CN107266523A - 蛋白质的纯化方法及含肽标签的融合蛋白质及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质的纯化方法及含肽标签的融合蛋白质及其生产方法，更具体涉及包括调制包含含有含12个残基以上的酸性氨基酸残基的肽标签的氨基酸序列和目标蛋白质的氨基酸序列的融合蛋白质的试样的工序、及分离与上述融合蛋白质一同含在上述试样中的混杂蛋白质和上述试样中的融合蛋白质的工序的蛋白质的纯化方法。

Description

蛋白质的纯化方法及含肽标签的融合蛋白质及其生产方法
【技术领域】
本发明涉及蛋白质的纯化方法以及含肽标签的融合蛋白质及其生产方法。
【背景技术】
由分子生物学的进展，向大肠杆菌、酵母、细胞等的宿主导入编码目的蛋白质的重组基因，发展出了大量表达的系统。在这样的系统中，在从宿主调制的试样中，由于与目的蛋白质一同含宿主来源的内源性蛋白质等的混杂蛋白质，有进一步纯化目的蛋白质的必要。作为纯化目的蛋白质的方法，例如，在Stubenrauch K,et al,Purification of aviral coat protein by an engineered polyionicsequence.J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl：737:77-84,2000中，公开了向多瘤VP1蛋白导入谷氨酸8个和半胱氨酸，纯化VP1蛋白质的方法。
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明以提供可简便地得到高纯度的重组蛋白质的纯化方法作为课题。
【解决课题的技术方案】
本发明是蛋白质的纯化方法，其包括调制含有含肽标签的氨基酸序列和目标蛋白质的氨基酸序列的融合蛋白质的试样的工序、及分离与融合蛋白质一同含在试样中的混杂蛋白质和试样中的融合蛋白质的工序，肽标签是含12个残基以上的酸性氨基酸残基。
另外，本发明是含有含12个残基以上的酸性氨基酸残基的肽标签的氨基酸序列和目标蛋白质的氨基酸序列的融合蛋白质。
【发明效果】
可由简便的方法得到纯化度高的重组蛋白质。
【附图说明】
【图1】是模式地显示本实施方式的纯化方法的原理的图。(a)显示分离工序、(b)及(c)显示目标蛋白质取得工序。
【图2】是显示在实施例1中的SDS(十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果的图。
【图3】是显示在实施例2中的SDS-PAGE的结果的图。
【图4】是显示在实施例3中的SDS-PAGE的结果的图。
【图5】是显示在实施例4中的SDS-PAGE的结果的图。
【图6】是显示在实施例5中的SDS-PAGE的结果的图。
【图7】是显示在实施例6中的SDS-PAGE的结果的图。
【图8】是显示在实施例7中的SDS-PAGE的结果的图。
【图9】是显示在实施例8中的SDS-PAGE的结果的图。
【图10】是显示在实施例9中的SDS-PAGE的结果的图。
【图11】是显示在实施例10中的SDS-PAGE的结果的图。
【图12】是显示在实施例11中的SDS-PAGE的结果的图。
【图13】是显示在实施例12中的SDS-PAGE的结果的图。
【图14】是显示在实施例13中的SDS-PAGE的结果的图。
【图15】是显示在比较例1中的SDS-PAGE的结果的图。
【图16】是显示在实施例14中的SDS-PAGE的结果的图。
【图17】是显示在实施例15中的SDS-PAGE的结果的图。
【图18】是显示在实施例16中的SDS-PAGE的结果的图。
【图19】是显示在实施例17中的SDS-PAGE的结果的图。
【图20】是显示在实施例18中的SDS-PAGE的结果的图。
【图21】是显示在实施例19中的SDS-PAGE的结果的图。
【图22】是显示在实施例20中的SDS-PAGE的结果的图。
【图23】是显示在实施例21中的SDS-PAGE的结果的图。
【图24】是显示在实施例22中的SDS-PAGE的结果的图。
【图25】是显示在实施例23中的SDS-PAGE的结果的图。
【图26】是显示在实施例24中的SDS-PAGE的结果的图。
【图27】是显示在实施例25中的SDS-PAGE的结果的图。
【图28】是显示在实施例26中的SDS-PAGE的结果的图。
【图29】是显示在实施例27中的SDS-PAGE的结果的图。
【图30】是显示在实施例28中的SDS-PAGE的结果的图。
【实施方式】
本实施方式的纯化方法包括调制含有含肽标签的氨基酸序列及目标蛋白质的氨基酸序列的融合蛋白质和混杂蛋白质的试样的工序(试样调制工序)，及分离融合蛋白质和混杂蛋白质的工序(分离工序)。混杂蛋白质是指宿主来源的内源性蛋白质等融合蛋白质或目标蛋白质以外的蛋白质。
(试样调制工序)
融合蛋白质含肽标签和目标蛋白质的氨基酸序列。肽标签只要含12个残基以上的酸性氨基酸残基即可。在肽标签中的酸性氨基酸残基数，在分离工序中，为了与混杂蛋白质的分离变得更良好，可进一步抑制对由目标蛋白质的等电点及缓冲液的pH等的导致分离的影响，优选18个残基以上的，更优选24个残基以上的，再优选30个残基以上的，特别优选36个残基以上的。酸性氨基酸残基数的上限不特别限定，但从对融合蛋白质的立体结构的影响等的观点来看，优选100残基以下，更优选70残基以下。肽标签中所含的酸性氨基酸残基可为天冬氨酸残基或谷氨酸残基的任一方，也可为两方。肽标签，除了酸性氨基酸残基之外，也可含中性氨基酸残基及/或碱性氨基酸残基，但酸性氨基酸残基数对肽标签整体的氨基酸残基数的比例，为了与混杂蛋白质的分离变得更良好，优选20％以上，更优选60％以上。另外，在肽标签整体的序列中，含酸性氨基酸残基的氨基酸序列可以是酸性氨基酸残基全部连续的序列，也可为1个或多个的中性氨基酸残基及/或碱性氨基酸残基介于酸性氨基酸残基之间。就肽标签的等电点(pI)而言，为了与混杂蛋白质的分离变得更良好、可进一步抑制对由目标蛋白质的等电点及缓冲液的pH等的导致分离的影响，优选5以下，更优选4以下。等电点是水溶液中的正和负的离子浓度变得相等之时的pH的值，例如，可由等电点电泳等测定。作为肽标签的优选的具体例，可举出下述肽标签1～8(D；天冬氨酸残基、E；谷氨酸残基)。
<肽标签>
肽标签1 EEEEEEDDDDDD(DE12，SEQ ID NO：1)
肽标签2 EEEEEEEEEDDDDDDDDD(DE18，SEQ ID NO：2)
肽标签3 EEEEEEEEEEEEDDDDDDDDDDDD(DE24，SEQ ID NO：3)
肽标签4 EEEEEEEEEEEEEEEDDDDDDDDDDDDDDD(DE30，SEQ ID NO：4)
肽标签5 EEEEEEEEEEEEEEEEEEDDDDDDDDDDDDDDDDDD(DE36，SEQ ID NO：5)
肽标签6 NVEGKTGNATDEEEEEEEEEEEEDDDDDDDDDDDDEDSGAEIQDDDEEGFDDEEEFDDDDDDEHDDDDLENEENELEELEERVEARKK(DED，SEQ ID NO：6)
肽标签7 DLSNVEGKTGNATDEEEEEEEEEEEEDDDDDDDDDDDDEDSGAE(DES，SEQ ID NO：7)
肽标签8 EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE(EO24，SEQ ID NO：8)
目标蛋白质不特别限定，例如，可举出酶、受体、干扰素类、白细胞介素类、抗体、荧光蛋白质等的蛋白质。目标蛋白质的等电点不特别限定。一般而言，蛋白质的等电点是6～7，但当将任何蛋白质作为目标时，也通过使肽标签融合，可使等电点降低至可与混杂蛋白质充分地分离的程度。
在融合蛋白质中，肽标签也可与目标蛋白质的N末端侧或C末端侧的任一侧结合。另外肽标签虽然可与目标蛋白质邻接而结合，但也可向目标蛋白质之间插入其他氨基酸序列。例如，如果在融合蛋白质和肽标签的氨基酸序列之间插入蛋白质分解酶识别的切断位点的氨基酸序列，则从融合蛋白质切断肽标签而取得目标蛋白质变得更容易。融合蛋白质的等电点不特别限定，但优选不足6，更优选不足5。多数蛋白质由于等电点一般是6～7，如果融合蛋白质的等电点不足6，融合蛋白质和混杂蛋白质的分离就变得更容易，可使融合蛋白质的纯度提高。
含融合蛋白质和混杂蛋白质的试样可通过向宿主细胞导入含编码肽标签的碱基序列和编码目标蛋白质的碱基序列的多核苷酸，使融合蛋白质在宿主细胞表达来取得。融合蛋白质的表达可根据公知的基因工程学方法进行。编码肽标签的多核苷酸及编码目标蛋白质的多核苷酸可由化学合成等公知的方法取得，可以其作为模板根据公知的基因扩增方法扩增。通过将扩增的多核苷酸和表达载体由限制性内切酶处理，使用适当的DNA连接酶使其结合，可构建含各自编码肽标签和目标蛋白质的多核苷酸的表达重组的载体。对于表达载体的构建，编码肽标签的碱基序列也可配置于编码目标蛋白质的碱基序列的5’侧或3’侧的任一侧。编码肽标签的碱基序列和编码目标蛋白质的碱基序列虽然可邻接配置，但也可编码蛋白质分解酶识别的切断位点的碱基序列等插入于其间。作为宿主，不特别限定，可使用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、虫体、动物细胞、植物细胞等。作为表达载体，无特别限制，可举出质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，可根据使用的宿主适宜选择。在表达载体中，也可含复制起点、启动子序列、增强子序列等的调节序列、选择标志物等的序列。向宿主导入表达载体可根据宿主根据公知的方法进行，例如，可举出磷酸钙法、电穿孔法、脂转染法等。这样，可得到向宿主细胞导入表达载体的转化体。使得到的转化体在适宜的条件下温育，可使融合蛋白质产生。
使融合蛋白质表达之后，对宿主的细胞、组织、虫体等，根据需要，进行提取、破碎、离心分离、增溶、体液采集等的处理，作为细胞培养液、提取液、匀浆物、溶解液、体液等取得试样。在试样中，除了产生的融合蛋白质之外，含宿主来源的内源性蛋白质等的混杂蛋白质。在试样的调制中，可使用磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液等的缓冲液。在这些缓冲液中，含为了得到缓冲作用而使用的与弱酸或弱碱的盐，但除此之外，可使用氯化钠、氯化钾、氯化钙等的盐。在本说明书中，缓冲液或试样的盐浓度是指以这样的缓冲作用作为目的的盐以外的盐的浓度。试样的盐浓度，从融合蛋白质的稳定性及在分离工序中的调整的容易性等的观点来看，优选50mM以上500mM以下，更优选50mM以上250mM以下。另外试样的pH，从融合蛋白质的稳定性及在分离工序中的调整的容易性等的观点来看，优选5以上9以下，更优选6以上8以下。
使用大肠杆菌表达系统取得试样时，作为表达载体，可使用质粒载体。作为质粒载体，具体而言，可举出pET、pGEX、pCold、pMAL、pCAL等。在表达载体中，也可含复制起点、lac、T7、tac等的启动子序列、增强子序列、氨苄西林抗性基因、卡那霉素抗性基因等的选择标志物的序列。向大肠杆菌导入表达载体可由磷酸钙法、电穿孔法、脂转染法等进行。表达载体导入后，通过用含选择标志物的培养基培养，可选择向大肠杆菌导入表达载体的转化体。使这样得到的转化体在适宜的条件下增殖之后，根据选择的启动子进行表达诱导，使融合蛋白质产生。使融合蛋白质表达之后，可对大肠杆菌进行破碎等而取得含融合蛋白质及大肠杆菌来源的混杂蛋白质的试样。
作为表达系统，使用蚕等的虫体或昆虫细胞时，可使用转移载体。在将转移载体与杆状病毒DNA一同转导到昆虫细胞中之后，可由同源重组向杆状病毒DNA插入目的基因。作为转移载体，例如，可举出pM01、pM02、pHS01、pHS02等。转移载体优选含多角体蛋白启动子、p10启动子等的启动子。作为昆虫细胞，例如可举出Sf9、Sf21、High5、TN-368、Bm5等。作为杆状病毒，可举出例如核多角体病病毒(NPV)，具体而言，可例示AcMNPV、BmNPV等。通过向昆虫细胞导入转移载体和线性化的杆状病毒DNA，发生同源重组，得到插入了目的基因的重组杆状病毒。通过向虫体或昆虫细胞接种含重组杆状病毒的病毒溶液等，可使重组杆状病毒感染。蚕等的虫体可为成虫、蛹及幼虫的任何的形态。通过使重组杆状病毒感染于虫体或昆虫细胞，饲育或培养1～7天，可使融合蛋白质表达。使融合蛋白质表达之后，对虫体或昆虫细胞进行破碎等，可取得含融合蛋白质和虫体或昆虫细胞来源的混杂蛋白质的试样。
(融合蛋白质)
在本实施方式中的融合蛋白质可由如上述的试样调制工序，包括向宿主细胞导入含编码肽标签的氨基酸序列的碱基序列和编码融合蛋白质的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸的工序及在宿主细胞中表达融合蛋白质的工序的生产方法得到。融合蛋白质含有含12个残基以上的酸性氨基酸残基的肽标签的氨基酸序列和目标蛋白质的氨基酸序列。作为本实施方式的融合蛋白质，例如，可举出将作为目标蛋白质的NAD(P)H脱氢酶,醌1人(NQ01，pI＝8.91，SEQ ID NO：9)或萤光素酶(pI＝6.71，SEQ ID NO：10)和上述肽标签1～8融合，其间插入蛋白质分解酶HRV3C识别的切断位点的下述构建体1～12。另外，也可例示将作为目标蛋白质的HRV3C(pI＝8.46，SEQ ID NO：11)和上述肽标签7融合的下述构建体13。
构建体1 DE12-HRV3Csite-NQ01(SEQ ID NO：12)
构建体2 DE18-HRV3Csite-NQ01(SEQ ID NO：13)
构建体3 DE24-HRV3Csite-NQ01(SEQ ID NO：14)
