CN114853918B

CN114853918B - 一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法

Info

Publication number: CN114853918B
Application number: CN202210441348.9A
Authority: CN
Inventors: 王瑶瑶; 何文飞; 许佳宁; 刘娟; 尼鹏博; 刘学贵; 刘长风; 高品一; 李丹琦
Original assignee: Shenyang University of Chemical Technology
Current assignee: Shenyang University of Chemical Technology
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2042-04-26
Also published as: CN114853918A

Abstract

一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法，涉及一种生物多糖制备方法，本发明多糖的提取、分离和纯化等工艺的简要过程如下：首先采用热水浸提法从干燥的紫花苜蓿根部粉末中得到水提浸膏，去蛋白，脱色后，利用DEAE纤维素柱层析分离，用去离子水和0.1 M的NaCl溶液洗脱，并用凝胶柱层析法进一步纯化，最终收集得到1个紫花苜蓿根部新多糖RAPS‑1。RAPS‑1的分子量为22.60 KDa，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成。该多糖具有抗氧化活性且可以有效的抑制油酸（OA）诱导的HepG2体外非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型中细胞内脂质的积累，从而达到降脂的目的。为紫花苜蓿根多糖生物活性的开发和应用提供了借鉴和参考。

Description

一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物多糖制备方法，特别是涉及一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法。

背景技术

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是中国广泛种植的一种豆科植物，其种植历史悠久，现在欧亚大陆和世界各国均存在大量栽培。由于它的高营养价值，现在通常被称为“牧草之王”。紫花苜蓿作为农业和制药工业次生代谢物的来源，其未来深度利用方向主要在以下三方面：首先是药用价值，含有的皂苷、多糖等成分可用于治疗人体心血管和免疫方面的疾病；其次是食用价值，富含蛋白质、碳水化合物和其他矿物质；最后是生态价值，根系发达，吸收土壤养分，再生能力强，是山区优良的水土保持植物。

紫花苜蓿多糖是从紫花苜蓿植物中提取出来的多糖，是一种具有一定生物活性的大分子。紫花苜蓿多糖被认为是添加到动物饲料中抗生素的天然替代品，因为其可促进生长性能，且对动物无毒性或其他副作用。到目前为止，紫花苜蓿多糖（APS）的一些有益的生理作用如免疫刺激活性、抗炎、抗肿瘤、和抗氧化已被证实并发表。此外，已有研究发现紫花苜蓿多糖对畜禽生长有促进作用，且具有剂量效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法，该方法采用热水浸提法从干燥的紫花苜蓿根部粉末中得到水提浸膏，去蛋白，脱色后，利用DEAE纤维素柱层析分离，用去离子水和0.1 M的NaCl溶液洗脱，并用凝胶柱层析法进一步纯化，最终收集得到1个紫花苜蓿根部新多糖RAPS-1。该多糖具有抗氧化活性且可以有效的抑制油酸（OA）诱导的HepG2体外非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型中细胞内脂质的积累，该多糖具有抗氧化及降脂活性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法，所述方法包括以下制备过程：

将干燥的紫花苜蓿根部切碎成粉末，过40-60目筛，依次用10倍体积石油醚和乙醇在回流下脱脂和去除黄酮、皂苷等小分子（3次，每次2 h）；滤渣按照料液比1：50（g/mL）用蒸馏水回流提取2 h，重复3次；得到的热水提取物在60 ℃真空浓缩，合并浸膏。采用酶+Sevage法去蛋白；首先，在烧杯中将粗提取液配成80 mg/mL的溶液，加入2.5 %的中性蛋白酶，均匀搅拌后，50 ℃恒温搅拌加热1 h；再在90 ℃水浴加热10 min灭活，离心，收集上清液；加入上清液溶液1/4体积的Sevage试剂（二氯甲烷溶液：正丁醇溶液= 4：1），搅拌30min，离心，收集上清液，减压浓缩；AB-8树脂柱脱色，用蒸馏水洗脱，减压浓缩，得到粗多糖；用DEAE-52纤维素柱对粗多糖进行分离，用蒸馏水和0.1 mol/L NaCl溶液进行洗脱；苯酚-硫酸法测定其糖含量；采用Sephadex G-200柱对所得的馏分进行纯化，减压浓缩干燥最终得到1个新多糖（RAPS-1）；

上述得到的紫花苜蓿根部新多糖，其分子量为22.60 KDa，且RAPS-1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔百分比为：10.25 %、12.53 %、6.58 %、4.56 %、15.74 %、36.30 %。

所述的一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法，所述制备的RAPS-1，根据傅里叶红外光谱和一维、二维核磁共振光谱数据可知RAPS-1具有α-吡喃型糖结构。

