CN109971206A - 一种苏木精染液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苏木精染液及其制备方法，所述苏木精染液按重量百分比计，包括组分：苏木精0.05％‑1％；苏木红0.05％‑1％；无水乙醇5％‑20％；硫酸铝钾1％‑10％；碘酸钠0.02％‑0.2％；一水柠檬酸0.05％‑1％；其余为水。本发明提供的苏木精染液及其制备方法，经过大量的实验后，改良了传统的苏木精染液配制方法，以达到比较理想的染色效果及使用时间，放弃了传统有剧毒氧化汞作为氧化剂及刺激性较强的冰醋酸作为抗氧化剂，降低对操作人员的职业风险并有效的保护环境，延长苏木精的使用时间，有效的降本增效。
Description
技术领域
本发明涉及细胞染色技术领域，尤其涉及一种苏木精染液及其制备方法。
背景技术
苏木精染液为碱性染料，主要是使细胞核内的染色质和胞质内的核糖体着蓝紫色，常运用于苏木精—伊红染色法，即HE染色法(hematoxylin-eosin staining)，石蜡切片苏木精伊红染色技术是病理解剖学、组织胚胎学、法医学和生物学等领域最基本的技术操作。掌握好HE染色，也为其他染色如特殊染色、酶组化染色和免疫组化染色等技术打好基础。
一种成熟的苏木精染液是苏木精、苏木红、苏木红的活性氧化产物和非活性的超氧化产物的混合物。但是过度氧化，可导致大量非活性超氧化产物产生，这些产物是无色和无用的。因此，在配制苏木精染液时，精确地加入恰当的氧化剂和量是重要的。在实践中，苏木精染液的染色都较理想，但使用寿命不长，染液的染色力随着时间推移慢慢减弱而需重新配制。在几种氧化剂中，很多学者都首选氧化汞，而氧化汞需要在苏木精染液煮沸时加入才能放氧，当开始放氧时又要立即把染液置入冷水中终止放氧。人为因素影响较大，而汞盐也是一种毒性物质，多使用人员危害大，对环境产生污染大。而为了抑制苏木精染液中氧化剂的作用，常使用抗氧化剂，一般采用的是冰醋酸，但是冰醋酸刺激性大，挥发作用明显。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出了一种保持时间长、染色效果好、染色时间短的苏木精染液及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面提供了一种苏木精染液配方，按重量百分比计，包括如下组分：
进一步地，在所述的苏木精染液中，所述苏木精和苏木红的重量比为1:1。
进一步地，在所述的苏木精染液中，所述苏木精和一水柠檬酸的质量比为5:1。
进一步地，在所述的苏木精染液中，所述苏木精和碘酸钠的质量比为10:1。
进一步地，在所述的苏木精染液中，所述无水乙醇溶液也可用甲醇、乙二醇、异丙醇、丙二醇或丙三醇替换，也可以是一种或多种低级烷醇或多元醇的混合物。
作为本发明的第二个方面是提供一种所述的苏木精染液的制备方法，包如下步骤：
步骤1，制备试剂甲：将配方比的苏木精、无水乙醇混合，加热至50-70℃，并搅拌直至充分溶解；
步骤2，制备试剂乙：将配方比的蒸馏水与硫酸铝钾混合，并加热至45-60℃，搅拌直至充分溶解；
步骤3，将试剂甲缓慢加入试剂乙中持续搅拌并保持温度在45-55℃，使其充分反应，液体由浅棕色转为深紫色后，缓慢加入配方比的碘酸钠后，将反应液温度降至20-30℃，持续搅拌，至溶液表面出现金属色氧化膜；
步骤4，加入配方比的一水柠檬酸，搅拌至液体由深紫色转变为深紫红色；
步骤5，将上述反应液过滤后静置，即得苏木精染液。
进一步地，所述步骤1中的加热温度为55-62℃，搅拌时间为15-25分钟。
进一步地，所述步骤2中的加热温度为52-55℃，搅拌时间为10-20分钟。
进一步地，所述步骤3中试剂甲和试剂乙的体积比为1:6-12。
进一步地，所述步骤3中反应温度为50-52℃，反应时间为30-60分钟。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
