CN109929023A - 一种金属亲和性融合蛋白标签及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型金属亲和性融合蛋白标签，该标签来源于天然的人铜离子转运蛋白胞外氨基端片段，可替代His‑tag作为金属亲和标签，用于纯化重组融合蛋白；还公开了融合该标签的新型融合蛋白，其具有特殊的生理、药理活性。

Description

一种金属亲和性融合蛋白标签及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种对金属离子有亲和能力的新型金属亲和性融合蛋白标签，及其融合蛋白。

背景技术

金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸等残基的金属离子结合特性，通过固相基质的吸附作用来分离、纯化蛋白质。组氨酸标签(His-Tag)作为一种人工合成的序列，可用于外源蛋白的融合表达，以利于重组蛋白的纯化。在目的蛋白的氨基端、羧基端或中间，融合连续组氨酸残基组成的肽段(常用6-10个组氨酸)，均可在多种表达系统(细菌、酵母及哺乳动物细胞)中成功表达。His-Tag相较于其他融合蛋白标签如GST等，分子量小，应用广泛。

已有研究发现，在蛋白质的氨基端或羧基端融合His-tag会影响蛋白质的复性[1]、稳定性[2]或溶解度[3]；His-tag也可能影响蛋白质的活性，如His-tag融合于Chlorocatchol 1,2-Dioxygenase(CCD)的氨基端，其结构与CCD虽然只有微小区别，活性却降低5倍[4]。另外，His-tag不是内源性蛋白，具有一定的免疫原性，因此体内应用的目的蛋白如药物蛋白，通常需要在纯化后切除His-tag。

人铜离子转运蛋白(human copper transporter，hCtr)是人体内具有铜离子转运功能的蛋白,分为hCtr1、hCtr2型。相比于hCtr2，hCtr1对铜离子有较高亲和力，主要负责将细胞外环境中的铜离子转运进入细胞。hCtr1在所有的组织和器官中均有表达，但表达的量有所不同，在肝脏和肾脏中表达最多，在脑和骨骼肌中表达相对较少[5]。hCtr1单体的分子量为28kD，由190个氨基酸残基组成，其中包括氨基端(66个氨基酸残基)，位于质膜外侧，包含蛋氨酸与组氨酸富集区；三段螺旋跨膜区，其中第二跨膜区存在蛋氨酸富集区；一段较长的连接第一、第二跨膜区的胞内自由肽(47个氨基酸残基)；以及胞内羧基端(15个氨基酸残基)，存在His-Cys-His序列，结构见图23所示。hCtr1以同源三聚体的形式存在于细胞质膜上，形成锥形空隙通道，供铜离子通过进入细胞[6]。

hCtr1蛋白氨基端的两个蛋氨酸富集区，构成MXXM或MXM的特征序列，其中第二个蛋氨酸富集区中45位蛋氨酸在铜离子转运过程中起着重要作用，该区选择性亲和还原型Cu⁺，可达微摩尔水平[7]，同时其对hCtr1的氨基端自聚是必要的[8]。此外，hCtr1 胞外氨基端还包含H2N-MDH即ATCUN(amino terminal Cu²⁺and Ni²⁺binder)结合位点，以及组氨酸富集区[9]。ATCUN结合位点，对氧化型Cu²⁺有很高亲和力，可达到皮摩尔水平，而5、6位的His形成bis-His结构可促进抗坏血酸还原二价铜离子，并可与一价铜离子形成相对不稳定的配位键，后续的转运过程可持续进行[10]。

每个hCtr1单体含三段跨膜区域，其中第二段跨膜区位于孔隙的中央。在第二跨膜区的靠近磷脂双层膜外侧的MXXXM特征序列构成蛋氨酸富集区，协助铜离子的在孔道的转运，同时第二跨跨膜区的139位组氨酸不参与铜离子转运而对三聚体的形成起重要作用[11]。第二段跨膜区与第三段跨膜区仅通过胞外三个氨基酸残基相连，其中第三段跨膜区的GXXXG保守片段与第三和第一跨膜区螺旋的紧密堆积有关[12]。细胞内羧基端特别是189位半胱氨酸影响hCtr1同源三聚体的形成，但不会对铜转运的速率造成影响，原因是突变189位半胱氨酸后，组氨酸可替代半胱氨酸参与铜离子转运[12,13]。可见hCtr1 的胞外氨基端、跨膜区以及胞内段均参与了由同源三聚体组成的跨膜孔隙的形成，以及铜离子的转运。

1.Klose J,Wendt N,Kubald S,Krause E,Fechner K,Beyermann M,Bienert M,Rudolph R,Rothemund S:Hexa-histidin tag position influences disulfidestructure but not binding behavior of in vitro folded N-terminal domain ofrat corticotropin-releasing factor receptor type 2a.Protein Sci 2004,13(9):2470-2475.

2.Korepanova A,Douglas C,Leyngold I,Logan TM:N-terminal extensionchanges the folding mechanism of the FK506-binding protein.Protein Sci 2001,10(9):1905-1910.

3.Woestenenk EA,Hammarstrom M,van den Berg S,Hard T,Berglund H:Histag effect on solubility of human proteins produced in Escherichia coli:acomparison between four expression vectors.J Struct Funct Genomics 2004,5(3):217-229.

4.Araujo AP,Oliva G,Henrique-Silva F,Garratt RC,Caceres O,BeltraminiLM: Influence of the histidine tail on the structure and activity ofrecombinant chlorocatechol 1,2-dioxygenase.Biochem Biophys Res Commun 2000,272(2):480-484.

5.Zhou B,Gitschier J:hCTR1:a human gene for copper uptake identifiedby complementation in yeast.Proc Natl Acad Sci U S A 1997,94(14):7481-7486.

6.Aller SG,Unger VM:Projection structure of the human coppertransporter CTR1at 6-A resolution reveals a compact trimer with a novelchannel-like architecture.Proc Natl Acad Sci U S A 2006,103(10):3627-3632.

7.Rubino JT,Riggs-Gelasco P,Franz KJ:Methionine motifs of coppertransport proteins provide general and flexible thioether-only binding sitesfor Cu(I)and Ag(I).J Biol Inorg Chem 2010,15(7):1033-1049.

8.Klomp AE,Juijn JA,van der Gun LT,van den Berg IE,Berger R,Klomp LW:The N-terminus of the human copper transporter 1(hCTR1)is localizedextracellularly,and interacts with itself.Biochem J 2003,370(Pt 3):881-889.

9.Haas KL,Putterman AB,White DR,Thiele DJ,Franz KJ:Model peptidesprovide new insights into the role of histidine residues as potential ligandsin human cellular copper acquisition via Ctr1.J Am Chem Soc 2011,133(12):4427-4437.

10.Pushie MJ,Shaw K,Franz KJ,Shearer J,Haas KL:Model Peptide StudiesReveal a Mixed Histidine-Methionine Cu(I)Binding Site at the N-Terminus ofHuman Copper Transporter 1.Inorg Chem 2015,54(17):8544-8551.

11.Puig S,Lee J,Lau M,Thiele DJ:Biochemical and genetic analyses ofyeast and human high affinity copper transporters suggest a conservedmechanism for copper uptake.J Biol Chem 2002,277(29):26021-26030.

