抗辐射效力即生存防护效力的测定方法来评价凉粉草多糖进行上述的不同的改性后凉粉草多糖产品各自的抗辐射效力，结果见表5：

与辐射对照组比较：·^*P<0.05 ··^**P<0.01 ···^***P<0.001（其中P是指在不同显著性水平上的概率，若P小于该显著性水平，表明两组数据之间差异显著）

从表5中可以看出，在凉粉草多糖发生部分酸水解，去酯化或羧基还原后，其抗辐射能力均明显下降，由此表明凉粉草多糖的支链结构、甲酯化结构以及羧基（醛羧基）是凉粉草多糖产生抗辐射能力的活性部位。

综上所述，本发明的一种凉粉草多糖具有抗辐射活性，能够提高受辐射小鼠的存活率，能够降低辐射对小鼠的造血系统和免疫器官的伤害。其抗辐射活性是其支链结构、甲酯化结构以及羧基（醛羧基）。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种凉粉草多糖在降低辐射对小鼠的造血系统和免疫器官的伤害的应用，所述的凉粉草多糖通过Waters 600高效凝胶过滤色谱测定，其相对分子量为43672Da；

所述的凉粉草多糖中所含的单糖按摩尔百分比计算，其组成及含量如下：

半乳糖醛酸为15.17%，半乳糖为16.95%，甘露糖为2.158%，核糖为0.6135%，鼠李糖为5.657%，葡萄糖醛酸为1.187%，葡萄糖为45.38%，木糖为5.235%，阿拉伯糖为7.641%。

2.如权利要求1所述的凉粉草多糖在降低辐射对小鼠的造血系统和免疫器官的伤害的应用，其特征在于所述的凉粉草多糖通过包括如下步骤的方法制备而成：

3.如权利要求2所述的凉粉草多糖在降低辐射对小鼠的造血系统和免疫器官的伤害的应用，其特征在于所述制备步骤（1）中所述的碳酸钠水溶液的浓度为1.5%，控制温度为95℃浸提1.5h。

4.如权利要求3所述的凉粉草多糖在降低辐射对小鼠的造血系统和免疫器官的伤害的应用，其特征在于所述制备步骤（2）中脱色过程中控制温度为50℃。

5.如权利要求4所述的凉粉草多糖在降低辐射对小鼠的造血系统和免疫器官的伤害的应用，其特征在于所述制备步骤（4）中所述的冻干温度为-30℃。