1)试剂中不含污有毒性的氧化汞，不含刺激性冰醋酸等有毒有害化学成分。
2)保存期长：适用于规模化生产适用。(保存期最长可达24个月)
3)实际染液用量少：每1000毫升染液可染色10000张左右切片。
4)染色效果好：颜色亮丽，不同种类细胞和灰阶梯度细腻，细胞核结构清晰，更细腻展示细胞内染色质及细胞核结构。
5)染色速度快：常规苏木精染色时间一般为5-15分钟。本发明所改良的苏木精染色时间为15秒至5分钟。大大缩短了染色时间，为快速病理创造了条件。
综上，本发明提供的苏木精染液及其制备方法，经过大量的实验后，改良了传统的苏木精染液配制方法，以达到比较理想的染色效果及使用时间，放弃了传统有剧毒氧化汞作为氧化剂及刺激性较强的冰醋酸作为抗氧化剂，降低对操作人员的职业风险并有效的保护环境，延长苏木精的使用时间，有效的降本增效。
说明书附图
图1为本发明实施例3与对比例苏木素染液对细胞核染色的效果对比图。
具体实施方式
本发明第一个方面是提供一种苏木精染液配方，按重量百分比计，包括如下组分：苏木精0.05％-1％；苏木红0.05％-1％；无水乙醇5％-20％；硫酸铝钾1％-10％；碘酸钠0.02％-0.2％；一水柠檬酸0.05％-1％；其余为水。
上述无水乙醇溶液也可用甲醇、乙二醇、异丙醇、丙二醇或丙三醇替换，也可以是一种或多种低级烷醇或多元醇的混合物。
所述苏木精组分和苏木红组分的重量比为1:1，也可以为1-5:1-5的比值，优选为1:2、1:4、2:1、4:1。所述碘酸钠和苏木精的质量比为1:10。优选的，所述碘酸钠和苏木精的质量比还可以是1:5-1:20，优选为1:8、1:12。
本发明第二个方面是提供一种上述苏木精染液的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1，制备试剂甲：将苏木精1-10克、无水乙醇50-250毫升混合后，加热并搅拌直至充分溶解；酒精蒸发时可及时补充添加，保持液体量恒定；
步骤2，制备试剂乙：将800-1200毫升蒸馏水与50-100克硫酸铝钾混合，并加热至45-60摄氏度，搅拌直至充分溶解；当水分蒸发时及时添加蒸馏水，保持液体量恒定；
步骤3，将试剂甲缓慢加入试剂乙中持续搅拌并保持温度在45-55摄氏度，使其充分反应，液体由浅棕色转为深紫色后，缓慢加入碘酸钠200-800毫克后将反应温度降至20-30摄氏度持续搅拌至溶液表面出现金属色氧化膜；
步骤4，加入0.5-2克一水柠檬酸搅拌30分钟直至液体由深紫色转变为深紫红色；
步骤5，过滤后静置，即得苏木精染液。
在一个较佳的实施例中，所述步骤1步骤中的苏木精和无水乙醇的质量比为1:10-1:30；混合后加热温度为50-70摄氏度。优选为50摄氏度、55摄氏度、60摄氏度。搅拌时间为15-25分钟；优选的搅拌时间为15分钟、20分钟、25分钟。
在一个较佳的实施例中，所述步骤2步骤中的蒸馏水和硫酸铝钾的质量比为10：1-30:1；加热至45-60摄氏度后，温度保持在45-60中一个恒定的温度加热，以方便控制反应时间；搅拌时间为15分钟-25分钟，优选的为15分钟、20分钟、25分钟。
在另一个较佳的实施例中，所述步骤3步骤中试剂甲和试剂乙的体积比为1:6-12。优选的试剂甲和试剂乙的体积比为1：6、1：7、1：8、1:9、1:10、1：11、1:12。试剂甲加入试剂乙时的温度保持在45-55摄氏度中一个恒定的温度进行持续反应；缓慢加入碘酸钠后将反应温度降至20-30摄氏度持续搅拌的时间为40-60分钟；
在另一个较佳的实施例中，所述苏木精和一水柠檬酸的质量比为5:1。优选的，还可以是6：1、4：1。搅拌时间为20分钟-30分钟，优选的为20分钟、25分钟、30分钟。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以便更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1苏木精溶液的制备