12.De Feo CJ,Aller SG,Siluvai GS,Blackburn NJ,Unger VM:Three-dimensional structure of the human copper transporter hCTR1.Proc Natl AcadSci U S A 2009, 106(11):4237-4242.

13.Eisses JF,Kaplan JH:Molecular characterization of hCTR1,the humancopper uptake protein.J Biol Chem 2002,277(32):29162-29171.

发明内容

本发明解决的技术问题：一方面提供一种新型金属亲和性融合蛋白标签、编码该融合标签的基因序列、含有该基因序列的表达载体和/或宿主细胞、以及该融合蛋白标签、其基因序列、表达载体或宿主细胞的应用；另一方面提供一种包含上述金属亲和性融合蛋白标签的融合蛋白、编码融合蛋白的基因序列、含有该基因序列的表达载体和/或宿主细胞，并提供一种表达融合蛋白的方法。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种金属亲和性融合蛋白标签，其特征在于，其氨基酸序列来源于人铜离子转运蛋白胞外段的N末端1-25个氨基酸序列，优选SEQ ID No：2。提供了将金属亲和性融合蛋白标签融合于氨基端的融合蛋白，序列为SEQ ID No:4,SEQ ID No:6,SEQ ID No:8,SEQ ID No:10。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，其特征在于，含有编码本发明第一方面所述融合蛋白标签的基因序列，优选SEQ ID No:1。提供了编码第一方面所述融合蛋白的核酸分子，其特征在于含有编码第一方面所述融合蛋白的基因序列，优选SEQ ID No:3,SEQ IDNo:5,SEQ ID No:7,SEQ ID No:9。

本发明第三方面提供了一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含第二方面所述的编码金属亲和性融合蛋白标签的核酸分子，连接于载体的启动子用于核酸分子编码金属亲和性融合标签的表达。提供了一种表达载体，其特征在于包含第二方面所述编码融合蛋白的核酸分子，连接于载体的启动子用于核酸分子编码融合蛋白的表达。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，含有第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体。

本发明第五方面提供了金属亲和性融合标签的应用方法，其特征在于，替代His-tag 纯化重组融合蛋白，改善融合蛋白的理化性质及活性等。

本发明第六方面提供了一种采用如下步骤生产目的蛋白或多肽的方法：(1)扩增适宜的宿主细胞；(2)诱导宿主细胞表达融合蛋白；(3)分离制备融合蛋白；和/或(4)对特异性的多肽切割位点或序列进行化学切割或生物酶解，分离融合载体蛋白与目的蛋白或多肽，以获取目的蛋白或多肽；其特征在于，该步骤(1)中的宿主细胞是本发明第四方面所述的宿主细胞。

发明详述

本专利提供了一种替代His-tag的新型短肽序列。该序列选取自天然的人铜离子转运蛋白氨基端1-25个氨基酸残基(MDHSHHMGMSYMDSNSTMQPSHHHP,SEQ ID No:2)，简称为MCT-tag，其中包含了ATCUN结合位点，一段蛋氨酸富集区，以及一段三个连续的组氨酸残基。MCT-tag可与镍及铜离子等金属离子螯合，从而替代His-tag与目的蛋白融合，便于重组蛋白的纯化。MCT-tag来源人天然的蛋白序列，可保留在目的蛋白上，不需切除MCT-tag，避免了后续酶切与纯化的复杂过程，提高生产效率，降低生产成本。出乎意料的是，MCT-tag融合后，通常会促进目的蛋白的表达，对目的蛋白折叠的影响明显小于His-tag，且MCT-tag融合蛋白的稳定性明显高于His-tag融合蛋白。更加意外的是， MCT-tag与TRAIL或其变体融合，极大地提高了其抗肿瘤活性。

实施本发明，需要首先获得编码MCT-tag基因克隆。通常，根据已知的基因序列设计 PCR引物，用从人细胞中提取的RNA，进行反转录PCR可直接获得cDNA克隆；更简单的，可以人工合成与天然编码DNA序列相同基因序列；也可以按照其氨基酸序列，用公知的设计方法，依宿主的基因偏好，合成不同密码子偏好的基因序列；也容易从其它商业途径获得含有MCT-tag的基因克隆。

可以按公知的方法，构建编码本发明所述的融合载体蛋白与既定目的蛋白形成的融合蛋白表达载体。用常规的分子生物学手段，首先将编码既定目的蛋白的基因，与编码MCT-tag的基因直接共码连接。它们的连接顺序可以根据需要进行调整，以获得诸如MCT-T、T-MCT等等多种形式的融合蛋白产物；其融合蛋白中包含的MCT-tag可以是hCtr1 氨基端1-25个氨基酸序列(SEQ ID No:2)，或取代、缺失或添加变异体，但仍与MCT-tag 序列具有一定的同源性，且不影响其与金属离子结合的特性，并能有效融合表达的序列；其中的目的蛋白T可以有一个或多个相同或不同的分子。上述基因片段也可以通过含有编码间隔序列的基因片段连接，融合载体蛋白与目的蛋白的间隔序列可以含有能被特异性化学切割或生物酶解的特定序列，如Met(蛋氨酸)残基可被CNBr化学切割，Lys(赖氨酸)或 Arg(精氨酸)残基可被胰蛋白酶切割，LysArg或ArgArg可被双碱基蛋白酶类如Kex2切割，GluAsnLeuTyrPheGln可被烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV蛋白酶)识别和切割， IeuGluGlyArg可被Xa因子(Xa蛋白酶)识别和切割，以及其它合适的蛋白酶切位点。上述获得的融合蛋白编码基因，按公知的方法插入合适的表达载体，得到表达上述融合蛋白的重组载体。也可以将需要的基因片段按合适的顺序依次连接到表达载体上。上述表达载体包括但不限于原核表达载体和各种真核表达载体。各种商品化的表达载体，可提供选择，如表达载体pQE系列，pET系列等。按公知的方法将重组载体转入宿主细胞，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、其它原核细胞、各种真核生物细胞。在合适的条件下进行诱导表达，表达的宿主细胞经破碎裂解，收取融合蛋白产物。表达产物可以通过公知的方法纯化；融合蛋白中，作为融合蛋白标签的MCT-tag序列，可以用合适的化学切割或蛋白酶切割去除。

本发明可用于融合表达多种在疾病诊断、治疗、预防或其它领域用途的目标蛋白或多肽。含50及以上氨基酸残基数的蛋白分子一般称为蛋白，50以下氨基酸残基数的蛋白分子常称为多肽；但二者名称经常混用。目标蛋白可包括生长因子、细胞因子、配体、受体、转运体、抗原、抗体及其片段。特别对TRAIL类似的蛋白，本发明具有更多的优势。