构建体4 DE30-HRV3Csite-NQ01(SEQ ID NO：15)
构建体5 DE36-HRV3Csite-NQ01(SEQ ID NO：16)
构建体6 DED-HRV3Csite-NQ01(SEQ ID NO：17)
构建体7 DES-HRV3Csite-NQ01(SEQ ID NO：18)
构建体8 EO24-HRV3Csite-NQ01(SEQ ID NO：19)
构建体9 NQ01-HRV3Csite-DED(SEQ ID NO：20)
构建体10 NQ01-HRV3Csite-DES(SEQ ID NO：21)
构建体11 DED-HRV3Csite-萤光素酶(SEQ ID NO：22)
构建体12 DES-HRV3Csite-萤光素酶(SEQ ID NO：23)
构建体13 DED-HRV3C(SEQ ID NO：24)
(分离工序)
对于含在试样调制工序中得到的融合蛋白质和混杂蛋白质的试样，分离融合蛋白质和混杂蛋白质。“分离融合蛋白质和混杂蛋白质”包括将融合蛋白质提取－纯化，收容到与混杂蛋白质不同的容器中。混杂蛋白质可基本上被完全地分离，也可将混杂蛋白质的一部分分离。通过分离混杂蛋白质的一部分或全部，可使融合蛋白质的纯度提高。
作为分离手段，不特别限定，可使用公知的分离手段，但为了得到与混杂蛋白质的良好的分离，优选由离子交换树脂分离，更优选由阴离子交换树脂分离。作为阴离子交换树脂的离子交换基，不特别限定，可使用季铵(QA)、季氨基乙基(QAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)等，具体而言可举出Hitrap HP Q(GE Healthcare公司)、TOYOPEARL GigaCap Q-650M、TOYOPEARL Q-600C AR、TOYOPEARL QAE-550、TOYOPEARL DEAE-650M、TOYOPEARL SuperQ-650M(以上、Tosoh公司)、Q101、DE101(以上、三菱化学公司)等。作为离子交换基的载体，可使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖、亲水性乙烯基聚合物等。使在试样调制工序中得到的含融合蛋白质和混杂蛋白质的试样通过这样的阴离子交换树脂，而使融合蛋白质与阴离子交换树脂结合。其后，例如，使溶出液的盐浓度升高，而使混杂蛋白质溶出之后，通过用高盐浓度的溶出液将融合蛋白质从离子交换树脂溶出，可取得纯化的融合蛋白质。作为使溶出液的盐浓度升高的方法，可举出阶段性地改变盐浓度而使目的蛋白质溶出的逐步法、连续地改变盐浓度而使目的蛋白质溶出的梯度法等。作为在溶出中使用的缓冲液，可使用磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液等的缓冲液。缓冲液的盐浓度，从与混杂蛋白质分离及融合蛋白质的稳定性等的观点来看，优选设为50mM以上、2000mM以下的范围，更优选50mM以上、1000mM以下的范围。特别是，如果将缓冲液的盐浓度设为600mM以上、更优选为750mM以上，则与混杂蛋白质的分离变得更良好。另外，缓冲液的pH的范围虽不特别限制，但从与混杂蛋白质分离及融合蛋白质的稳定性等的观点来看，优选5以上9以下的范围，更优选6以上、8以下的范围。
图1是显示本发明的一实施方式的模式图，(a)是显示分离工序的图。基于此图，说明在本实施方式的纯化方法中的分离工序的原理。使融合蛋白质在宿主细胞表达时，在细胞破碎液等的试样中，除了融合蛋白质20之外，还含宿主来源的内源性蛋白质等的混杂蛋白质21A～21F。混杂蛋白质21的等电点从低到高依A到F的顺序。在本实施方式中，使含12个残基以上的的酸性氨基酸残基的肽标签20b结合于目标蛋白质20a而使融合蛋白质20的等电点降低。使等电点降低的融合蛋白质20在阴离子交换树脂10上能保持至高盐浓度。一方面，大部分宿主来源的混杂蛋白质无法在阴离子交换树脂10保持至同程度的盐浓度。基于这样的等电点的差异分离融合蛋白质和混杂蛋白质。具体而言，如果使试样接触阴离子交换树脂10，则等电点高的混杂蛋白质21A不与阴离子交换树脂结合而通过。此外的混杂蛋白质和融合蛋白质20与阴离子树脂20结合。如果使溶出液的盐浓度升高，则从等电点高的混杂蛋白质顺序溶出(21B～D)。融合蛋白质20再由高盐浓度的溶出液溶出。在此溶出级分中含与融合蛋白质20等电点相近的混杂蛋白质21E及21F。通过这样调整溶出液的盐浓度，因为可分离多种混杂蛋白质，可得到高纯度的融合蛋白质。另外，由于融合蛋白质和混杂蛋白质之间的等电点的差异相对大，由阶段性地改变盐浓度而使蛋白质溶出的逐步法也得到良好的分离。
(目标蛋白质取得工序)
如上所述，可分离试样中所含的融合蛋白质和混杂蛋白质，但如果融合蛋白质还含蛋白质分解酶识别的切断位点，则通过使蛋白质分解酶作用于分离的融合蛋白质，可从融合蛋白质切断肽标签，仅取得目标蛋白质。本实施方式的纯化方法在分离工序之后，也可包括这样使用蛋白质分解酶，在溶液中从融合蛋白质切断肽标签，取得目标蛋白质的工序。
作为蛋白质分解酶的种类，不特别限定，但例如，可举出HRV3C、PreScission蛋白酶、因子Xa、凝血酶、TEV蛋白酶等。通过将这样的蛋白质分解酶添加到例如在分离工序中得到的含目标蛋白质的溶出液中，可从融合蛋白质切断肽标签。反应温度及反应时间可根据蛋白质分解酶的种类等适宜设定。在反应后的溶液中含目标蛋白质、肽标签及蛋白质分解酶。从此溶液，可使用公知的分离手段分离目标蛋白质。作为分离手段，不特别限定，可使用各种层析等公知的分离手段。就是在其中，从融合蛋白质切断肽标签，则由于在目标蛋白质和肽标签上发生等电点的差异，优选利用此等电点的差异由离子交换树脂分离，再优选由阴离子交换树脂分离。如果使含由蛋白质分解酶反应后的目标蛋白质、肽标签及蛋白质分解酶的溶液与阴离子交换树脂接触，则被切断的肽标签与离子交换树脂结合，但目标蛋白质不与离子交换树脂结合而通过。从而，可通过采集此通过级分而取得目标蛋白质。含目标蛋白质、肽标签及蛋白质分解酶的溶液的盐浓度为了与肽标签的分离变得更良好，优选500mM以下，更优选300mM以下。另外溶液的pH优选5以上、9以下，更优选6以上、8以下。作为在溶液的盐浓度及pH的调整中使用的缓冲液，可使用磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液等。另外，即使在分离工序中得到的含融合蛋白质的溶液级分中残留有混杂蛋白质，它们的等电点与融合蛋白质比较接近。因此，通过从融合蛋白质切断肽标签，与残留的混杂蛋白质的等电点的差也变大。从而，如果使用离子交换树脂，则与混杂蛋白质的分离也变得良好，可得到更高纯度的目标蛋白质。另外蛋白质分解酶可由公知的分离手段分离，但只要目标蛋白质和蛋白质分解酶的等电点有差异，可由离子交换树脂容易地分离两者。
蛋白质分解酶的等电点优选与目标蛋白质的等电点不同。由此，在用蛋白质分解酶切断肽标签之后，可容易地分离目标蛋白质和蛋白质分解酶。蛋白质分解酶也可融合肽标签。由此，可将蛋白质分解酶的等电点调整到期望的值。作为与蛋白质分解酶融合的肽标签，可使用和与上述的融合蛋白质结合的肽标签相同的肽标签。结合于蛋白质分解酶的肽标签的氨基酸序列和结合于融合蛋白质的肽标签的氨基酸序列可相同，也可不同。适宜地是与融合蛋白质中所含的肽标签相同的氨基酸序列。由此，蛋白质分解酶与融合蛋白质达到同程度的等电点，并且达到与目标蛋白质不同的等电点。融合肽标签的蛋白质分解酶，为了回避由自身分解，优选无此蛋白质分解酶识别的切断位点。使用融合肽标签的蛋白质分解酶时，在反应后的溶液中，含目标蛋白质、被切断的肽标签及融合肽标签的蛋白质分解酶。通过使此溶液通过阴离子交换树脂，融合肽标签的蛋白质分解酶与被切断的肽标签一同与阴离子交换树脂结合，从而无需另行分离蛋白质分解酶的工序。
融合肽标签的蛋白质分解酶，在上述融合蛋白质的表达中，通过以蛋白质分解酶作为目标蛋白质，可得到融合肽标签的蛋白质分解酶。融合蛋白质和蛋白质分解酶可向宿主导入插入含编码两方的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸的载体而使表达。另外，也可向宿主导入导入编码融合蛋白质的多核苷酸的载体和插入编码蛋白质分解酶的多核苷酸的载体而使其表达。另外，也可向宿主导入插入编码融合蛋白质的多核苷酸的载体，向宿主导入插入编码蛋白质分解酶的多核苷酸的载体，各自单独表达之后，混合。此时，宿主可为同种，也可为异种，从表达后的处理容易性等来看，优选同种。融合肽标签的蛋白质分解酶的等电点不特别限定，但为了与目标蛋白质的分离变得更良好，优选不足6，更优选不足5。
基于图1(b)及(c)，说明在本实施方式的纯化方法中的目标蛋白质取得工序的原理。融合蛋白质20在目标蛋白质20a和肽标签20b之间含蛋白质分解酶22识别的切断位点20c。在融合了肽标签的蛋白质分解酶22中，在蛋白质分解酶20a上结合了肽标签22b。如果在溶液中使融合蛋白质20和蛋白质分解酶22反应，则从融合蛋白质20切断肽标签20b。在反应后的溶液中，含目标蛋白质20a、被切断的肽标签20b、融合肽标签的蛋白质分解酶22及在分离工序中残留的混杂蛋白质21E、21F。由于等电点低的肽标签20b被切断，目标蛋白质20a与融合蛋白质20相比等电点变高。另外混杂蛋白质21E及21F由于等电点与融合蛋白质20比较接近，从而目标蛋白质20a的等电点比这些高。再者，目标蛋白质20a的等电点也比融合了被切断的肽标签20b及肽标签22b的蛋白质分解酶22高。因此，如果稀释此溶液而使盐浓度降低，使通过阴离子交换树脂10，则被切断的肽标签20b、蛋白质分解酶22及混杂蛋白质21E、21F与阴离子交换树脂10结合，但目标蛋白质20a不结合而通过。通过采集此通过级分，可取得高纯度的目标蛋白质20a。
【实施例】
以下，对于本发明还举实施例详细地进行说明，但本发明不以任何方式限于这些实施例。
【实施例1[融合蛋白质DE12-HRV3Csite-NQ01(构建体1；pI＝5.84)的表达及纯化]】
对肽标签1(DE12)融合于作为目标蛋白的NAD(P)H脱氢酶,醌1人(NQ01，pI＝8.91)的N末端侧，在NQ01和DE12之间含蛋白质分解酶HRV3C识别的切断位点HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
(1)pM01_DE12载体的构建
构建向pM01载体插入肽标签DE12的载体pM01_DE12。
使编码DE12的多核苷酸(SEQ ID NO：25及26)退火成对，调制插入子部分。将pM01载体(Sysmex公司)的NheI位点用NheI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clone tech公司)插入插入子部分。用构建的载体转化Stellar感受态细胞之后，播种到LBA板上，于37℃下培养16hr。从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用引物1(SEQ ID NO：27)及引物2(SEQ ID NO：28)，用Big Dye Terminator v3.1(Thermo Scientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(Thermo Scientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pM01_DE12。
(2)pM01_DE12_HRV3Csite_NQ01的构建
构建向pM01_DE12插入编码NQ01(SEQ ID NO：9)的多核苷酸(SEQ ID NO：29)的表达载体pM01_DE12_HRV3Csite_NQ01。
插入子部分准备编码NQ01的多核苷酸和对应于插入子部分的引物3F(SEQ ID NO：30)及3R(SEQ ID NO：31)，作为PCR酶，使用KOD-Plus-(东洋纺公司)，用下述PCR条件扩增。将扩增的PCR产物用1.0％(w/v)琼脂糖电泳进行电泳，将与插入子部分的长度一致的部分从凝胶切出而纯化而调制插入子部分。将pM01_DE12载体的SmaI位点用SmaI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clone tech公司)插入插入子部分。用构建的载体转化Stellar感受态细胞(Clone tech公司)之后，播种到LBA板上。于37℃下培养16hr，从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用的引物1及2，用Big Dye Terminator v3.1(Thermo Scientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(Thermo Scientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pM01_DE12_HRV3Csite_NQ01。
<PCR条件>
反应1：94.0℃、2分钟；反应2：94.0℃、15秒钟；反应3：52.0℃、30秒钟；反应4：68.0℃、每1kbp1分钟；反应5：将反应2～反应4重复30次
(3)重组杆状病毒的制作及融合蛋白质DE12-HRV3Csite-NQ01的表达
向蚕培养细胞(BmN细胞)导入pM01_DE12_HRV3Csite_NQ01和杆状病毒DNA，进行病毒的同源重组。将此培养细胞培养6天，回收重组病毒后，向蚕的蛹接种用MilliQ水稀释50倍的病毒溶液，温育6天。
(4)DE12-HRV3Csite-NQ01的纯化
