CN109985029A - 四氢姜黄素在制备治疗结肠癌或/和预防结肠癌转移药物中的用途 - Google Patents
四氢姜黄素在制备治疗结肠癌或/和预防结肠癌转移药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及四氢姜黄素的新用途,具体地,是在制备治疗结肠癌或/和预防结肠癌转移药物中的用途。试验结果表明,本发明所述的药物四氢姜黄素在治疗结肠癌或/和预防结肠癌转移中,对结肠癌细胞有明显抑制或/和预防转移作用,药效明确,是临床上新的能够用于制备治疗结肠癌或/和预防转移的药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,本发明涉及四氢姜黄素的新用途,具体涉及四氢姜黄素在制备治疗结肠癌或/和预防结肠癌转移的药物中的用途。
背景技术
结肠癌是由于结肠粘膜上皮或腺体上失去正常生长机制的恶性细胞不断增值而产生的恶性肿瘤,好发于直肠与乙状结肠交界处,以40~50岁年龄组发病率最高,男女之比为2~3:1。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。临床症状无特异性,常见症状为便血、腹痛、排便习惯改变、腹部包块等,严重者甚至会出现肠梗阻,当肿瘤侵犯浸润、转移到其他不同部位时,也会出现相应的症状。相关的危险因素包括高脂肪、高蛋白、低纤维素饮食与吸烟等。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展,沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润,除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外,还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。
结肠癌的主要治疗方法包括手术治疗、放化疗、靶向治疗、中医治疗等。内镜、腹腔镜及开腹手术是大肠癌治疗的三个主要术式选择。手术治疗倾向在提高治愈率和生存率的同时尽可能保留受累组织器官的形态与功能。化疗方案中,国际上公认的标准疗法是5-FU+甲酰四氢叶酸(LV)为基础的化疗方案,经典方案主要包括FOLFOX(奥沙利铂+5-FU+亚叶酸钙)和FOLFIRI(伊立替康+5-FU+亚叶酸钙)方案。5-FU+LV联合用药目前临床上多使用甲酰四氢叶酸钙。对无手术指征的中晚期结肠癌患者给予FOLFOX方案化疗可提高和改善患者生存质量。目前奥沙利铂与顺铂等(DDP)的抗癌谱不完全相同、无交叉耐药性且与5-FU有协同作用,已成为临床治疗大肠癌的一线药物。用于临床的大肠癌靶向治疗药物主要包括以下几类:以表皮生长因子受体(EGFR)为靶向的药物,主要药物有西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab),二者有希望成为结直肠癌的二线治疗药物,并与奥沙利铂和伊立替康联合用于一线治疗。中医中药结合放化疗治疗结肠癌已成为主要的综合治疗方法。临床现常使用中成药制剂,如艾迪注射液、癌消平注射液、复方苦参注射液、参麦注射液等联合放化疗治疗结肠癌,已取得了初步疗效。(胡盛,于恩达.结肠癌治疗方法研究进展[J].结直肠肛门外科,2016,22(06):673-675.)
姜黄素是从姜科植物Curcumalonga Linn的根茎姜黄中分离得到的黄色色素。近来,随着中药研究的不断发展,姜黄素的化学结构和生物活性得到了广泛研究,许多研究都证明姜黄素具有低毒、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症和清除自由基等的药理作用。而随着肿瘤发病率的不断增高,姜黄素抗肿瘤活性备受关注。但姜黄素虽然在抗肿瘤方面具有潜在的临床价值,但其存在稳定性低、水溶性差、生物利用度低以及体内代谢迅速等缺陷。
姜黄素Curcumin,化学名称:
1,6-Heptadiene-3,5-dione,1,7-bis(4-hydroxy-3-methooypheny1);分子式C21H21O6;分子量:368.37,结构式为:
为橙黄色结晶性粉末,熔点183℃。不溶于水及乙醚,溶于乙醇及冰醋酸。可来源于姜科多种植物。1985年Kuttan等首次提出姜黄素可以治疗肿瘤,随后大量的研究证明姜黄素具有姜黄素具有抗感染、抗炎、抗氧化、抑制肿瘤生长等作用,因其具有抗癌谱广、高效、低毒等特点,已经被称为第3代抗癌药物。(孙巍.姜黄素对人甲状腺癌B-CPAP细胞生物学行为的影响[J].现代肿瘤医学,2019(02):183-187;冯儒学,蔡仁刚,解丹丹.姜黄素对口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖及凋亡的影响[J].成都医学院学报,2019[2018-12-27];陈永宏,高月.姜黄素对非小细胞肺癌A549细胞增殖凋亡和侵袭能力的影响[J].中国药业,2018,27(23):9-12;常娜,王小平,胥冰.姜黄素逆转肿瘤多药耐药机制的研究进展[J].吉林中医药,2018,38(11):1359-1362;贾佳,陈涛,卢光新,杨艳果.姜黄素对结肠癌细胞HT-29中干细胞标记物CD24及Lgr5增殖的影响[J].临床消化病杂志,2018,30(05):293-297;刘文虎,袁江北,杨兰,常晋霞.姜黄素逆转胃癌细胞赫赛汀耐药机制研究[J].药学学报,2018,53(11):1817-1824.)