所述的一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法，所述制备的紫花苜蓿根部新多糖，对DPPH和ABTS自由基的清除作用评价其抗氧化活性，该多糖有抗氧化活性；利用OA诱导HepG2细胞模型，评估其降脂活性，并进一步氧化损伤和OA诱导的HepG2细胞脂肪肝细胞损伤之间的关系，紫花苜蓿根多糖具天然抗氧化性。

本发明的优点与效果是：

1.抗氧化活性结果表明紫花苜蓿根多糖具有优良的抗氧化活性。当样品浓度达到5 mg/mL时，RAPS-1对DPPH自由基的清除效果为87.03 %，此时该多糖的清除活性接近阳性药Vc（98.57 %）。在该加药浓度下，RAPS-1对ABTS自由基的清除效果为69.18 %。

2.降脂活性实验表明，在不同浓度下，RAPS-1能不同程度的减少由OA诱导的HepG2体外模型中胞内脂滴的数量，并且能够明显降低细胞内TG的含量。同时，通过RAPS-1进一步研究氧化损伤和OA诱导的HepG2细胞脂肪肝细胞损伤之间的联系。实验结果表明该多糖可提高细胞内SOD、T-AOC的活性，降低MDA的含量，揭示紫花苜蓿根多糖可作为一种天然抗氧化剂，为紫花苜蓿多糖的开发和应用奠定了基础。

附图说明

图1是RAPS-1的红外光谱；

图2是RAPS-1的1H和13C NMR图谱；

图3是RAPS-1的HSQC和HMBC NMR图谱；

图4是RAPS-1的单糖组成测试图；

图5是RAPS-1清除DPPH自由基的测试图；

图6是RAPS-1清除ABTS自由基的测试图；

图7是RAPS-1作用于油酸诱导的HepG2细胞油红O染色结果图；

图8是RAPS-1作用于油酸诱导的HepG2细胞甘油三酯试剂盒测试结果图；

图9是RAPS-1对于油酸诱导HepG2细胞细胞内抗氧化因子水平的影响图。

具体实施方式

下面结合附图所示实施例对本发明进行详细说明。但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例如下：

1）紫花苜蓿根多糖的提取、分离和纯化

紫花苜蓿根干燥、粉碎，过40-60目筛，依次用10倍体积石油醚和乙醇在回流下脱脂和去除黄酮、皂苷等小分子（3次，每次2 h）。滤渣按照料液比1：50（g/mL）用蒸馏水回流提取2 h，重复3次。得到的热水提取物在60 ℃真空浓缩，合并浸膏。采用酶+Sevage法去蛋白。首先，在烧杯中将粗提取液配成80 mg/mL的溶液，加入2.5 %的中性蛋白酶，均匀搅拌后，50℃恒温搅拌加热1 h。再在90 ℃水浴加热10 min灭活，离心，收集上清液。加入上清液溶液1/4体积的Sevage试剂（二氯甲烷溶液：正丁醇溶液= 4：1），搅拌30 min，离心，收集上清液，减压浓缩。AB-8树脂柱脱色，用蒸馏水洗脱，减压浓缩，得到粗多糖。用DEAE-52纤维素柱对粗多糖进行分离，用蒸馏水和0.1 M的NaCl溶液进行洗脱。苯酚-硫酸法测定其糖含量。采用Sephadex G-200柱对所得的馏分进行纯化，减压浓缩干燥最终得到1个新多糖（RAPS-1）。

2）紫花苜蓿根多糖的谱图分析

核磁谱图如图所示，在RAPS-1多糖的1H谱中，δ 5.27 ppm，5.17 ppm，5.11 ppm，4.93 ppm，4.47 ppm，4.63 ppm分别是鼠李糖，阿拉伯糖，葡萄糖醛酸，半乳糖，葡萄糖和木糖的端基氢信号。结合13C谱发现，在δ 170.89 ppm出现的碳信号归属于糖醛酸的羧基信号。而δ 16.53 ppm处的信号是鼠李糖甲基的特征吸收信号。结合HSQC谱，本文推断出δ5.27/99.54 ppm (H1/C1)，δ 4.15/77.87 ppm (H2/C2)，δ 4.096/70.53 ppm (H3/C3)，δ3.826/81.25 ppm (H4/C4)，δ 3.748/65.85 ppm (H5/C5)，δ 1.264/16.6 ppm (H6/C6)为→2，4)-α-D-Rhap-(1→残基信号。而δ 4.47/102.9 ppm，δ 5.17/109.2 ppm，δ 4.635/100.09 ppm，δ 5.11/97.4 ppm分别归属于→3，4)-β-D-Xylp-(1→，→)3-α-L-Araf-(1→，→4)-β-D-Glcp-(1→和α-D-GlcpA-(1→的H1/C1信号。结合HMBC谱，可以进一步推断残基的连接位点。→3，4)-β-D-Xylp-(1→的H1（δ 4.47 ppm）与α-D-GlcpA-(1→的C3（δ 72.9 ppm）相关，α-GlcpA-(1→的H1（δ 5.11 ppm）与→)3-α-L-Araf-(1→的C1（δ 107.02 ppm）相关。