温育后，回收蚕的蛹，每1只加50mL的缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0),150mMNaCl,1片完全无EDTA(1tablet Complete EDTA free)(Roche),phenyltiourea)匀浆，对溶液进行离心(8,000g、10分钟)后，将上清级分用0.8μM的滤剂过滤，回收滤液。将回收的滤液加载到离子交换树脂(Hitrap Q HP(1mL))，使用混合20mM Tris-HCl(pH 8.0,150mM NaCl，缓冲液A)和20mM Tris-HCl(pH 8.0,1000mM NaCl，缓冲液B)的溶液纯化。各回收首先仅使缓冲液A(NaCl浓度150mM)流过离子交换树脂(EL0)、用缓冲液A：缓冲液B的3:1混合溶液(NaCl浓度363mM)溶出(EL1)、用缓冲液A：缓冲液B的1:1混合溶液(NaCl浓度575mM)溶出(EL2)、用缓冲液A：缓冲液B的1:3混合溶液(NaCl浓度788mM)溶出(EL3)，最后仅用缓冲液B(NaCl浓度1000mM)溶出(EL4)的级分。
(5)DE12-HRV3Csite-NQ01的检测
SDS(十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使用5-20％梯度凝胶及电泳装置(APRO Science公司)实施。样品和TrisSDSβ-ME样品处理液(COSMO-BIO公司)以1:1容量比混合，100℃下、处理3分钟之后，将5μL加载到凝胶。作为分子量标志物，将BlueStar(日本Genetics公司)加载到2.5μL凝胶。将加载样品的凝胶以电压400V电泳14分钟之后，使用转印Turbo印迹系统(BIO-RAD公司)转印到膜上。将转印的膜设置于i-Bind系统(ThermoFisher Scientific公司)，实施抗原抗体反应。在抗原抗体反应中，抗-FLAG(注册商标)M2-过氧化物酶(HRP)抗体(Merck公司)或抗-NQ01抗体(Cell signaling公司)和抗-IgG(H+Lchain)(Mouse)pAb-HRP(Beckman公司)稀释2000倍使用，检测的HRP试剂使用LuminataForte(Merck公司)、检测机使用Gel Doc XR+系统(BIO-RAD公司)。
实施蛋白印迹之后，将使用的膜用GelCode Blue Stain Reagent(Thermo FisherScientific公司)染色，使额外的染色脱色之后，使用Gel Doc XR+系统(BIO-RAD公司)对图像进行摄影。结果示于图2。在图2中，M是分子量标志物、泳道1是匀浆物溶液、泳道2是离心后的上清级分、泳道3是离心后的沉淀级分、泳道4～泳道7是离子交换树脂的通过级分1～4、泳道8是由缓冲液A(NaCl浓度150mM)的溶出级分(EL0)、泳道9是由缓冲液A：缓冲液B的3:1混合溶液(NaCl浓度363mM)的溶出级分(EL1)、泳道10是由缓冲液A：缓冲液B的1:1混合溶液(NaCl浓度575mM)的溶出级分(EL2)、泳道11是，由缓冲液A：缓冲液B的1:3混合溶液(NaCl浓度788mM)的溶液级分(EL3)、泳道12是由缓冲液B(NaCl浓度1000mM)的溶出级分(EL4)的电泳结果。用虚线包围的部分表示含目标蛋白质的条带。各泳道的说明是在图3～15中通用。
【实施例2[融合蛋白质DE18-HRV3Csite-NQ01(构建体2；pI＝5.03)的表达及纯化]】
对肽标签2(DE18)融合于作为目标蛋白的NQ01的N末端侧，在NQ01和DE18之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
除了代替编码肽标签DE12的多核苷酸而使用编码DE18(SEQ IDNO：2)的多核苷酸(SEQ ID NO：32及33)调制插入子部分之外，与实施例1同样地构建pM01_DE18载体。
再与实施例1同样地，构建pM01_DE18_HRV3Csite_NQ01，制作重组杆状病毒之后，进行融合蛋白质DE18-HRV3Csite-NQ01的表达、纯化及检测。结果示于图3。
【实施例3[融合蛋白质DE24-HRV3Csite-NQ01(构建体3；pI＝4.78)的表达及纯化]】
对肽标签3(DE24)融合于作为目标蛋白的NQ01的N末端侧，在NQ01和DE24之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
(1)pM01_DE24载体的构建
向pM01载体插入编码肽标签DE24的多核苷酸的载体pM01_DE24如以下一样构建。
准备编码肽标签6(DED，SEQ ID NO：6)的多核苷酸(SEQ ID NO：34)和对应于插入子部分的引物4F(SEQ ID NO：35)及4R(SEQ ID NO：36)，作为PCR酶，使用KOD-Plus-(东洋纺公司)，用与实施例1相同的PCR条件扩增。将扩增的PCR产物用1.0％(w/v)琼脂糖电泳进行电泳，将与插入子部分的长度一致的部分从凝胶切出，纯化而调制插入子部分。将pM01载体(Sysmex公司)的SmaI位点用SmaI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clonetech公司)插入插入子部分。用构建的载体转化Stellar感受态细胞(Clone tech公司)之后，播种到LBA板上。于37℃下培养16hr，从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用的引物1及2，用BigDye Terminator v3.1(Thermo Scientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(ThermoScientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pM01_DE24。
(2)与实施例1同样地，构建pM01_DE24_HRV3Csite_NQ01，制作重组杆状病毒之后，进行融合蛋白质DE24-HRV3Csite-NQ01的表达、纯化及检测。结果示于图4。
【实施例4[融合蛋白质DE30-HRV3Csite-NQ01(构建体4；pI＝4.61)的表达及纯化]】
对肽标签4(DE30)融合于作为目标蛋白的NQ01的N末端侧，在NQ01和DE30之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
除了代替编码肽标签DE12的多核苷酸而使用编码DE30(SEQ ID NO：4)的多核苷酸(SEQ ID NO：37及38)调制插入子部分之外，与实施例1同样地构建pM01_DE30载体。
再与实施例1同样地，构建pM01_DE30_HRV3Csite_NQ01，制作重组杆状病毒之后，进行融合蛋白质DE30-HRV3Csite-NQ01的表达、纯化及检测。结果示于图5。
【实施例5[融合蛋白质DE36-HRV3Csite-NQ01(构建体5；pI＝4.49)的表达及纯化]】
对肽标签5(DE36)融合于作为目标蛋白的NQ01的N末端侧，在NQ01和DE36之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
除了代替编码肽标签DE12的多核苷酸而使用编码DE36(SEQ ID NO：5)的多核苷酸(SEQ ID NO：39及40)调制插入子部分之外，与实施例1同样地构建pM01_DE36载体。
再与实施例1同样地，构建pM01_DE36_HRV3Csite_NQ01，制作重组杆状病毒之后，进行融合蛋白质DE36-HRV3Csite-NQ01的表达、纯化及检测。结果示于图6。
【实施例6[融合蛋白质DED-HRV3Csite-NQ01(构建体6；pI＝4.26)的表达及纯化]】
对肽标签6(DED)融合于作为目标蛋白的NQ01的N末端侧，在NQ01和DED之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
(1)pHS01_DED载体的构建
向pHS01载体插入肽标签DED(SEQ ID NO：6)的载体pHS01_DED如以下一样构建。
准备编码肽标签DED的多核苷酸(SEQ ID NO：34)和对应于插入子部分的引物5F(SEQ ID NO：41)及5R(SEQ ID NO：42)，作为PCR酶，使用KOD-Plus-(东洋纺公司)，用与实施例1相同的PCR条件扩增。将扩增的PCR产物用1.0％(w/v)琼脂糖电泳进行电泳，将与插入子部分的长度一致的部分从凝胶切出，纯化而调制插入子部分。将pHS01载体(Sysmex公司)的NheI位点用NheI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clone tech公司)插入插入子部分。用构建的载体转化Stellar感受态细胞之后，播种到LBA板上。于37℃下培养16hr，从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用的引物1及2，用Big Dye Terminator v3.1(ThermoScientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(Thermo Scientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pHS01_DED。
(2)与实施例1同样地构建HS01_DED_HRV3Csite_NQ01，制作重组杆状病毒之后，进行融合蛋白质DED-HRV3Csite-NQ01的表达、纯化及检测。结果示于图7。
【实施例7[融合蛋白质DES-HRV3Csite-NQ01(构建体7；pI＝4.55)的表达及纯化]】
对肽标签7(DES)融合于作为目标蛋白的NQ01的N末端侧，NQ01和DES之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
除了作为对应于插入子部分的引物，使用引物6F(SEQ ID NO：43)及6R(SEQ IDNO：44)之外，与实施例6同样地，构建pHS01_DES。
与实施例1同样地构建pHS01_DES_HRV3Csite_NQ01，制作重组杆状病毒之后，进行融合蛋白质DES-HRV3Csite-NQ01的表达、纯化及检测。结果示于图8。
【实施例8[融合蛋白质EO24-HRV3Csite-NQ01(构建体8；pI＝4.73)的表达及纯化]】
对肽标签8(EO24)融合于作为目标蛋白的NQ01的N末端侧，NQ01和EO24之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
(1)pHS01_EO24的构建
使编码肽标签EO24的多核苷酸(SEQ ID NO：45及46)退火成对，调制插入子部分。将pHS01载体(Sysmex公司)的NheI位点用NheI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clone tech公司)插入到插入子部分。用构建的载体转化Stellar感受态细胞(Clone tech公司)之后，播种到LBA板上。于37℃下培养16hr，从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用的引物1及2，用Big Dye Terminator v3.1(Thermo Scientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(Thermo Scientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pHS01_EO24。
(2)与实施例1同样地构建pHS01_EO24_HRV3Csite_NQ01，制作重组杆状病毒之后，进行融合蛋白质EO24-HRV3Csite-NQ01的表达、纯化及检测。结果示于图9。
【实施例9[融合蛋白质NQ01-HRV3Csite-DED(构建体9；pI＝4.26)的表达及纯化]】
对肽标签DED融合于作为目标蛋白的NQ01的C末端侧，NQ01和DED之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
(1)pHS02_DED载体的构建
向pHS02载体插入编码肽标签DED的多肽的载体pHS02_DE12如以下一样构建。
准备编码肽标签DED的多核苷酸(SEQ ID NO：34)和对应于插入子部分的引物7F(SEQ ID NO：47)及7R(SEQ ID NO：48)，作为PCR酶，使用KOD-Plus-(东洋纺公司)，用与实施例1相同的PCR条件扩增。将扩增的PCR产物用1.0％(w/v)琼脂糖电泳进行电泳，将与插入子部分的长度一致的部分从凝胶切出，纯化而调制插入子部分。将pHS02载体(Sysmex公司)的NheI位点用NheI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clone tech公司)插入插入子部分。用构建的载体转化Stellar感受态细胞(Clone tech公司)之后，播种到LBA板上。于37℃下培养16hr，从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用的引物1及2，用Big DyeTerminatorv3.1(Thermo Scientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(Thermo Scientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pHS02_DED。