步骤1制备试剂甲：苏木精4克、无水乙醇100毫升；混合后加热至50摄氏度并搅拌15分钟直至充分溶解；酒精蒸发时可及时补充添加，保持液体量恒定；
步骤2制备试剂乙：将950毫升蒸馏水与50克硫酸铝钾混合，并加热至45摄氏度，搅拌15分钟直至充分溶解；当水分蒸发时及时添加蒸馏水，保持液体量恒定；
步骤3将试剂甲缓慢加入试剂乙中持续搅拌30分钟并保持温度在45摄氏度，使其充分反应，液体由浅棕色转为深紫色后，缓慢加入碘酸钠200毫克后将反应温度降至20摄氏度持续搅拌40分钟至溶液表面出现金属色氧化膜；
步骤4加入0.5克一水柠檬酸搅拌20分钟直至液体由深紫色转变为深紫红色；
步骤5过滤后静置，即得1号苏木精溶液。
本实施例1制备的1号苏木精溶液的组分和重量比为：苏木精0.36％；苏木红0.36％；乙醇9.05％；硫酸铝钾4.53％；碘酸钠0.02％；一水柠檬酸0.05％；其余为水。
实施例2苏木精溶液的制备
步骤1制备试剂甲：苏木精6克、无水乙醇150毫升；混合后加热至55摄氏度并搅拌20分钟直至充分溶解；酒精蒸发时可及时补充添加，保持液体量恒定；
步骤2制备试剂乙：将1000毫升蒸馏水与80克硫酸铝钾混合，并加热至55摄氏度，搅拌20分钟直至充分溶解；当水分蒸发时及时添加蒸馏水，保持液体量恒定；
步骤3将试剂甲缓慢加入试剂乙中持续搅拌30分钟并保持温度在50摄氏度，使其充分反应，液体由浅棕色转为深紫色后，缓慢加入碘酸钠500毫克后将反应温度降至22摄氏度持续搅拌45分钟至溶液表面出现金属色氧化膜；
步骤4加入1克一水柠檬酸搅拌25分钟直至液体由深紫色转变为深紫红色；
步骤5过滤后静置，得2号苏木精溶液。
本实施例2制备的2号苏木精溶液的组分和重量比为：苏木精0.48％；苏木红0.48％；乙醇12.12％；硫酸铝钾6.46％；碘酸钠0.04％；一水柠檬酸0.08％；其余为水。
实施例3苏木精溶液的制备
步骤1制备试剂甲：苏木精8克、无水乙醇100毫升；混合后加热至55摄氏度并搅拌25分钟直至充分溶解；酒精蒸发时可及时补充添加，保持液体量恒定；
步骤2制备试剂乙：将1100毫升蒸馏水与90克硫酸铝钾混合，并加热至55摄氏度，搅拌25分钟直至充分溶解；当水分蒸发时及时添加蒸馏水，保持液体量恒定；
步骤3将试剂甲缓慢加入试剂乙中持续搅拌30分钟并保持温度在55摄氏度，使其充分反应，液体由浅棕色转为深紫色后，缓慢加入碘酸钠800毫克后将反应温度降至24摄氏度持续搅拌50分钟至溶液表面出现金属色氧化膜；
步骤4加入2克一水柠檬酸搅拌30分钟直至液体由深紫色转变为深紫红色；
步骤5过滤后静置，得3号苏木精溶液。
本实施例3制备的3号苏木精溶液的组分和重量比为：苏木精0.62％；苏木红0.62％；乙醇7.69％；硫酸铝钾6.92％；碘酸钠0.06％；一水柠檬酸0.15％；其余为水。
实施例4苏木精溶液的制备
步骤1制备试剂甲：苏木精10克、无水乙醇200毫升；混合后加热至60摄氏度并搅拌25分钟直至充分溶解；酒精蒸发时可及时补充添加，保持液体量恒定；
步骤2制备试剂乙：将1200毫升蒸馏水与100克硫酸铝钾混合，并加热至60摄氏度，搅拌25分钟直至充分溶解；当水分蒸发时及时添加蒸馏水，保持液体量恒定；
步骤3将试剂甲缓慢加入试剂乙中持续搅拌30分钟并保持温度在55摄氏度，使其充分反应，液体由浅棕色转为深紫色后，缓慢加入碘酸钠800毫克后将反应温度降至28摄氏度持续搅拌60分钟至溶液表面出现金属色氧化膜；
步骤4加入2克一水柠檬酸搅拌30分钟直至液体由深紫色转变为深紫红色；
步骤5过滤后静置，得4号苏木精溶液。
本实施例4制备的4号苏木精溶液的组分和重量比为：苏木精0.66％；苏木红0.66％；乙醇13.22％；硫酸铝钾6.61％；碘酸钠0.05％；一水柠檬酸0.13％；其余为水。
对比例