3）紫花苜蓿根多糖单糖组成的测定

精密称取RAPS-1 10 mg，放置在具塞比色管中，加入2 mL三氟乙酸溶液（2 mol/L），氮气封管置于110 ℃烘箱中水解6 h，水解完成后用甲醇反复多次旋蒸带走残留的三氟乙酸，氮气吹干得到水解产物。分别取各单糖标准品和水解后的多糖样品10 mg，分别放置于具塞比色管中，随后分别加入0.5 mL吡啶溶液和10 mg盐酸羟胺，封管，放置于90 ℃的水浴锅中反应1 h，期间不断振荡。反应液冷却至室温后再加入0.5 mL乙酸酐溶液，继续在90℃反应30 min，反应液冷却后过0.45 μm有机膜待进气相色谱分析。

色谱条件：气质联用色谱仪（7890A/5975C）；

色谱柱：Agilent HP-5毛细管柱；

检测器：FID检测器；

载气：氦气，流速1.0 mL/min，分流比为110：1；

程序升温：起始温度160 ℃，保持2 min，以2 ℃/min的速度升至250 ℃，保持2min；

MS条件：质量扫描范围为50～350 amu，溶剂延迟2.5 min；

进样量：30～60 μL；

色谱图见图4，由图可知RAPS-1是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔百分比为：10.25 %、12.53 %、6.58 %、4.56 %、15.74 %、36.30 %。

4）紫花苜蓿根多糖分子量的测定

准确称取已知分子量的标准葡聚糖T4、T10、T20、T40、T200、T500和纯化多糖RAPS-1并用娃哈哈纯净水将其分别配制成终浓度为10 mg/mL的样品溶液。配制好的进样液分别过0.22 μm的有机滤膜备用。

色谱条件：高效凝胶渗透色谱仪（LC-20 AR）；

检测器：RID-20A示差折光检测器；

色谱柱：A TSK gel G5000PW column (I.D. = 7.5 mm, L = 300 mm)；

流动相：KH2PO4（0.02 mol/L）；

柱温：室温；

流速：0.6 mL/min；

进样量：50 μL；

根据标准葡聚糖的分子量对数和出峰时间得出相关的线性回归方程：lgMw = -0.309 X + 16.477 （R2 = 0.9909），将RAPS-1的出峰时间代入线性回归方程计算可得，RAPS-1的分子量为22.60 kDa。

5）DPPH自由基清除能力

准确称取1.2 mg DPPH粉末溶于15 mL无水乙醇中，充分混匀，即得到0.2 mmol/L的DPPH储备液，避光保存。准确称取多糖样品于EP管中，用50 %的乙醇溶液配制得到10 mg/mL的样品储备液，并将其配置成不同的样品浓度。取100 μL不同浓度的样品，再加100 μL的DPPH储备液，避光反应30 min，在517 nm下测其吸光度值。用Vc作为阳性对照。清除能力的计算公式为R % = (1-(A1-A2)/A0) × 100 %。A2为100 μL的样品和100 μL的无水乙醇，为样品本底组。A0为100 μL的DPPH和100 μL的50 %乙醇，为空白对照组。由图5可知，紫花苜蓿根多糖清除DPPH自由基的能力与浓度呈剂量依赖性。当样品的浓度达到5 mg/mL时，RAPS-1对DPPH自由基的清除效果为87.03 %，此时该多糖的清除活性接近阳性药Vc（98.57 %）。

6）ABTS自由基清除能力

将样品配置成一系列不同浓度的样品溶液，取10 μL不同浓度的样品，加入190 μLABTS+储备液，避光反应10 min，放入酶标仪中，在734 nm波长处检测吸光度（A1）。用Vc作为阳性对照。清除能力的计算公式为R % = (1-(A1-A2)/A0) × 100 %。10 μL无水乙醇和190μL ABTS，为样品本底组（A2）。空白对照（A0）为190 μL的ABTS和10 μL的50 %乙醇。由图6可知，当浓度达到5 mg/mL时，RAPS-1对ABTS自由基的清除效果为69.18 %。

7）紫花苜蓿根多糖对油酸诱导的HepG2体外模型中细胞脂质积累的影响

（1）取处于对数生长期的细胞，以每孔15万个细胞的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，加入1 mL的不同浓度（600，800，1000 μg/mL）的含多糖培养液和1 mL含油酸（100 μM）培养液共孵育24 h。实验设三组，分别为空白对照组：加2 mL培养液；加药组：1 mL含药培养液+1 mL含油酸培养液；模型组：2 mL含油酸培养液。孵育结束后按照油红O染色方法进行实验，具体如下：