(2)除了作为对应于插入子部分的引物，使用引物8F(SEQ ID NO：49)及8R(SEQ IDNO：50)之外，与实施例1同样地构建pHS02_NQ01_HRV3Csite_DED。
(3)还与实施例1同样地制作重组杆状病毒，进行融合蛋白质NQ01-HRV3Csite-DED的表达、纯化及检测。结果示于图10。
【实施例10[融合蛋白质NQ01-HRV3Csite-DES(构建体10；pI＝4.55)的表达及纯化]】
对肽标签DES融合于作为目标蛋白的NQ01的C末端侧，NQ01和DES之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
(1)除了作为引物，使用9F(SEQ ID NO：51)及9R(SEQ ID NO：52)之外，与实施例9同样地，构建pHS02_DES。
(2)与实施例9同样地构建pHS01_NQ01_HRV3Csite_DES。
(3)与实施例1同样地制作重组杆状病毒，进行融合蛋白质NQ01-HRV3Csite-DES的表达、纯化及检测。结果示于图11。
【实施例11[融合蛋白质DED-HRV3Csite-Luciferase(构建体11；pI＝4.47)的表达及纯化]】
(1)pHS01_DED载体的构建
与实施例6同样地构建pHS01_DED。
(2)pHS01_DED_HRV3Csite_萤光素酶的构建
准备编码萤光素酶的多核苷酸(SEQ ID NO：53)和对应于插入子部分的引物10F(SEQ ID NO：54)及10R(SEQ ID NO：55)，作为PCR酶，使用KOD-Plus-(东洋纺公司)，用与实施例1相同的PCR条件扩增。将扩增的PCR产物用1.0％(w/v)琼脂糖电泳进行电泳，将与插入子部分的长度一致的部分从凝胶切出，纯化而调制插入子部分。将pHS01_DED载体的SmaI位点用SmaI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clone tech公司)插入插入子部分。用构建的载体转化Stellar感受态细胞(Clone tech公司)之后，播种到LBA板上。于37℃下培养16hr，从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用的引物1及2，用Big Dye Terminator v3.1(Thermo Scientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(Thermo Scientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pHS01_DED_HRV3Csite_萤光素酶。(3)与实施例1同样地制作重组杆状病毒，进行融合蛋白质DED-HRV3Csite-萤光素酶的表达、纯化及检测。结果示于图12。
【实施例12[融合蛋白质DES-HRV3Csite-萤光素酶(构建体12；pI＝4.75)的表达及纯化]】
除了代替pHS01_DED载体而使用在实施例7中构建的pHS01_DES载体之外，与实施例11同样地构建pHS02_DES_HRV3Csite_萤光素酶。
与实施例1同样地，制作重组杆状病毒，进行融合蛋白质DES-HRV3Csite-萤光素酶的表达、纯化及检测。结果示于图13。
【实施例13[融合蛋白质DED-HRV3C(构建体13；pI＝4.75)的表达及纯化]】
(1)pET17b_DED_HRV3C的构建
准备编码肽标签DED的多核苷酸(SEQ ID NO：34)、编码HRV3C的多核苷酸(SEQ IDNO：56)和对应于插入子部分的引物11F及11R(SEQ ID NO：57及58，DED)以及引物12F及12R(SEQ ID NO：59及60，HRV3C)，作为PCR酶，使用KOD-Plus-(东洋纺公司)，用与实施例1相同的PCR条件扩增。将扩增的PCR产物用1.0％(w/v)琼脂糖电泳进行电泳，将与插入子部分的长度一致的部分从凝胶切出，纯化而调制插入子部分。将pHS01载体(Sysmex公司)的SmaI位点和NheI位点用SmaI(宝生物公司)和NheI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clone tech公司)插入2个插入子部分。用构建的载体转化Stellar感受态细胞(Clonetech公司)之后，播种到LBA板上。于37℃下培养16hr，从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用的引物1及2，用Big Dye Terminator v3.1(Thermo Scientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(Thermo Scientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pHS01_DED_HRV3C。
接下来，调制pET17b用的插入子。将pHS01_DED_HRV3C作为模板，准备引物13F(SEQID NO：61)及13R(SEQ ID NO：62)，作为PCR酶，使用KOD-Plus-(东洋纺公司)，用与实施例1相同的PCR条件扩增。将扩增的PCR产物用1.0％(w/v)琼脂糖电泳进行电泳，将与插入子部分的长度一致的部分从凝胶切出，纯化而调制插入子部分。将pET17b载体(Novagene公司)的NdeI位点用NdeI(宝生物公司)处理，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clone tech公司)。用构建的载体转化Stellar感受态细胞(Clone tech公司)之后，播种到LBA板上。于37℃下培养16hr，从此转化体根据常规方法挑选氨苄西林抗性转化体，进行质粒的纯化。为了确认挑选的克隆的碱基序列，使用测序确认用的引物14(SEQ ID NO：63)及15(SEQ ID NO：64)，用Big Dye Terminator v3.1(Thermo Scientific公司)进行PCR反应之后，用DNA测序仪(Thermo Scientific公司)解析。将导入有插入子部分、此外的部分无变异的载体作为pET17b_DED_HRV3C。
(2)DED-HRV3C的表达及纯化
使用pET17b_DED_HRV3C转化大肠杆菌，将含氨苄西林的1.5L的LB培养基于37℃培养，在浊度OD＝0.6附近冷却到15℃后，添加IPTG诱导蛋白质的表达。16小时后，用离心(8,000g 15分钟)集菌，于-80℃下冷冻。向冷冻的大肠杆菌添加120mL缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl,1片完全无EDTA(1tablet Complete EDTA free)(Roche)，用超声波破碎。破碎的对溶液进行离心(15,000g×30分钟)后，将上清级分用0.8μM的滤剂过滤，回收滤液。将滤液加载到离子交换树脂(Hitrap Q HP(1mL))，使用混合20mM Tris-HCl(pH 8.0,150mM NaCl，缓冲液A)和20mM Tris-HCl(pH 8.0,1000mM NaCl，缓冲液B)的溶液纯化。各回收首先仅使缓冲液A(NaCl浓度150mM)流过离子交换树脂(EL0)、用缓冲液A：缓冲液B的3:1混合溶液(NaCl浓度363mM)溶出(EL1)、用缓冲液A：缓冲液B的1:1混合溶液(NaCl浓度575mM)溶出(EL2)、用缓冲液A：缓冲液B的1:3混合溶液(NaCl浓度788mM)溶出(EL3)，最后仅用缓冲液B(NaCl浓度1000mM)溶出(EL4)的级分。
(3)与实施例1同样地检测融合蛋白质。结果示于图14。在图14中，M是分子量标志物、泳道1是匀浆物溶液、泳道2是离心后的上清级分、泳道3是离心后的沉淀级分、泳道4～泳道7是离子交换树脂的通过级分1～4，泳道8是由缓冲液A(NaCl浓度150mM)的溶出级分(EL0)、泳道9是由缓冲液A：缓冲液B的3:1混合溶液(NaCl浓度363mM)的溶出级分(EL1)、泳道10是由缓冲液A：缓冲液B的1:1混合溶液(NaCl浓度575mM)的溶出级分(EL2)、泳道11是由缓冲液A：缓冲液B的1:3混合溶液(NaCl浓度788mM)的溶液级分(EL3)、泳道12是由缓冲液B(NaCl浓度1000mM)的溶出级分(EL4)的电泳结果。
【比较例1[融合蛋白质DE6-HRV3Csite-NQ01(pI＝6.4)的表达及纯化]】
对肽标签DE6融合于作为目标蛋白的NQ01的N末端侧，NQ01和DE6之间含HRV3Csite的融合蛋白质进行表达及纯化。
除了代替编码肽标签DE12的多核苷酸而使用编码DE6(EEEDDD，SEQ ID NO：65)的多核苷酸(SEQ ID NO：66及67)调制插入子部分之外，与实施例1同样地构建pM01_DE6载体。
再与实施例1同样地构建pM01_DE6_HRV3Csite_NQ01，制作重组杆状病毒之后，进行融合蛋白质DE6-HRV3Csite-NQ01的表达、纯化及检测。结果示于图15。
(对于实施例1～13及比较例1的结果)
在比较例1(DE6-HRV3Csite-NQ01、pI＝6.4)中，所有的级分中含融合蛋白质而分离不充分。与此相比，在实施例1～13中均示良好的分离。特别是结合18个残基以上的酸性氨基酸残基的肽标签的融合蛋白质保持于离子交换树脂至500mM以上的高盐浓度，与混杂蛋白质的分离变得更良好(实施例2～13)。另外，在3种目标蛋白质的任一种中均得到了良好的分离(实施例6～7、11～13)。另外，肽标签，作为酸性氨基酸残基，无论含天冬氨酸残基及谷氨酸残基这两方，还是仅含任一方均显示同等良好的分离(实施例3、8)。肽标签的结合位置无论是目标蛋白质的N末端侧或C末端侧的任一侧，均良好分离(实施例6～7、9～10)。
【实施例14[从融合蛋白质DE12-HRV3Csite-NQ01分离目标蛋白质NQ01及检测]】
使蛋白质分解酶DED-HRV3C反应于DE12-HRV3Csite-NQ01而从DE12-HRV3Csite-NQ01切断DE12。
向在实施例1中回收的级分EL2混合其10分之1容量的在实施例13中回收的级分EL3，于4℃下静置。16小时后，向此反应溶液添加20mM Tris-HCl(pH 8.0)而稀释至NaCl浓度约250mM，加载到用20mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl平衡化的离子交换树脂(HitrapQ HP(1mL))上。各回收回收通过级分(Fr.1-6(NaCl浓度约250mM))，最后仅用缓冲液B(NaCl浓度1000mM)溶出(Fr.7-10)的级分。
SDS-PAGE使用5-20％梯度凝胶及电泳装置(APRO Science公司)实施。将回收的各级分与TrisSDSβ-ME样品处理液(COSMO-BIO公司)以1:1容量比混合，100℃下、处理3分钟之后，将5μL加载到凝胶。作为分子量标志物，将BlueStar(日本Genetics公司)加载到2.5μL凝胶。将加载样品的凝胶以电压400V电泳14分钟之后，用GelCode Blue Stain Reagent(Thermo Fisher Scientific公司)染色，使额外的染色脱色之后，使用Gel Doc XR+系统(BIO-RAD公司)对图像进行摄影。结果示于图16。在图16中，M是分子量标志物、泳道1是EL2(实施例1、8)或EL3(实施例2～7、11～12)、泳道2是实施例13的EL3、泳道3是实施例1～12的EL2或EL3和实施例13的EL3的混合反应液、泳道4～泳道8是离子交换树脂的通过级分1～5，泳道9～13是由缓冲液B的溶出级分1～5的电泳结果。各泳道的说明在图17～25中通用。
【实施例15】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例2的EL2之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质NQ01。结果示于图17。
【实施例16】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例3的EL3之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质NQ01。结果示于图18。
【实施例17】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例4的EL3之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质NQ01。结果示于图19。
【实施例18】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例5的EL3之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质NQ01。结果示于图20。
【实施例19】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例6的EL3之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质NQ01。结果示于图21。