有益的技术效果

本发明的优点在于，本发明的融合蛋白标签及其构建的重组表达系统，可替代His-tag 纯化重组融合蛋白，为重组蛋白的表达与纯化提供了更多选择。

其次，MCT-tag对多种不同蛋白均具有良好的促表达作用，可能是由于其提高了目的蛋白的稳定性。

本发明的另一个优点是，MCT-tag来源于人体内天然的蛋白质片段，进入人体后产生免疫原性的可能性小，不需切除，降低生产成本，提高生成效率。

此外，MCT-tag大大提高了TRAIL的抗肿瘤活性，表现出了特殊的生理、药理活性，可进一步探索MCT-tag与其他抗肿瘤蛋白融合所产生融合蛋白的效果。

附图说明

图1.融合蛋白His-TTR、MCT-TTR的原核重组表达

融合蛋白His-TTR、MCT-TTR(SEQ ID No:4)融合表达产物，进行SDS-PAGE检测。图A及图B中未诱导全菌样品(CON)、IPTG诱导全菌样品(T)，诱导菌可溶性上清样品(S), 以及不溶性包涵体样品(I)通过13％SDS-PAGE电泳检测，诱导后融合蛋白以可溶形式在宿主菌内表达。M为蛋白电泳maker及其分子量(kD)；图A箭头所指为表达产物His-TTR 条带位置，图B箭头所指表达产物MCT-TTR条带位置。

图2.融合蛋白His-EGFP、MCT-EGFP的原核重组表达

融合蛋白His-EGFP、MCT-EGFP(SEQ ID No:10)融合表达产物，进行SDS-PAGE检测。图A及图B中未诱导全菌样品(CON)、IPTG诱导全菌样品(T)，诱导菌可溶性上清样品(S),以及不溶性包涵体样品(I)通过13％SDS-PAGE电泳检测，诱导后融合蛋白在宿主菌内可溶形式和包涵体形式均有表达。M为蛋白电泳maker及其分子量(kD)；图A箭头所指为表达产物His-EGFP条带位置，图B箭头所指表达产物MCT-EGFP条带位置。

图3.MCT融合促进不同温度诱导条件下TTR融合蛋白的表达

图A、图B为MCT-TTR、His-TTR两菌株在诱导条件分别为25℃、37℃时，宿主菌的生长趋势在25℃和37℃均没有明显差异，两图中黑色实线线所示为MCT-TTR，黑色虚线所示为His-TTR。图C诱导条件为25℃时，在不同时间点取样，13％SDS-PAGE电泳检测，MCT融合在诱导时间约为4h时开始促进TTR蛋白表达。图D，诱导条件为37℃时，在不同时间点取样，13％SDS-PAGE电泳检测，对比两融和蛋白表达量，MCT融合在诱导初期即促进TTR融合蛋白的表达。

图4.MCT融合促进不同温度诱导条件下EGFP融合蛋白的表达

图A、图B为MCT-EGFP、His-EGFP两菌株在诱导条件分别为25℃、37℃时，宿主菌的生长趋势及全菌荧光强度，两菌株生长趋势没有明显差异，但在低温诱导表达条件下，两宿主菌的全菌荧光强度均有所增强，且MCT-EGFP在两温度诱导条件下荧光强度均强于His-GFP。图C、图D分别为25℃、37℃诱导条件下，在不同时间点取样，进行 13％SDS-PAGE电泳检测。在25℃时，诱导4h后，MCT即明显促进EGFP的表达；在 37℃，诱导约1.5h，即可见MCT促进EGFP的表达。25℃诱导表达20h，37℃诱导表达 4h，超声破碎全菌样品，结果分别见图E、F所示。未诱导全菌样品(CON)、IPTG诱导全菌样品(T)，诱导菌可溶性上清样品(S),以及不溶性包涵体样品(I)，在低温时，两目的蛋白主要以可溶形式表达，在37℃诱导条件下，MCT-EGFP在上清和包涵体中均有大量表达，His-EGFP主要以可溶形式表达。

图5.咪唑浓度梯度洗脱His-TTR、MCT-TTR、His-EGFP、MCT-EGFP

图A为咪唑浓度梯度洗脱分别与镍基质结合的His-TTR、MCT-TTR，图B为咪唑浓度梯度洗脱分别与镍基质结合的His-EGFP、MCT-EGFP，两融合蛋白均在高浓度咪唑条件下洗脱。两融合蛋白在高浓度咪唑条件下洗脱，洗脱特性相似。提示MCT有作为融合蛋白标签，纯化目的蛋白的潜能。

图6.MCT融合标签不影响TTR的热力学稳定性

图6为TTR、MCT-TTR、His-TTR的热力学稳定性曲线。图A所示曲线，蛋白以天然状态起始，在不同尿素浓度条件下变性至平衡状态，计算蛋白变性50％时的尿素浓度，为Cm。图B、C所示曲线蛋白以变性状态起始，分别在不同浓度尿素和盐酸胍条件下复性至平衡状态，同样计算Cm。图A、B、C均为三次独立实验结果，依据均值及标准差作图，红色线为TTR，绿色线为MCT-TTR，黑色线为His-TTR。表1所示Cm结果，MCT 融合不影响TTR的热力学稳定性，而His融合降低TTR热力学稳定性。

图7.MCT融合标签不影响TTR在酸性条件下的稳定性

图7为在不同pH条件下，不同时间点，白藜芦醇结合实验测定TTR四聚体含量。在五个pH条件下，TTR与MCT-TTR，四聚体减少较慢，而His-TTR四聚体减少速度较快，提示在酸性条件下，His-TTR稳定性较TTR及MCT-TTR差。图所示为三次独立重复实验结果，依据均值及标准差作图。红色曲线为TTR，绿色曲线为MCT-TTR，黑色曲线为His-TTR。

图8.MCT融合标签对TTR的动力学稳定性影响较小

图8所示TTR、MCT-TTR、His-TTR复性动力学曲线，三次独立重复实验结果。运用origin 9拟合原始数据，TTR、MCT-TTR所用拟合公式为y＝y0+A1*(1-exp(-x/t1))+ A2*(1-exp(-x/t2))，快相复性速率常数K1＝1/t1，慢相复性速率常数K2＝1/t2，拟合结果 R2＞0.99；His-TTR所用拟合公式为y＝y0+A*(1-exp(-x/t))，复性速率常数K＝1/t，拟合结果R2＞0.99。圆形，三角形和方形点为原始数据，实线为拟合结果。表2所示为计算复性速率常数结果，MCT融合对TTR动力学稳定性影响较小。

图9.MCT融合标签加快EGFP的体外复性速率

图9所示His-EGFP、MCT-EGFP体外复性的动力学曲线，三次独立重复实验结果。运用origin 9拟合原始数据，所用拟合公式为y＝y0+A*(1-exp(-x/t))，复性速率常数K＝1/t，拟合结果R2＞0.99。圆圈为原始数据，实线为拟合结果。表3所示为复性速率常数计算结果，MCT融合促进EGFP体外复性。

图10.融合蛋白MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL的表达和制备。

重组MCT-TRAIL(a)和MCT-TGF3L-TRAIL(b)在E.coli TG1中进行表达，收取未诱导全菌样品(-)、IPTG诱导全菌样品(+)、诱导菌可溶性上清样品(S)、和不溶性包涵体样品(I)，在13％SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离检测。诱导后融合蛋白以包涵体形式在宿主菌内有效蓄积。蛋白电泳marker及其分子量(kD)如图所示；箭头所指为融合蛋白条带位置。