步骤1将2.5克苏木素放入25毫升无水乙醇中，搅拌至完全溶解。
步骤2将22克硫酸铝钾加入500毫升蒸馏水内，加热溶解，然后加入苏木素无水乙醇液，使溶液尽快沸腾后，移离火焰。
步骤3搅拌溶液，待温度下降至91℃左右时，将氧化汞缓缓加入。此时，烧瓶内液体变成紫红色。继续搅拌至看不到氧化汞的黄颜色为止，迅速将烧瓶放置于冷水中，用纱布置于瓶口处盖之。注意，瓶口不能用橡皮塞，否则会有氢氧化铝凝胶形成。
步骤4次日晨，加入2毫升冰醋酸搅匀，此时的染色液为绛红色。
HE染色
操作流程如下：
将实施例3和对比例制备的苏木精溶液分别按照上述方法进行HE染色操作，得到如图1所示的同一位置的细胞核染色图，其中：A:实施例3染色1min；B:实施例3染色5min；C:对比例染色1min；D:对比例染色5min。
如图1所示，A与C同样染色1min，而A中的细胞核颜色更深更明显。且A与B相比，发现细胞核染色效果相差无几，说明实施例3所配制的苏木素溶液达到理想染色效果所需的时间更短。C与D相比，随着染色时间增加，对比例苏木素溶液对细胞核的染色程度逐渐加深，但其染色效果始终略差于A和B。综上所述，实施例3所配制的苏木素溶液的染色时间更短且染色效果更佳，更细腻展示细胞内染色质及细胞核结构。
本发明方法制备的苏木精染液，试剂中不含具有毒性的氧化汞，不含刺激性冰醋酸等有毒有害化学成分；保存期长，保存期最长可达24个月适用于规模化生产适用。实际染液用量少，每1000毫升染液可染色10000张左右切片。染色效果好，颜色亮丽，不同种类细胞和灰阶梯度细腻，细胞核结构清晰，更细腻展示细胞内染色质及细胞核结构。染色速度快，常规苏木精染色时间一般为5-15分钟。本发明的改良的苏木精染色时间为15秒至5分钟，大大缩短了染色时间，为快速病理创造了条件。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (9)
1.一种苏木精染液，其特征在于，按重量百分比计，包括如下组分：
2.根据权利要求1所述的苏木精染液，其特征在于，所述苏木精和苏木红的重量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的苏木精染液，其特征在于，所述苏木精和一水柠檬酸的质量比为5:1。
4.根据权利要求1所述的苏木精染液，其特征在于，所述苏木精和碘酸钠的质量比为10:1。
5.一种如权利要求1-4任一项所述苏木精染液的制备方法，其特征在于，包如下步骤：
步骤1，制备试剂甲：将配方比的苏木精、无水乙醇混合，加热至50-70℃，并搅拌直至充分溶解；
步骤2，制备试剂乙：将配方比的蒸馏水与硫酸铝钾混合，并加热至45-60℃，搅拌直至充分溶解；
步骤3，将试剂甲缓慢加入试剂乙中持续搅拌并保持温度在45-55℃，使其充分反应，液体由浅棕色转为深紫色后，缓慢加入配方比的碘酸钠后，将反应液温度降至20-30℃，持续搅拌，至溶液表面出现金属色氧化膜；
步骤4，加入配方比的一水柠檬酸，搅拌至液体由深紫色转变为深紫红色；
步骤5，将上述反应液过滤后静置，即得苏木精染液。
6.根据权利要求5所述的苏木精染液的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的加热温度为55-62℃，搅拌时间为15-25分钟。
7.根据权利要求5所述的苏木精染液的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的加热温度为52-55℃，搅拌时间为10-20分钟。
8.根据权利要求5所述的苏木精染液的制备方法，其特征在于，所述步骤3中试剂甲和试剂乙的体积比为1:6-12。
9.根据权利要求5所述的苏木精染液的制备方法，其特征在于，所述步骤3中反应温度为50-52℃，反应时间为30-60分钟。
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