【实施例20】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例7的EL3之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质NQ01。结果示于图22。
【实施例21】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例8的EL2之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质NQ01。结果示于图23。
【实施例22】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例11的EL3之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质萤光素酶。结果示于图24。
【实施例23】
除了代替实施例1的EL2而使用实施例12的EL3之外，与实施例14同样地检测目标蛋白质萤光素酶。结果示于图25。
(对于实施例14～23的结果)
从实施例14～23的结果显示，通过使蛋白质分解酶作用于融合蛋白质，可在阴离子树脂的通过级分中取得目标蛋白质NQ01或萤光素酶。
【实施例24[缓冲液的pH对分离的影响的评价]】
与实施例6同样地构建，pHS01_DED_HRV3Csite_NQ01。
向蚕培养细胞(BmN细胞)导入pHS01_DED_HRV3Csite_NQ01和杆状病毒DNA，进行病毒的同源重组。将此培养细胞培养6天，回收重组病毒后，向蚕的蛹接种用MilliQ水稀释50倍的病毒溶液，温育6天。回收蚕的蛹，每1只加50mL的缓冲液(20mM PIPES(pH6.1),150mMNaCl,1片完全无EDTA(1tablet Complete EDTA free)(Roche),phenyltiourea)而匀浆，其对溶液进行离心(8,000g、10分钟)后，将上清级分用0.8μM的滤剂过滤，回收滤液。将滤液加载到离子交换树脂(Hitrap Q HP(1mL))，使用混合20mM PIPES(pH6.1,150mM NaCl，缓冲液C)和20mM PIPES(pH6.1,1000mM NaCl，缓冲液D)的溶液纯化。各回收首先仅使缓冲液C(NaCl浓度150mM)流过离子交换树脂(EL0)，用缓冲液C：缓冲液D的混合比3：1(NaCl浓度363mM)的溶液溶出(EL1)、用缓冲液C：缓冲液D的混合比1:1(NaCl浓度575mM)的溶液溶出(EL2)、用缓冲液C：缓冲液D的混合比1:3(NaCl浓度788mM)的溶液溶出(EL3)，最后仅用缓冲液D(NaCl浓度1000mM)溶出(EL4)的级分。
与实施例1同样地检测DED-HRV3Csite-NQ01。结果示于图26。在图26中，M是分子量标志物、泳道1是匀浆物溶液、泳道2是离心后的上清级分、泳道3是离心后的沉淀级分、泳道4～泳道7是离子交换树脂的通过级分1～4、泳道8是由缓冲液C(NaCl浓度150mM)的溶出级分(EL0)、泳道9是由缓冲液C：缓冲液D的3:1混合溶液(NaCl浓度363mM)的溶出级分(EL1)、泳道10是由缓冲液C：缓冲液D的1:1混合溶液(NaCl浓度575mM)的溶出级分(EL2)、泳道11是由缓冲液C：缓冲液D的1:3混合溶液(NaCl浓度788mM)的溶液级分(EL3)、泳道12是由缓冲液D(NaCl浓度1000mM)的溶出级分(EL4)的电泳结果。各泳道的说明在图27～28中通用。
【实施例25】
与实施例7同样地构建pHS01_DES_HRV3Csite_NQ01。
再与实施例24同样地表达、纯化及检测DES-HRV3Csite-NQ01。结果示于图27。
【实施例26】
与实施例11同样地构建pHS01_DED_HRV3Csite_萤光素酶。
再与实施例24同样地表达、纯化及检测DED-HRV3Csite-萤光素酶。结果示于图28。
【实施例27】
与实施例7同样地构建pHS01_DES_HRV3Csite_NQ01。
使用pHS01_DES_HRV3Csite_NQ01转化大肠杆菌，将含氨苄西林的1.5L的LB培养基于37℃培养，在浊度OD＝0.6附近冷却到15℃后，添加IPTG诱导蛋白质的表达。16小时后，用离心(8,000g 15分钟)集菌，于-80℃下冷冻。向冷冻的大肠杆菌添加120mL缓冲液(20mMPIPES(pH6.1),150mM NaCl,1片完全无EDTA(1tablet Complete EDTA free)(Roche))，用超声波破碎。破碎的对溶液进行离心(15,000g×30分钟)后，将上清级分用0.8μM的滤剂过滤，回收滤液。将滤液加载到离子交换树脂(Hitrap Q HP(1mL))，使用混合20mM PIPES(pH6.1,150mM NaCl，缓冲液C)和20mM PIPES(pH6.1,1000mM NaCl，缓冲液D)的溶液纯化。各回收首先仅使缓冲液C(NaCl浓度150mM)流过离子交换树脂(EL0)、用缓冲液C：缓冲液D的3:1混合溶液(NaCl浓度363mM)溶出(EL1)、用缓冲液C：缓冲液D的1:1混合溶液(NaCl浓度575mM)溶出(EL2)、用缓冲液C：缓冲液D的1:3混合溶液(NaCl浓度788mM)溶出(EL3)，最后仅用缓冲液D(NaCl浓度1000mM)溶出(EL4)的级分。
与实施例1同样地检测DED-HRV3Csite-NQ01。结果示于图29。在图29中，M是分子量标志物、泳道1是匀浆物溶液、泳道2是离心后的上清级分、泳道3是离心后的沉淀级分、泳道4～泳道7是离子交换树脂的通过级分1～4，泳道8是由缓冲液C(NaCl浓度150mM)的溶出级分(EL0)、泳道9是由缓冲液C：缓冲液D的3:1混合溶液(NaCl浓度363mM)的溶出级分(EL1)、泳道10是由缓冲液C：缓冲液D的1:1混合溶液(NaCl浓度575mM)的溶出级分(EL2)、泳道11是由缓冲液C：缓冲液D的1:3混合溶液(NaCl浓度788mM)的溶液级分(EL3)、泳道12是由缓冲液D(NaCl浓度1000mM，EL4)的溶出级分的电泳结果。
【实施例28】
向实施例24的EL3混合10分之1容量的实施例27的EL3，于4℃下静置。16小时后，向反应溶液添加20mM PIPES(pH6.1)而稀释至NaCl浓度约250mM，加载到用20mM PIPES(pH6.1,150mM NaCl)平衡化的离子交换树脂(Hitrap Q HP(1mL))上。对于将通过级分回收(Fr.1-6(NaCl浓度约250mM))、最后仅用缓冲液D(NaCl浓度1000mM)溶出(Fr.7-10)的级分分别进行回收。
与实施例1同样地检测目标蛋白质EQ01。结果示于图30。在图30中，M是分子量标志物、泳道1是实施例24的EL3、泳道2是实施例27的EL3、泳道3是实施例24的EL3和实施例27的EL3混合反应液、泳道4～泳道8是离子交换树脂的通过级分1～5，泳道9～13是由缓冲液D的溶出级分1～5的电泳结果。
(对于实施例24～28的结果)
从实施例24～28的结果显示，在融合蛋白质的表达－纯化及目标蛋白质的纯化中，即使使缓冲液的pH变低，也得到了良好的分离。
【符号的说明】
10：离子交换树脂
20：融合蛋白质
20a：目标蛋白质
20b：肽标签
20c：蛋白质分解酶的切断位点
21：混杂蛋白质
22：融合肽标签的蛋白质分解酶
22a：蛋白质分解酶
22b：肽标签
 序列表
<110> SYSMEX CORPORATION
<120> 蛋白质的纯化方法及含肽标签的融合蛋白质及其生产方法
<130> 15-062CN
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE12
<400> 1
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE18
<400> 2
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE24
<400> 3
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
20
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE30
<400> 4
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
20 25 30
<210> 5
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE36
<400> 5
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Asp Asp Asp
35
<210> 6
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DED
<400> 6
Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu Ile Gln Asp Asp Asp Glu Glu
35 40 45
Gly Phe Asp Asp Glu Glu Glu Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu His
50 55 60
Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asn Glu Glu Asn Glu Leu Glu Glu Leu Glu
65 70 75 80
Glu Arg Val Glu Ala Arg Lys Lys
85
<210> 7
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DES
<400> 7
Asp Leu Ser Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu
35 40
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EO24
<400> 8
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
20
<210> 9
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NQ01
<400> 9
Met Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr
1 5 10 15
Ser Phe Asn Tyr Ala Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys
20 25 30
Lys Gly Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn
35 40 45
Pro Ile Ile Ser Arg Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys Asp Pro Ala
50 55 60
Asn Phe Gln Tyr Pro Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys Glu Gly His
65 70 75 80
Leu Ser Pro Asp Ile Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asp
85 90 95
Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val Pro Ala Ile
100 105 110
Leu Lys Gly Trp Phe Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Thr
115 120 125
Tyr Ala Ala Met Tyr Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys Lys Ala Val
130 135 140
Leu Ser Ile Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser Leu Gln Gly
145 150 155 160
Ile His Gly Asp Met Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln Ser Gly Ile
165 170 175
Leu His Phe Cys Gly Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu Thr Tyr Ser
180 185 190
Ile Gly His Thr Pro Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu Glu Gly Trp
195 200 205
Lys Lys Arg Leu Glu Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu Tyr Phe Ala
210 215 220
Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Lys Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val