图11.TRAIL和MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL的聚集稳定性比较。

纯化并复性的TRAIL与MCT-TRAIL(1.0mg/ml)(左图)；TRAIL与 MCT-TGF3L-TRAIL(0.7mg/ml)(右图)置于37℃、室温或者4℃，并于不同的时间测量蛋白溶液的OD405，监测其浊度变化。

图12.重组可溶性TRAIL和新型MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白分别作用于非肿瘤细胞(人胚肺成纤维细胞HELF和人胚肾上皮细胞HEK293ET)和肿瘤细胞72小时后，利用MTT法或者resazurin还原实验检测细胞抑制率，图12为各个重组蛋白的细胞杀伤活性量效曲线。

图13.重组可溶性TRAIL和新型MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白单独或者与顺铂(Pt)合用，作用于人宫颈癌细胞HeLa，各自的细胞杀伤活性量效曲线的比较。

图14.重组可溶性TRAIL和新型MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人肺癌细胞NCI-H460。利用Hoechst33342染色，观察凋亡细胞的细胞核变化。白色箭头指示出现凝集，边聚，碎片化等凋亡征象的细胞核。

图15.重组可溶性TRAIL和MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人肺癌细胞NCI-H460和人结肠癌细胞Colo205，3小时、6小时后利用Annexin V/PI染色，观察细胞凋亡情况。标记为Annexin V⁺，PI^-的细胞(右下象限)认为是早期凋亡细胞。下方柱状图为统计早期凋亡细胞占总细胞数的百分比。

图16.重组可溶性TRAIL和新型MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人肺癌细胞NCI-H460，24小时后PI染色，用流式细胞仪分析细胞周期。Sub G1期认为是凋亡细胞所特有。

图17.重组可溶性TRAIL和MCT-TRAIL、MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人肺癌细胞NCI-H460和人结肠癌细胞Colo 205，在特定时间点收集细胞，检测细胞中Caspase-8 和caspase-3的水解情况。

图18.不同浓度的重组可溶性TRAIL和新型MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白处理人肺癌细胞NCI-H460(4小时)和人结肠癌细胞Colo205(6小时)，用化学发光试剂盒检测细胞中Caspase-8的活性。

图19.TRAIL融合蛋白与DR4和DR5的结合和活化。将Colo205(a)或NCI-H460(b) 与抗DR4和/或抗DR5的中和性单克隆抗体预孵育1小时，然后分别用TRAIL或 MCT-TRAIL或MCT-TGF3L-TRAIL处理48小时，利用resazurin还原法检测细胞存活率。 (c)将NCI-H460细胞与所示的各种不同的受体阻断性抗体一起预孵育，再用MCT-TRAIL 或MCT-TGF3L-TRAIL处理48小时，测定细胞存活率。

图20.MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL能够组装成聚合物。通过SEC-FPLC分析不同浓度稀释下的MCT-TGF3L-TRAIL(a)和MCT-TRAIL的色谱行为。通过SEC-FPLC分析在5mMEDTA存在的情况下，MCT-TGF3L-TRAIL(b)和MCT-TRAIL(d)的色谱行为。

图21.(a)利用凝胶过滤层析(细实线)和静态光散射(粗实线)分析重组可溶性TRAIL 和新型MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白的分子量大小。(b)利用动态光散射分析重组可溶性TRAIL和新型MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白的分子粒径。

图22.重组可溶性TRAIL或新型MCT-TRAIL，MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于Colo205裸鼠移植瘤模型3周后，剥离肿瘤拍照(a)。(b)瘤体积变化，(c)相对瘤体积变化，(d)瘤重，(e)裸鼠体重变化。

图23.人铜离子转运蛋白(hCtr1)的氨基酸残基序列。

说明：在说明书和说明书附图中，TTR指天然人甲状腺素运载蛋白，His-TTR指His-tag 与人甲状腺素运载蛋白的融合蛋白，MCT-TTR指MCT-tag与人甲状腺素运载蛋白的融合蛋白。His-EGFP指His-tag与增强绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白，MCT-EGFP指 MCT-tag与增强绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白。TRAIL指肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，MCT-TRAIL指MCT-tag与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明进行具体描述或进一步说明，其目的在于更好地理解本发明的技术内涵，具体说明本发明中，新型融合载体蛋白的使用方法及相应融合表达系统的效果，但是本实施例并不限定本发明的保护范围。

实验方法：

常规质粒构建所涉及的PCR、酶切、连接等实验，以及蛋白质表达所涉及的转化、细菌培养等实验为本领域研究人员所熟悉，所以具体相关实验细节没有详细注明，具体可参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著)所述常规实验条件。

1、基因克隆与表达载体构建：

目的蛋白或多肽编码基因通过人工合成及PCR扩增获得，构建相关重组表达载体，所有载体的目的基因序列均经核酸序列测定验证。

2、融合蛋白的诱导表达：

将相关重组质粒转化到E.coli TG1或BL21(DE3)pLysS感受态，得到目的工程菌株。具体实施例均采用实验室小规模摇瓶表达。在37℃条件下含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中振荡活化16h，之后将过夜培养物按1:100比例转到新的含有氨苄青霉素抗性的LB培养基(约300mL)中，37℃振荡培养至合适对数生长期(OD₆₀₀＝0.5-0.7)，25℃，1mM IPTG诱导表达20h或37℃，1mM IPTG诱导表达4h。

取未诱导、诱导菌液各1mL，7000rpm于4℃离心5min后弃上清，收集菌体，用 200μL体积的PBS重悬后直接加入50μL体积的5×SDS上样缓冲液(300mM Tris-HCl(pH 6.8)、20％β-巯基乙醇、20％SDS、25％甘油、0.05％溴酚蓝)，沸水浴20min，-20℃保存，作为未诱导、诱导全菌样品。取诱导样品100mL，7000rpm于4℃离心5min后弃上清，收集菌体，用18mL体积的PBS重悬，加入1mL 20％Triton X-100后混匀，超声破菌10min。取1mL全菌裂解样品12000rpm于4℃离心15min，上清、沉淀分离。取200 μL体积的上清，加入50μL体积的5×SDS上样缓冲液，沸水浴20min，-20℃保存，作为诱导上清样品。将沉淀用1mL体积的PBS重悬后取其中200μL加入50μL体积体积 5×SDS上样缓冲液，沸水浴20min，-20℃保存，作为诱导包涵体样品。上述各种样品在电泳检测中的稀释度相同，其蛋白含量具有直接可比性。

3、蛋白电泳(SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE)与定量：

SDS-PAGE凝胶按常规方法配制。对已制备好的未诱导全菌样品、诱导全菌样品、诱导上清样品、诱导包涵体样品等体积上样，进行13％SDS-PAGE检测。先恒压80V电泳30min，再恒压125V。电泳结束后进行考马斯亮蓝R-250染色，经脱色后得电泳结果。

以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作为标准品，上样2、3、4μg BSA及合适量的上述全菌、包涵体、上清样品，同时进行电泳检测，对脱色后的凝胶蛋白条带用QuantiScan软件进行灰度扫描，依据BSA定量的标准曲线计算融合蛋白含量。