四氢姜黄素是姜黄素的主要代谢产物之一,结构如下如所示:
四氢姜黄素(Tetrahydrocurcumin,THC)CAS NO.:36062-04-1
根据文献报道,四氢姜黄素和姜黄素二者的药理作用有所不同。四氢姜黄素捕捉自由基后,自身又会被降解成为2-甲氧基邻羟基苯丙酸类化合物,而该化合物同样是很轻的抗氧化物质,于是四氢姜黄素具有二重抗氧化防御机制,四氢姜黄素类显示比姜黄素更强的生物活性。且四氢姜黄素水溶性、稳定性均比姜黄素好。目前主要用于化妆品增白剂,抗衰老保健品和减肥药中的添加剂。目前四氢姜黄素的报道较少,如专利申请号:200680016918.9,发明名称:使用包含四氢姜黄素的个人护理组合物调节哺乳动物的角质组织,该发明提供了个人护理组合物,所述组合物包含单独的四氢姜黄素,或包含四氢姜黄素四氢姜黄素与四氢脱甲基姜黄素和/或四氢双脱甲基姜黄素的组合。本发明还提供了通过局部施用所述个人护理组合物来天街哺乳动物的角质组织状况的方法。申请号:200810010039.6新型四氢姜黄素衍生物及盐类,本发明属于医药技术领域,是一类新型的四氢姜黄素类衍生物——四氢姜黄素曼尼希碱衍生物及其盐类。本发明的化合物具有显著的抗癌、抗氧化、消除自由基及抑制小胶质细胞的激活的药理活性。申请号:200810070804.3,发明名称:四氢姜黄素用于制备抗抑郁药的用途及其固体分散体的制备方法,本发明设计四氢姜黄素用于制备抗抑郁药的用途及一种四氢姜黄素固体分散体的制备方法。本发明的目的在于提供四氢姜黄素用于制备抗抑郁药的应用。专利号:ZL201210034468.3,发明名称四氢姜黄素的用途,本发明提供了四氢姜黄素在制备预防或/和治疗高血压的药物中的用途。本发明还提供了一种预防或/和治疗高血压的药物组合物。四氢姜黄素对实验性代谢综合征大鼠有降低体重、降低空腹血糖、降低甘油三酯和总胆固醇、降低血压的作用。专利号:ZL201010100518.4,发明名称:四氢姜黄素的用途,本发明提供了四氢姜黄素在制备预防或/和治疗高血压的药物中的用途,其中所述的药物是预防或/和治疗肥胖、高血压、血脂异常、糖代谢异常等一组多种代谢异常在个体聚焦为特点的一组临床症候群的药物、药效明确,是临床上新的能够同时有效纠正MS多种临床紊乱因素的治疗药物。申请号:CN201810569066,发明名称:四氢姜黄素在改善过敏性哮喘的应用。本发明公开了四氢姜黄素在治疗过敏性哮喘中的应用,首次发现和证明四氢姜黄素(THC)对过敏性哮喘的治疗作用,从免疫角度分析THC可减轻鼻部过敏瘙痒、抑制肺部嗜酸性粒细胞浸润、减轻肺部杯状细胞黏液生成和降低肺部胶原沉积,而且THC可以抑制Th2细胞因子产生,这可为临床疾病评估提供有益信息,在哮喘治疗中有良好的应用前景。申请号:CN201810468409,发明名称:四氢姜黄素在制备提高记忆力的药物或保健品中的用途,本发明涉及四氢姜黄素的新用途,具体是在制备提高记忆力的药物或保健品中的用途。本发明还提供了一种四氢姜黄素的固体分散体及其制备方法和用途。通过药效学证明,本发明四氢姜黄素具有明显提高记忆功能,在同等剂量下,药效显著优于姜黄素。
目前,尚没有四氢姜黄素用于治疗结肠癌的相关报道,也没有报道四氢姜黄素可用于预防结肠癌转移的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供四氢姜黄素在制备治疗结肠癌或/和预防结肠癌转移的药物中的用途。
本发明提供了四氢姜黄素在制备治疗结肠癌或/和预防结肠癌转移的药物中的用途。
进一步地,所述药物用于抑制结肠癌细胞的增殖。
进一步地,所述药物用于预防结肠癌细胞的转移。
进一步地,所述的药物是由四氢姜黄素为活性成分,加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
进一步地,所述的制剂是口服制剂或注射制剂。
进一步地,所述口服制剂包括不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、散剂、混悬剂、液体制剂。
本发明四氢姜黄素对结肠癌细胞增殖有抑制作用,能够用于制备治疗结肠癌的药物。同时,本发明四氢姜黄素对结肠癌细胞转移有抑制作用,能够用于制备预防结肠癌转移的药物。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为CT-26细胞克隆形成结果图。
图2为四氢姜黄素对CT-26细胞迁移与侵袭试验示意图。
图3为CT-26细胞迁移情况结果图。
图4为CT-26细胞侵袭试验结果图。
图5为CT-26细胞凋亡试验结果图。
具体实施方式
实施例1四氢姜黄素对鼠源结肠癌细胞的影响
1、试验药物的配制
MTT:称取MTT 0.5g,溶于100mL的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存。
四氢姜黄素母液配置(80mM):精确称取5.891mg的四氢姜黄素,溶于200μL的DMSO中,混匀超声;避光保存。
实验药物浓度:0μM;5μM;10μM;20μM;40μM;80μM;吸取各母液2μL于2mL培养集中,配成高浓度80μM,其余浓度梯度稀释。
2、试验仪器
细胞生物安全柜(SANYO 130AB3),孵箱(SANYO 159),酶标仪(THERMO 1820),电子天平(上海精科FA1204B),灭菌锅(上海三申YM100A)。
3、试验试剂
鼠源结肠癌细胞:CT-26细胞(ATCC),DMSO(BD),PBS(BD),MTT(BD)(5mg/mL),DMEM培养基(Gibco),胎牛血清(草原绿野),抗生素(BD)。
4、试验方法