245 250 255
Gly His His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala
260 265 270
Arg Lys
<210> 10
<211> 546
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 10
Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu
1 5 10 15
Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr
20 25 30
Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu Val
35 40 45
Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala Glu
50 55 60
Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val Cys
65 70 75 80
Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu Phe
85 90 95
Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu
100 105 110
Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val Ser
115 120 125
Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro Ile
130 135 140
Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe
145 150 155 160
Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe Asn
165 170 175
Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala
180 185 190
Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Ala
195 200 205
Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp Pro
210 215 220
Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val Val
225 230 235 240
Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile
245 250 255
Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe
260 265 270
Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val Pro
275 280 285
Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp
290 295 300
Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys
305 310 315 320
Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile Arg
325 330 335
Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr Pro
340 345 350
Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe Phe
355 360 365
Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn
370 375 380
Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly Tyr
385 390 395 400
Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly Trp
405 410 415
Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe Phe
420 425 430
Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val
435 440 445
Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Phe
450 455 460
Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro
465 470 475 480
Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu
485 490 495
Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg
500 505 510
Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys
515 520 525
Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly
530 535 540
Gly Lys
545
<210> 11
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220> HRV3C
<400> 11
Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg
1 5 10 15
Pro His Arg Asp Gly Pro Asn Thr Glu Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg
20 25 30
Lys Asn Ile Met Thr Ile Thr Thr Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Leu
35 40 45
Gly Ile His Asp Arg Val Cys Val Ile Pro Thr His Ala Gln Pro Gly
50 55 60
Asp Asp Val Leu Val Asn Gly Gln Lys Ile Arg Val Lys Asp Lys Tyr
65 70 75 80
Lys Leu Val Asp Pro Glu Asn Ile Asn Leu Glu Leu Thr Val Leu Thr
85 90 95
Leu Asp Arg Asn Glu Lys Phe Arg Asp Ile Arg Gly Phe Ile Ser Glu
100 105 110
Asp Leu Glu Gly Val Asp Ala Thr Leu Val Val His Ser Asn Asn Phe
115 120 125
Thr Asn Thr Ile Leu Glu Val Gly Pro Val Thr Met Ala Gly Leu Ile
130 135 140
Asn Leu Ser Ser Thr Pro Thr Asn Arg Met Ile Arg Tyr Asp Tyr Ala
145 150 155 160
Thr Lys Thr Gly Gln Cys Gly Gly Val Leu Cys Ala Thr Gly Lys Ile
165 170 175
Phe Gly Ile His Val Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Ser Ala Gln
180 185 190
Leu Lys Lys Gln Tyr Phe Val Glu Lys Gln
195 200
<210> 12
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE12-HRV3Csite-NQO1
<400> 12
Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Lys Gly Thr
1 5 10 15
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile
20 25 30
Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr Ser Phe Asn Tyr Ala Met Lys Glu
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys Lys Gly Trp Glu Val Val Glu Ser
50 55 60
Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn Pro Ile Ile Ser Arg Lys Asp Ile
65 70 75 80
Thr Gly Lys Leu Lys Asp Pro Ala Asn Phe Gln Tyr Pro Ala Glu Ser
85 90 95
Val Leu Ala Tyr Lys Glu Gly His Leu Ser Pro Asp Ile Val Ala Glu
100 105 110
Gln Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asp Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu
115 120 125
Gln Trp Phe Gly Val Pro Ala Ile Leu Lys Gly Trp Phe Glu Arg Val
130 135 140
Phe Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Thr Tyr Ala Ala Met Tyr Asp Lys Gly
145 150 155 160
Pro Phe Arg Ser Lys Lys Ala Val Leu Ser Ile Thr Thr Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Ser Met Tyr Ser Leu Gln Gly Ile His Gly Asp Met Asn Val Ile
180 185 190
Leu Trp Pro Ile Gln Ser Gly Ile Leu His Phe Cys Gly Phe Gln Val
195 200 205
Leu Glu Pro Gln Leu Thr Tyr Ser Ile Gly His Thr Pro Ala Asp Ala
210 215 220
Arg Ile Gln Ile Leu Glu Gly Trp Lys Lys Arg Leu Glu Asn Ile Trp
225 230 235 240
Asp Glu Thr Pro Leu Tyr Phe Ala Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn
245 250 255
Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys Lys Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys
260 265 270
Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val Gly His His Leu Gly Lys Ser Ile
275 280 285
Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala Arg Lys
290 295
<210> 13
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE18-HRV3Csite-NQO1
<400> 13
Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Lys Gly Thr Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met Val
20 25 30
Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr Ser Phe
35 40 45
Asn Tyr Ala Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys Lys Gly
50 55 60
Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn Pro Ile
65 70 75 80
Ile Ser Arg Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys Asp Pro Ala Asn Phe
85 90 95
Gln Tyr Pro Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys Glu Gly His Leu Ser
100 105 110
Pro Asp Ile Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asp Leu Val
115 120 125
Ile Phe Gln Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val Pro Ala Ile Leu Lys
130 135 140
Gly Trp Phe Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Thr Tyr Ala
145 150 155 160
Ala Met Tyr Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys Lys Ala Val Leu Ser
165 170 175
Ile Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser Leu Gln Gly Ile His
180 185 190
Gly Asp Met Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln Ser Gly Ile Leu His
195 200 205
Phe Cys Gly Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu Thr Tyr Ser Ile Gly
210 215 220
His Thr Pro Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu Glu Gly Trp Lys Lys
225 230 235 240
Arg Leu Glu Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu Tyr Phe Ala Pro Ser
245 250 255
Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys Lys Glu
260 265 270
Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val Gly His
275 280 285
His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala Arg Lys
290 295 300
<210> 14
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE24-HRV3Csite-NQO1
<400> 14
Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Lys Gly Thr Leu Glu Val Leu
20 25 30
Phe Gln Gly Pro Met Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His
35 40 45
Ser Glu Arg Thr Ser Phe Asn Tyr Ala Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Leu Lys Lys Lys Gly Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Met Asn Phe Asn Pro Ile Ile Ser Arg Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu
85 90 95
Lys Asp Pro Ala Asn Phe Gln Tyr Pro Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr
100 105 110
Lys Glu Gly His Leu Ser Pro Asp Ile Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu
115 120 125
Glu Ala Ala Asp Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly
130 135 140
Val Pro Ala Ile Leu Lys Gly Trp Phe Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu
145 150 155 160
Phe Ala Tyr Thr Tyr Ala Ala Met Tyr Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser
165 170 175
Lys Lys Ala Val Leu Ser Ile Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr
180 185 190
Ser Leu Gln Gly Ile His Gly Asp Met Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile
195 200 205
Gln Ser Gly Ile Leu His Phe Cys Gly Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln
210 215 220
Leu Thr Tyr Ser Ile Gly His Thr Pro Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile
225 230 235 240
Leu Glu Gly Trp Lys Lys Arg Leu Glu Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro
245 250 255
Leu Tyr Phe Ala Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly
260 265 270
Phe Leu Met Lys Lys Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe
275 280 285
Gly Leu Ser Val Gly His His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn
290 295 300
Gln Ile Lys Ala Arg Lys
305 310
<210> 15
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE30-HRV3Csite-NQO1
<400> 15
Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Lys
20 25 30
Gly Thr Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met Val Gly Arg Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr Ser Phe Asn Tyr Ala Met
50 55 60
Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys Lys Gly Trp Glu Val Val
65 70 75 80
Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn Pro Ile Ile Ser Arg Lys
85 90 95
Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys Asp Pro Ala Asn Phe Gln Tyr Pro Ala
100 105 110
Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys Glu Gly His Leu Ser Pro Asp Ile Val
115 120 125
Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asp Leu Val Ile Phe Gln Phe
130 135 140
Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val Pro Ala Ile Leu Lys Gly Trp Phe Glu
145 150 155 160
Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Thr Tyr Ala Ala Met Tyr Asp
165 170 175
Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys Lys Ala Val Leu Ser Ile Thr Thr Gly
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser Leu Gln Gly Ile His Gly Asp Met Asn
195 200 205
Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln Ser Gly Ile Leu His Phe Cys Gly Phe
210 215 220
Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu Thr Tyr Ser Ile Gly His Thr Pro Ala
225 230 235 240
Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu Glu Gly Trp Lys Lys Arg Leu Glu Asn
245 250 255
Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu Tyr Phe Ala Pro Ser Ser Leu Phe Asp
260 265 270
Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys Lys Glu Val Gln Asp Glu
275 280 285
Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val Gly His His Leu Gly Lys
290 295 300
Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala Arg Lys
305 310 315
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 16
Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Asp Lys Gly Thr Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
35 40 45
Met Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr
50 55 60
Ser Phe Asn Tyr Ala Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys
65 70 75 80
Lys Gly Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn
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Pro Ile Ile Ser Arg Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys Asp Pro Ala
100 105 110
Asn Phe Gln Tyr Pro Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys Glu Gly His
115 120 125
Leu Ser Pro Asp Ile Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asp
130 135 140
Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val Pro Ala Ile
145 150 155 160