实施例1：融合蛋白MCT-TTR、His-TTR的重组原核表达

分别构建MCT-TTR、His-TTR融合蛋白表达载体，将构建好的质粒转入E.coli。过夜活化的菌液按1:100的比例转到新的含有氨苄青霉素抗性的LB培养基(约300mL)中，37℃振摇至生长对数期(OD₆₀₀＝0.5-0.7)，在25℃，1mM IPTG条件下诱导20h，在37℃，1 mM IPTG条件下诱导4h。在不同的时间点取样测OD₆₀₀，观察宿主菌生长趋势，并取样进行13％SDS-PAGE电泳检测。结果如图1、图3所示，在不同温度的诱导条件下，两宿主菌的生长趋势没有明显差异，但MCT-TTR融合蛋白的表达量明显多于His-TTR。

实施例2：融合蛋白MCT-EGFP、His-EGFP的重组原核表达

分别构建MCT-EGFP、His-EGFP融合蛋白表达载体，将构建好的质粒转入E.coli。过夜活化的菌液按1:100的比例转到新的含有氨苄青霉素抗性的LB培养基(约300mL)中， 37℃振摇至生长对数期(OD₆₀₀＝0.5-0.7)，在25℃，1mM IPTG条件下诱导20h，在37℃， 1mMIPTG条件下诱导4h。在不同的时间点取样测OD₆₀₀及全菌荧光强度(激发光488，发射光509)观察宿主菌生长趋势，并取样进行13％SDS-PAGE电泳检测。结果如图2、图4所示，在不同温度的诱导条件下，两宿主菌的生长趋势没有明显差异。在低温诱导条件下，两菌株全菌荧光强度明显增强，与低温诱导促进EGFP上清表达有关。25℃诱导条件下，在诱导后期His-EGFP全菌荧光强度有所降低且电泳鉴定全菌蛋白表达量减少，说明低温条件下，His-EGFP在表达后期有蛋白降解。在37℃诱导条件下，MCT-EGFP在诱导2h后，全菌荧光强度即强于His-EGFP，即MCT融合促进EGFP表达。

实施例3：MCT融合蛋白与His融合蛋白洗脱特性比较

咪唑梯度洗脱分别与镍基质结合的MCT-TTR、His-TTR、MCT-EGFP、His-EGFP融合蛋白，比较其洗脱特性。平衡液，0.02M NaH₂PO₄，0.02M Na₂HPO₄，pH 7.4，500mM NaCl，洗脱液，0.02M NaH₂PO₄，0.02M Na₂HPO₄，pH 7.4，500mM NaCl，500mM咪唑。利用快速蛋白纯化系统(FPLC)洗脱与镍柱结合的融合蛋白，结果如图5所示。图5A，MCT-TTR 在咪唑浓度约为220Mm时开始洗脱，320Mm时洗脱结束，His-TTR在咪唑浓度约为 280Mm时开始洗脱，380Mm时洗脱结束。图5B，MCT-EGFP在咪唑浓度约为180Mm时开始洗脱，280Mm时结束洗脱，His-EGFP在咪唑浓度约为200Mm时开始洗脱，280Mm 时洗脱结束。以上结果说明MCT融合蛋白与His融合蛋白均在高浓度咪唑洗脱条件下洗脱，提示MCT与His相似，可作为融合标签，融合于重组蛋白末端，利用金属基质亲和层析纯化重组目的蛋白。

实施例4：TTR、MCT-TTR、His-TTR热力学稳定性比较

融合蛋白的变性曲线，盐析后蛋白溶于磷酸盐缓冲液(50mM sodium phosphate,100 mM KCl,1mM EDTA,pH 7.6)，离心去除不溶物，与不同尿素浓度的缓冲液内(urea,50mMsodium phosphate,100mM KCl,1mM EDTA,pH 7.6)按1:9稀释，融合蛋白四聚体终浓度为2μM，在4℃放置4d，取出后室温放置1h。白藜芦醇与TTR融合蛋白四聚体结合而不与单体结合，结合后发射光波长发生蓝移，394nm的荧光强度与融合蛋白四聚体的含量成正比。因此可运用白藜芦醇结合实验测定TTR融合蛋白四聚体浓度。结果如图6中图A所示，独立实验，重复三次所得结果。

融合蛋白的在尿素或盐酸胍溶液中的复性曲线，盐析后蛋白溶于磷酸盐缓冲液(50 mM sodium phosphate,100mM KCl,1mM EDTA,pH 7.6)，与9M尿素缓冲液(9M urea,50mM sodium phosphate,100mM KCl,1mM EDTA,pH 7.6)或6M盐酸胍缓冲液(6M GuHCl, 50mMsodium phosphate,100mM KCl,1mM EDTA,pH 7.6)按1:9比例稀释，沸水浴10min，补足体积后，与不同浓度尿素或盐酸胍缓冲液按1:9比例稀释，TTR融合蛋白四聚体的终浓度为2μM。室温放置1d，白藜芦醇结合实验测定TTR四聚体浓度。结果如图6中图B、图C所示，独立实验，重复三次所得结果。

高浓度变性液测得荧光值作为0％，低浓度变性液测得荧光值作为100％，Grapghpad prism 5计算TTR融合蛋白四聚体含量为50％时，变性液浓度Cm。结果如表1所示， MCT-TTR、His-TTR分别与TTR做成对t检验，**p＜0.01，有显著性差异，ns p＞0.05，无统计学差异。

Cm越高表示融合蛋白在变性剂存在的条件下越稳定。因此，在尿素存在的情况下，MCT-TTR与TTR的稳定性没有差异，而His-TTR稳定性较差。在盐酸胍存在的情况下，三种融合蛋白的稳定性有显著差异，且TTR稳定性最好，MCT-TTR稳定性其次，His-TTR 稳定性最差。

表.1复性或变性曲线四聚体含量为50％时的变性液浓度

实施例5：TTR、MCT-TTR、His-TTR在酸性条件下稳定性比较

盐析后的融合蛋白溶于实施例4所述磷酸盐缓冲液，离心去除不溶物，四聚体终浓度为8μM，与不同pH的酸化液(200mM sodium acetate,,100mM KCl,1mM EDTA)按1:1 的比例混匀，在不同的时间点取样，白藜芦醇结合实验测定TTR融合蛋白四聚体的浓度。初始混匀时测定荧光值的平均值记为100％，所得结果如图7所示。酸化液Ph为3.8时，三种蛋白四聚体解聚速度较快，ph升高后，TTR与MCT-TTR解聚速度下降，而His-TTR 在24h内完全解聚。说明MCT-TTR与TTR在酸性条件下稳定性相似，而His-TTR稳定性较差。