(1)实验原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜((Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜,用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。
(2)接种细胞:用含10%胎小牛血清的培养液将CT-26细胞配成单个细胞悬液,以每孔5000个细接种到96孔板上,每孔体积200μL。接种后的细胞于37℃,含5%CO2的孵箱中培养过夜。
(3)加药:接种12h后,在安全柜中配制药液浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的四氢姜黄素药液,弃去孔板中的培养基,每孔加入200μL对应浓度的药液。每个浓度至少三个复孔。加药结束后,继续置于孵箱中培养48h。
(4)检测:培养48h后,取出孔板,与安全柜中每孔加入20μLMTT溶液后继续置于孵箱中培养2~4h。4h后取出孔板,轻轻地弃去上清液,每孔加入150μL的DMSO溶液,避光,于摇床上轻轻摇晃3~5分钟后,于酶标仪上进行检测。
5、试验结果
MTT结果表明,加药培养48h后,四氢姜黄素对CT-26细胞的IC50值为42.12μM。
实施例2四氢姜黄素对鼠源结肠癌细胞克隆形成试验的影响
1、试验目的
细胞克隆形成率即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆斑的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。通过细胞在培养板上的克隆形成能力评价药物对细胞增殖能力的影响。
2、试验方法
(1)实验原理:细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
(2)取对数生长期的细胞,分别用胰蛋白酶消化并吹打CT-26细胞成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
(3)将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿100-300个细胞的梯度密度分别接种于六孔板中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃,5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。
(4)每隔两天换液,换液的同时分别给每组细胞加浓度为0μM、10μM、20μM和40μM的药。
(5)经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时(铺板2周后),终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。每孔加甲醇1mL固定15分钟。然后去固定液,加适量结晶紫染色液染20~30分钟,然后用PBS缓慢洗去染色液,空气干燥。
(6)将孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆(计数三次),或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
3、试验结果
四氢姜黄素对CT-26细胞(鼠源结肠癌细胞)克隆形成结果如图1和表1所示。
表1CT-26细胞克隆形成结果
实验结果说明:四氢姜黄素对CT-26细胞的克隆具有抑制作用。
实施例3四氢姜黄素对鼠源结肠癌细胞迁移试验
1、试验目的
细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,开展共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。因此通过检测细胞穿过具有一定通透性的膜的能力(即细胞转移能力)来评价药物对肿瘤细胞的抗转移作用。
2、试验方法
(1)实验原理:常用8.0μm、12.0μm膜,上室种CT-26细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映CT-26细胞的迁移能力。
(2)所有细胞培养试剂和Transwell chamber放在37℃温育;
(3)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105个/mL;
(4)在下室(即24孔板底部)加入600~800μL含10%血清的培养基,上室加入100~150μL细胞悬液,此悬液中药物浓度分别为0μM、10μM、20μM和40μM,继续在孵箱培养24小时;
(5)用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μL甲醇的孔中,室温固定30分钟;
(6)取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μL Giemsa染液的孔中,室温染色15~30分钟;
(7)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞;
(8)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;
(9)显微镜下取3个随机视野计数,统计结果。
3、试验结果
四氢姜黄素对CT-26细胞迁移情况影响的结果如图3和表2所示。
表2 CT-26细胞迁移百分率结果统计(%)
实验结果说明:四氢姜黄素对CT-26细胞的迁移具有抑制作用。