①取出6孔板，吸弃培养液，用预冷的PBS轻柔漂洗一遍；

②每孔加入1 mL 4 %的多聚甲醛，于二氧化碳培养箱固定30 min；

③取出，预冷的PBS漂洗一遍，60 %的异丙醇溶液漂洗30 s；

④避光条件下，每孔加入1 mL油红O工作液，于培养箱染色15 min；

⑤ 60 %异丙醇漂洗一次，分化至间质清晰；

⑥蒸馏水漂洗3～5次，每次1 min；

⑦每孔加入0.5 mL苏木精染液进行复染30 s，蒸馏水漂洗3～5次；

⑧甘油明胶封片；

⑨显微镜下拍照观察。

（2）以每孔5000个细胞的密度，将细胞接种到96孔板中，培养箱孵育过夜。第二天，取出96孔板，显微镜下观察细胞贴壁状态，若贴壁成功则继续实验，否则就继续培养至贴壁。取细胞成功贴壁的96孔板，小心吸弃上清液，再加入100 μL各浓度（50、100、150、200、250 μmol/L）的含油酸培养液。放入培养箱培养24 h，结束后采用TG试剂盒检测胞内TG的含量。

由图7、8可知，OA组处理的HepG2细胞细胞核周围聚集有大量红色脂滴且使胞内TG含量明显升高，在不同浓度条件下，RAPS-1能不同程度的减少脂滴的数量，且经过RAPS-1处理24 h后，其TG的含量呈现剂量依赖性的降低，说明RAPS-1可以改善油酸诱导的HepG2细胞内的脂质积累的现象，尤其是在高浓度的时候，表明RAPS-1具有降脂活性，且治疗效果显著。

8）紫花苜蓿根多糖RAPS-1对油酸诱导的HepG2体外模型中细胞抗氧化体系的影响

细胞孵育完成后，收集充分裂解的细胞于1.5 mL EP管，以10000 r/min的转速，在4 ℃的冷冻离心机上离心10 min。取上清液进行蛋白浓度、MDA、SOD、T-AOC含量的测定。

由于OA处理细胞后，不仅会引起细胞内脂质含量的变化，细胞内的抗氧化系统也会遭到破坏，因此进一步探究不同浓度RAPS-1作用于油酸诱导的HepG2细胞内MDA含量，SOD抗氧化酶和T-AOC活性的影响，由图9可知，与OA组相比，RAPS-1能明显提高T-AOC和SOD的活性，且呈剂量依赖性，同时能明显降低MDA含量，有效抑制体外脂质过氧化水平。

Claims

1.一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法，其特征在于，所述方法包括以下制备过程：

将干燥的紫花苜蓿根部切碎成粉末，过40-60目筛，依次用10倍体积石油醚和乙醇在回流下脱脂和去除黄酮、皂苷小分子3次，每次2 h；滤渣按照料液比1：50g/mL，用蒸馏水回流提取2 h，重复3次；得到的热水提取物在60 ℃真空浓缩，合并浸膏；采用酶+Sevage法去蛋白；首先，在烧杯中将粗提取液配成80 mg/mL的溶液，加入2.5 %的中性蛋白酶，均匀搅拌后，50 ℃恒温搅拌加热1 h；再在90 ℃水浴加热10 min灭活，离心，收集上清液；加入上清液溶液1/4体积的Sevage试剂，所述的试剂为二氯甲烷溶液：正丁醇溶液= 4：1，搅拌30min，离心，收集上清液，减压浓缩；AB-8树脂柱脱色，用蒸馏水洗脱，减压浓缩，得到粗多糖；用DEAE-52纤维素柱对粗多糖进行分离，用蒸馏水和0.1 mol/L NaCl溶液进行洗脱；苯酚-硫酸法测定其糖含量；采用Sephadex G-200柱对所得的馏分进行纯化，减压浓缩干燥最终得到1个新多糖RAPS-1；

上述得到的紫花苜蓿根部新多糖，其分子量为22.60 KDa，且RAPS-1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔百分比为：10.25 %、12.53 %、6.58 %、4.56%、15.74 %、36.30 %。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法，其特征在于，所述制备的RAPS-1，根据傅里叶红外光谱和一维、二维核磁共振光谱数据可知RAPS-1具有α-吡喃型糖结构。

3.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法，其特征在于，所述制备的紫花苜蓿根部新多糖，利用对DPPH和ABTS自由基的清除作用评价其抗氧化活性，该多糖有抗氧化活性；利用OA诱导HepG2细胞模型，评估其降脂活性，并进一步评估氧化损伤和OA诱导的HepG2细胞脂肪肝细胞损伤之间的关系，表明紫花苜蓿根多糖具天然抗氧化性。