实施例6：TTR、MCT-TTR、His-TTR动力学稳定性比较

盐析后的融合蛋白溶于实施例4所述磷酸盐缓冲液，离心去除不溶物，与实施例4所述9M尿素变性液按1:9比例混匀，沸水浴10min，冷却至室温后，补足体积。上述磷酸缓冲液将蛋白变性液稀释10倍，并加入2μM白藜芦醇，复性开始后，EnSpire Multimode Reader读取荧光变化值，记录复性曲线，参数设定：激发波长320nm，发射波长394nm， interval45s，repeats 45次。制备含8.1M urea的蛋白纯化液，磷酸盐缓冲液稀释10倍后，测定荧光值，记录为变性前的初始荧光值(Fi)。总左边荧光值经校正(实际值/Fi)后， Origin 9绘制复性速率曲线，TTR、MCT-TTR所得曲线用公式y＝y0+A1*(1-exp(-x/t1))+ A2*(1-exp(-x/t2))拟合，快相复性速率常数K1＝1/t1，慢相复性速率常数K2＝1/t2，拟合结果R2＞0.99，而His-TTR复性曲线使用上述公式拟合失败，因此采用公式y＝y0+A*(1- exp(-x/t))拟合，复性速率常数K＝1/t，拟合结果R2＞0.99。图8所示结果为三次独立重复实验均值。

复性速率常数计算结果见表2。

表.2 TTR、MCT-TTR于His-TTR的复性速率常数

实施例7：MCT融合促进EGFP的体外复性

MCT-EGFP与His-EGFP分别制备含8.1M urea的蛋白纯化液，加入5mM DTT沸水浴5min。冷却至室温后，补足体积。用含5mM DTT的缓冲液(13.3mM NaCl，0.27Mm KCl， 0.43MmNa₂HPO₄，0.14Mm KH₂PO₄)将变性蛋白液稀释10倍，复性开始后，EnSpire Multimode Reader读取荧光值变化F，记录复性曲线。参数设定：激发波长488nm，发射波长509nm，interval30s，repeats 66次。

制备含8.1M urea的蛋白纯化液，上述缓冲液稀释10倍，测定荧光值，记录为变性前的原始荧光值Fi，复性体系复性15h，测定荧光值，记录为复性荧光值Fr。复性率＝Fr/Fi。纵坐标荧光值经校正(实际值/Fi),Origin 9绘制EGFP复性速率曲线，结果如图9所示，所得曲线用公式y＝y0+A*(1-exp(-x/t))拟合，复性速率常数K＝1/t，拟合结果R2＞0.99。独立实验，重复3次，MCT-EGFP与His-EGFP所得结果进行成对t-检验。

实验结果如表3所示，MCT-EGFP融合速率常数大于His-EGFP，且有统计学差异。

表.3 MCT-EGFP与His-EGFP的速率常数及复性后荧光强度

实施例8：MCT-TRAIL、MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白的构建，表达，纯化和复性

分别构建MCT-TRAIL、MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白表达载体，将构建好的质粒转入E.coli。过夜活化的菌液按1:100的比例转到新的含有氨苄青霉素抗性的LB培养基(约300mL)中，37℃振摇至生长对数期(OD₆₀₀＝0.2-0.4)，在37℃，1mM IPTG条件下诱导过夜，菌液于4℃条件下，7000rpm离心5min后弃上清，收集菌体，用10mL体积的PBS 重悬后，加入Triton X-100使其终浓度为1％，混匀，冻融裂解，超声破菌20min。超声后菌液于4℃，12000rpm离心5min后弃上清，得包涵体，-20℃保存。

将包涵体沉淀用包涵体洗液A(50mM Tris-HCl，pH 7.6，3％Triton X-100和20mMEDTA)重悬，于4℃，12000rpm离心5min，重复洗涤两次。用包涵体溶解液(20mM Tris-HCl，6MGuHCl，20mM DTT，pH 9.5)溶解包涵体，室温搅拌2-4h。

溶解后的溶液经离心获得澄清上清，将其缓慢加入到约为其5倍体积的复性液(50mM TrisHCl，500mM NaCl，0.5M Urea，0.4M L-Arg，2mM DTT，0.1mM ZnSO4， pH 9.0)中，4℃放置1h。随后在透析复性液(20mM TrisHCl，700mM NaCl，pH 9.0) 中进行透析，换液3-4次，间隔4-10小时。于4℃12000rpm离心15min，得到复性蛋白上清。

采用固定化Ni²⁺螯合层析法纯化复性后的蛋白。层析柱用10倍柱体积的结合缓冲液(20mM Tris-HCl，6M GuHCl，pH 9.5)平衡，样品用含有50-500mM咪唑的结合缓冲液进行梯度洗脱。洗脱样品加入硫酸铵至70％饱和度，于4℃，12000rpm离心15min，沉淀用溶解缓冲液(20mM Tris-HCl，700mM NaCl，pH 7.5)重新溶解。

制备过程利用SDS-PAGE进行跟踪检测，如图10所示，融合蛋白能够有效的复性和纯化。

实施例9：蛋白溶液稳定性测定

利用浊度监测来评价蛋白溶液的稳定性。将TRAIL和融合蛋白的溶液分别置于37℃，室温和4℃孵育不同的时间。取100μl蛋白样品加入平底96孔透明板，测定OD405的吸光度，每个样品设置三个重复孔。结果如图11所示，TRAIL的稳定性最差，37℃时数分钟溶液即出现浑浊，室温时在6小时左右也出现明显的浑浊。而MCT和 MCT-TGF3L-TRAIL都表现出比TRAIL更稳定的溶液稳定性。

实施例10：融合蛋白细胞活性测试

各细胞株在含有10％胎牛血清(杭州生物工程材料有限公司)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基(美国Gibico公司)中培养，温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。

将细胞消化成为单个细胞后，按一定浓度加入96孔培养板(100μL/孔)，置于37℃，5％CO₂的孵箱培养24小时。加入不同浓度待测蛋白，作用72小时后弃去培养液，每孔加入100μL含0.5mg/ml MTT的RPMI-1640培养基。置于37℃，5％CO2的孵箱培养 4小时，弃去培养液，每孔加入DMSO 150μL，常温下震摇10min，使蓝色结晶完全溶解，用Thermo酶标仪测定每孔吸光度，检测波长570nm。

细胞毒性还通过resazurin还原法测定。细胞接种在96孔板中，并用如上所述的蛋白质处理48h后，加入10μl resazurin(2mM)孵育2小时，通过EnSpire Multimode PlateReader(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)测量还原后的resazurin(530/590nm)的荧光强度。

以上两种方法均按照下面公式计算每组剂量中的每个平行孔的抑制百分率的平均数和标准差：待测品抑制率％＝(阴性对照OD-待测化合物OD)/(阴性对照OD-本底OD) ×100％

假设未加细胞未加药为本底即为100％抑制，只加细胞未加入待测化合物的为阴性对照即为0％抑制。结果如和图12所示，两种融合蛋白与TRAIL一样，不会对正常细胞HELF产生毒性作用，但是在肿瘤细胞中，这两种融合蛋白的活性都有明显提高，在Colo205细胞中，它们的活性比TRAIL可高出上万倍。

表4.重组可溶性TRAIL与MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL融合蛋白体外抗肿瘤活性(3-5次平行实验IC₅₀平均值与标准差，nM)以及融合蛋白活性相对TRAIL的增强倍数(各平行实验增强倍数的平均值)。

实施例11：顺铂与MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL联合应用

在HeLa细胞上联合给顺铂和MCT-TRAIL或MCT-TGF3L-TRAIL，二者以1:1摩尔比共同加入细胞培养液中，培养72h后，利用MTT检测细胞活力。图13显示，两者合用并不能提高抗肿瘤作用。