实施例4四氢姜黄素对鼠源结肠癌细胞作用机制研究--细胞侵袭试验
1、试验目的
细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,开展共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。因此通过检测细胞穿过具有一定通透性的膜的能力(即细胞转移能力)来评价药物对肿瘤细胞的抗转移作用。
2、试验方法
(1)实验原理:在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶,模仿细胞外基质,上室种CT-26细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室,计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。
(2)Matrigel在4℃过夜融化;
(3)用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml,冰上操作;
(4)在chamber上室底部中央垂直加入100μL稀释后的Matrigel,37℃使其干成胶状;
(5)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤1次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105个/mL;
(6)在下室(即24孔板底部)加入600~800μL含10%血清的培养基,上室加入100~150μL细胞悬液,此悬液中药物浓度分别为0μM、10μM、20μM和40μM,继续在孵箱培养24~48小时;
(7)用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μL甲醇的孔中,室温固定30分钟;
(8)取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μL Giemsa染液的孔中,室温染色15~30分钟;
(9)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞;
(10)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;
(11)显微镜下取3个随机视野计数,统计结果。
3、试验结果
四氢姜黄素对CT-26细胞侵袭的结果如图4和表3所示。
表3 CT-26细胞侵袭百分率结果统计(%)
实验结果说明:四氢姜黄素对CT-26细胞侵袭具有抑制作用。
实施例5四氢姜黄素对鼠源结肠癌细胞的作用机制研究—细胞凋亡试验
1、试验目的
细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型,而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。细胞凋亡的研究,其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明,以及新疗法的探索及问世
2、试验方法
取对数生长期的细胞,分别用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM/1640培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿105个细胞的梯度密度分别接种于六孔板中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。次日键入相应浓度的药液作用48H后,细胞消化离心收集到10ml的离心管中,每样本细胞数为(1-5)x106/ml。500-1000r/min离心3min,弃去培养液。按照试剂盒进行操作后上机检测。
3、试验结果
四氢姜黄素对CT-26细胞侵袭的结果如图5和表4所示。
表4CT-26细胞凋亡结果
实施例6四氢姜黄素口服制剂的制备
四氢姜黄素口服制剂是以四氢姜黄素为活性成分,加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。
综上,本发明四氢姜黄素对结肠癌细胞增殖有抑制作用,能够用于制备治疗结肠癌的药物。同时,本发明四氢姜黄素对结肠癌细胞转移有抑制作用,能够用于制备预防结肠癌转移的药物。
Claims (6)
1.四氢姜黄素在制备治疗结肠癌或/和预防结肠癌转移的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述药物用于抑制结肠癌细胞的增殖。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述药物用于预防结肠癌细胞的转移。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的用途,其特征在于:所述的药物是由四氢姜黄素为活性成分,加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
5.根据权利要求4所述的用途,其特征在于:所述的制剂是口服制剂或注射制剂。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于:所述口服制剂包括不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、散剂、混悬剂、液体制剂。
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