实施例12：融合蛋白诱导凋亡活性测试

利用Hoechst 33342对细胞核进行染色，检测凋亡。将人肺癌细胞NCI-H460以10000/ 孔的密度细胞种植于96孔板，以不同浓度的蛋白溶液进行处理。37℃孵育4小时后，加入终浓度为5μg/ml的Hoechst 33342对细胞进行染色，室温放置15min，利用倒置荧光显微镜观察。凋亡细胞的细胞核会出现浓缩，边聚和碎片化(图14)。

利用Annexin V/PI双染检测细胞的早期凋亡。10 0000/孔的细胞(NCI-H460或者Colo205)接种于12孔板，以不同浓度蛋白药物对其进行处理3h或者6h。之后用Annexin V-EGFP凋亡检测试剂盒(Vigorous Biotechnology,Beijing,China)进行染色，利用流式细胞仪进行检测(图15)。

NCI-H460以1 00 000/孔接种于六孔板，用不同浓度TRAIL和融合蛋白处理24h后，用胰酶消化，PBS清洗，70％乙醇固定过夜，之后用PI染色，流式细胞仪分析细胞周期。 Sub-G1峰代表凋亡细胞(图16)。

结果显示，两种融合蛋白都能够有效诱导肿瘤细胞凋亡，并且起效浓度与TRAIL相比可以降低数百到数千倍。

实施例13：Caspase活性检测

利用Western blot检测caspase-8和caspase-3裂解情况。NCI-H460或者Colo205细胞经过不同药物处理不同时间后，胰酶消化并用PBS清洗，用裂解液裂解，定量后加入Laemmli缓冲液，加热5min，随后进行SDS-PAGE。将胶上的蛋白湿转到PVDF膜，用 5％脱脂奶粉封闭2h，一抗4℃孵育过夜，与HRP标记的二抗孵育室温孵育1h，利用化学发光试剂盒和ImageQuant LAS 4000 ECL设备进行曝光。目的条带如图17所示。

结果显示，两种融合蛋白都可以有效的活化caspase-8和caspase-3，并且起效浓度与 TRAIL相比降低了千倍。

利用caspase-8活性检测试剂盒(Caspase-8Promega)检测caspase-8的活性。 NCI-H460或Colo205细胞以15000/孔的密度接种于96孔细胞培养板内，经过药物处理4(NCI-H460)或者6小时(Colo205)后，将试剂盒的buffer按等体积加入孔中，室温孵育1.5h，利用酶标仪检测化学发光强度，并与未给药组对比(图18)，计算增强倍数。

实施例14：抗体阻断实验

在抗体阻断实验中，将Colo205(每孔2000个细胞)和NCI-H460(每孔800个细胞)与10μg/ml的每种拮抗性抗体，或其组合预孵育1小时，然后用200nM TRAIL或0.2nM MCT-TRAIL或0.2nM MCT-TGF3L-TRAIL处理48小时，最后利用resazurin还原测定细胞活力。结果如图19所示。可见两种融合蛋白依然是特异性的作用于DR4和DR5受体，其他受体如DcR1，DcR2，TNFR1，FAS或lymphotoxinβR的中和性抗体，并不能对 MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL的细胞毒性作用产生影响。

实施例15：凝胶过滤层析检测融合蛋白形成高聚体

利用凝胶过滤层析柱Superdex 200增加10/300GL柱(GE Healthcare Bio-Sciences， Pittsburgh，PA，USA)分析MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL的分子量范围，蛋白质层析在纯化器FPLC系统(GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，PA，USA)上进行。先用溶解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5,700mM NaCl)平衡柱子，将高速离心，并除菌过滤后的蛋白质溶液手动进样100μl，以0.5ml/min的流速在4℃下进行色谱分离，并记录OD280。我们分析了不同浓度下(a，c)以及在EDTA存在时(b，d)的MCT-TRAIL 和MCT-TGF3L-TRAIL色谱行为，结果如图20所示。融合蛋白能够形成高聚体，该高聚体的含量不因溶液浓度降低而降低；EDTA能够降低MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL 的高聚体含量。

实施例16：静态光散射与动态光散射

利用静态光散射测量TRAIL和融合蛋白的分子量，所用仪器为MALS Dawn HeleosII (Wyatt,Santa Barbara,CA,USA)。样品测试过程中，周围温度控制在18℃，用BSA溶液来校准仪器。分子量和均方根回转半径用ASTRA V软件(Wyatt Technologies)分析。图 21a显示，TRAIL的分子量为20、38、56kDa，分别对应单体，二聚体和三聚体。MCT-TRAIL 和MCT-TGF3L-TRAIL可以形成高聚体，分子量在10⁶-10⁷g/mol。

利用动态光散射确定粒子的半径，仪器为Malvern Zetasizer Nano ZSP(Malvern, Herrenberg,Germany)。样品高速离心后(10000rpm×10min)取上清，经0.22μm膜过滤除尘。对每个样品有3-5个测量循环。结果如图21b所示，TRAIL流体力学半径约为5nm， MCT-TRAIL半径约19nm，MCT-TGF3L-TRAIL半径约16nm，再一次证明，它们形成了高聚体。

实施例17：裸鼠移植瘤模型

所有动物实验都符合实验动物指南，并且经过北京协和医学院和中国医学科学院动物福利委员会批准。

体外培养的Colo205细胞接种于4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠(Beijing HuafukangBioscience,Beijing,China)右肩背部，待其生长3-4周后，用插块接种的方式，对肿瘤进行传代。将移植瘤传代三次后，当肿瘤达到100-300mm³进行随机分组。每组动物每日腹腔注射给药，用溶解缓冲液(20mM Tris-HCl，700mM NaCl，pH 7.5)作为对照。每周对肿瘤体积和裸鼠体重进行2-3测量。瘤体积计算公式为：瘤体积＝0.5×(长×宽²)。实验最后，剥离肿瘤称重并拍照。结果如图22所示，MCT-TRAIL和MCT-TGF3L-TRAIL 能够有效的抑制裸鼠移植瘤的生长，其抑瘤作用与TRAIL相当。

序列表

<110> 中国医学科学院药物研究所

<120> 一种新型金属亲和性融合蛋白标签及其应用

<130> P18088

<150> 201711354418.2

<151> 2017-12-15

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atggaccact ctcaccacat gggtatgtct tacatggact ctaactctac catgcagccg 60

tctcaccacc accct 75

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Asp His Ser His His Met Gly Met Ser Tyr Met Asp Ser Asn Ser

1 5 10 15

Thr Met Gln Pro Ser His His His Pro

20 25

<210> 3

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggaccact ctcaccacat gggtatgtct tacatggact ctaactctac catgcagccg 60

tctcaccacc accctacggg caccggtgaa tccaagtgtc ctctgatggt caaagttcta 120

gatgctgtcc gaggcagtcc tgccatcaat gtggccgtgc atgtgttcag aaaggctgct 180

gatgacacct gggagccatt tgcctctggg aaaaccagtg agtctggaga gctgcatggg 240

ctcacaactg aggaggaatt tgtagaaggg atatacaaag tggaaataga caccaaatct 300

tactggaagg cacttggcat ctccccattc catgagcatg cagaggtggt attcacagcc 360

aacgactccg gcccccgccg ctacaccatt gccgccctgc tgagccccta ctcctattcc 420

accacggctg tcgtcaccaa tcccaaggaa taa 453

<210> 4

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Met Asp His Ser His His Met Gly Met Ser Tyr Met Asp Ser Asn Ser

1 5 10 15

Thr Met Gln Pro Ser His His His Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys

20 25 30

Cys Pro Leu Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala

35 40 45

Ile Asn Val Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp

50 55 60

Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly

65 70 75 80

Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile

85 90 95

Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu

100 105 110

His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr

115 120 125

Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val

130 135 140

Val Thr Asn Pro Lys Glu

145 150

<210> 5

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atggaccact ctcaccacat gggtatgtct tacatggact ctaactctac catgcagccg 60

tctcaccacc accctgtgag agaaagaggt cctcagagag tagcagctca cataactggg 120

accagaggaa gaagcaacac attgtcttct ccaaactcca agaatgaaaa ggctctgggc 180

cgcaaaataa actcctggga atcatcaagg agtgggcatt cattcctgag caacttgcac 240

ttgaggaatg gtgaactggt catccatgaa aaagggtttt actacatcta ttcccaaaca 300

tactttcgat ttcaggagga aataaaagaa aacacaaaga acgacaaaca aatggtccaa 360

tatatttaca aatacacaag ttatcctgac cctatattgt tgatgaaaag tgctagaaat 420

agttgttggt ctaaagatgc agaatatgga ctctattcca tctatcaagg gggaatattt 480

gagcttaagg aaaatgacag aatttttgtt tctgtaacaa atgagcactt gatagacatg 540

gaccatgaag ccagtttttt tggggccttt ttagttggct aa 582

<210> 6

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Met Asp His Ser His His Met Gly Met Ser Tyr Met Asp Ser Asn Ser

1 5 10 15

Thr Met Gln Pro Ser His His His Pro Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln

20 25 30

Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu

35 40 45

Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn

50 55 60

Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His

65 70 75 80

Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile

85 90 95

Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr

100 105 110

Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr

115 120 125

Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser

130 135 140

Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe

145 150 155 160

Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His

165 170 175

Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val

180 185 190

Gly

<210> 7

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atggaccact ctcaccacat gggtatgtct tacatggact ctaactctac catgcagccg 60

tctcaccacc accctgtttg ccactctggt tacgttggtg ctcgttgcga acacgctgac 120

ctgctgggtg gtagatccgt gagagaaaga ggtcctcaga gagtagcagc tcacataact 180

gggaccagag gaagaagcaa cacattgtct tctccaaact ccaagaatga aaaggctctg 240

ggccgcaaaa taaactcctg ggaatcatca aggagtgggc attcattcct gagcaacttg 300

cacttgagga atggtgaact ggtcatccat gaaaaagggt tttactacat ctattcccaa 360

acatactttc gatttcagga ggaaataaaa gaaaacacaa agaacgacaa acaaatggtc 420

caatatattt acaaatacac aagttatcct gaccctatat tgttgatgaa aagtgctaga 480

aatagttgtt ggtctaaaga tgcagaatat ggactctatt ccatctatca agggggaata 540

tttgagctta aggaaaatga cagaattttt gtttctgtaa caaatgagca cttgatagac 600

atggaccatg aagccagttt ttttggggcc tttttagttg gctaa 645

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 8

Met Asp His Ser His His Met Gly Met Ser Tyr Met Asp Ser Asn Ser

1 5 10 15

Thr Met Gln Pro Ser His His His Pro Val Cys His Ser Gly Tyr Val

20 25 30

Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Arg

35 40 45

Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly

50 55 60

Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu

65 70 75 80

Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe

85 90 95

Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys

100 105 110

Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu

115 120 125

Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr

130 135 140

Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg

145 150 155 160

Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr

165 170 175

Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser

180 185 190

Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe

195 200 205

Gly Ala Phe Leu Val Gly

210

<210> 9

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

atggaccact ctcaccacat gggtatgtct tacatggact ctaactctac catgcagccg 60

tctcaccacc accctatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 120

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 180

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 240

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 300

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 360

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 420

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 480

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 540

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 600

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 660

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 720

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 780

gagctgtaca ag 792

<210> 10

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 10

Met Asp His Ser His His Met Gly Met Ser Tyr Met Asp Ser Asn Ser

1 5 10 15

Thr Met Gln Pro Ser His His His Pro Met Val Ser Lys Gly Glu Glu

20 25 30

Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val

35 40 45

Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr

50 55 60

Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro

65 70 75 80

Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys

85 90 95

Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser

100 105 110

Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp

115 120 125

Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr

130 135 140

Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly

145 150 155 160

Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val

165 170 175

Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys

180 185 190

Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr

195 200 205

Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn

210 215 220

His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys

225 230 235 240

Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr

245 250 255

Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

260

Claims (16)

1.一种金属亲和性融合蛋白标签，其特征在于，其氨基酸序列来源于人铜离子转运蛋白胞外段的N末端1-25个氨基酸序列。

2.根据权利要求1的金属亲和性融合蛋白标签，其特征在于，所述的金属亲和短肽的氨基酸序列选自SEQ ID No:2。

3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有权利要求1-2任一项所述金属亲和性融合蛋白标签以及至少一个目的蛋白或多肽，且该目的蛋白或多肽不是人铜离子转运蛋白。

4.根据权利要求3的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白中目的蛋白或多肽含有5-1000个氨基酸残基。

5.根据权利要求4的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白中目的蛋白或多肽选自人甲状腺素运载蛋白、TRAIL和其同类物及TRAIL的变体、EGFP。

6.根据权利要求5的融合蛋白，其特征在于，所述的TRAIL的变体选自TRAIL与TGF-α第三环区序列的融合分子。

7.根据权利要求5的融合蛋白，所述融合蛋白标签与人甲状腺素运载蛋白融合得到的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:4；所述融合蛋白标签与TRAIL融合得到的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:6；所述融合蛋白标签与TRAIL的变体融合得到的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:8；所述融合蛋白标签与EGFP融合得到的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:10。

8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为编码权利要求1-2任一项所述金属亲和性融合蛋白标签的基因序列。

9.根据权利要求8的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的基因序列为SEQ ID No:1。

10.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为编码权利要求3-7任一项所述融合蛋白的基因序列。

11.根据权利要求10的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的基因序列为SEQ IDNo:3、SEQ ID No:5、SEQ ID No:7、SEQ ID No:9。

12.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求8-9任一项所述核酸分子，该核酸分子连接于载体的启动子用于核酸分子编码蛋白的表达。

13.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求10-11任一项所述核酸分子，该核酸分子连接于载体的启动子用于核酸分子编码蛋白的表达。

14.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求8-11任一项所述的核酸分子或权利要求12-13任一项所述的表达载体。

15.权利要求1-2任一项所述的金属亲和性融合蛋白标签或权利要求8-9任一项所述的核酸分子和权利要求12所述的表达载体在纯化融合蛋白中的应用。

16.一种表达目的蛋白的融合方法，其特征在于，该方法是将权利要求1所述的金属亲和性融合蛋白标签和目的蛋白融合获得新型融合蛋白的方法。