Leu Lys Gly Trp Phe Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Thr
165 170 175
Tyr Ala Ala Met Tyr Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys Lys Ala Val
180 185 190
Leu Ser Ile Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser Leu Gln Gly
195 200 205
Ile His Gly Asp Met Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln Ser Gly Ile
210 215 220
Leu His Phe Cys Gly Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu Thr Tyr Ser
225 230 235 240
Ile Gly His Thr Pro Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu Glu Gly Trp
245 250 255
Lys Lys Arg Leu Glu Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu Tyr Phe Ala
260 265 270
Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys
275 280 285
Lys Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val
290 295 300
Gly His His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala
305 310 315 320
Arg Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DED-HRV3Csite-NQO1
<400> 17
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Met Ala Ser Asp Leu Ser
1 5 10 15
Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
35 40 45
Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu Ile Gln Asp Asp Asp Glu Glu
50 55 60
Gly Phe Asp Asp Glu Glu Glu Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu His
65 70 75 80
Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asn Glu Glu Asn Glu Leu Glu Glu Leu Glu
85 90 95
Glu Arg Val Glu Ala Arg Lys Lys Ala Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln
100 105 110
Gly Pro Met Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu
115 120 125
Arg Thr Ser Phe Asn Tyr Ala Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu
130 135 140
Lys Lys Lys Gly Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn
145 150 155 160
Phe Asn Pro Ile Ile Ser Arg Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys Asp
165 170 175
Pro Ala Asn Phe Gln Tyr Pro Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys Glu
180 185 190
Gly His Leu Ser Pro Asp Ile Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu Ala
195 200 205
Ala Asp Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val Pro
210 215 220
Ala Ile Leu Lys Gly Trp Phe Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe Ala
225 230 235 240
Tyr Thr Tyr Ala Ala Met Tyr Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys Lys
245 250 255
Ala Val Leu Ser Ile Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser Leu
260 265 270
Gln Gly Ile His Gly Asp Met Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln Ser
275 280 285
Gly Ile Leu His Phe Cys Gly Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu Thr
290 295 300
Tyr Ser Ile Gly His Thr Pro Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu Glu
305 310 315 320
Gly Trp Lys Lys Arg Leu Glu Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu Tyr
325 330 335
Phe Ala Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu
340 345 350
Met Lys Lys Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu
355 360 365
Ser Val Gly His His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile
370 375 380
Lys Ala Arg Lys
385
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<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DES-HRV3Csite-NQO1
<400> 18
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Met Ala Ser Asp Leu Ser
1 5 10 15
Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
35 40 45
Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu Ala Ser Leu Glu Val Leu Phe
50 55 60
Gln Gly Pro Met Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser
65 70 75 80
Glu Arg Thr Ser Phe Asn Tyr Ala Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Leu Lys Lys Lys Gly Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met
100 105 110
Asn Phe Asn Pro Ile Ile Ser Arg Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys
115 120 125
Asp Pro Ala Asn Phe Gln Tyr Pro Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys
130 135 140
Glu Gly His Leu Ser Pro Asp Ile Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu
145 150 155 160
Ala Ala Asp Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val
165 170 175
Pro Ala Ile Leu Lys Gly Trp Phe Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe
180 185 190
Ala Tyr Thr Tyr Ala Ala Met Tyr Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys
195 200 205
Lys Ala Val Leu Ser Ile Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser
210 215 220
Leu Gln Gly Ile His Gly Asp Met Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln
225 230 235 240
Ser Gly Ile Leu His Phe Cys Gly Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu
245 250 255
Thr Tyr Ser Ile Gly His Thr Pro Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu
260 265 270
Glu Gly Trp Lys Lys Arg Leu Glu Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu
275 280 285
Tyr Phe Ala Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe
290 295 300
Leu Met Lys Lys Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly
305 310 315 320
Leu Ser Val Gly His His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln
325 330 335
Ile Lys Ala Arg Lys
340
<210> 19
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EO24-HRV3Csite-NQO1
<400> 19
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Met Ala Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met
35 40 45
Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr Ser
50 55 60
Phe Asn Tyr Ala Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Gly Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn Pro
85 90 95
Ile Ile Ser Arg Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys Asp Pro Ala Asn
100 105 110
Phe Gln Tyr Pro Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys Glu Gly His Leu
115 120 125
Ser Pro Asp Ile Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asp Leu
130 135 140
Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val Pro Ala Ile Leu
145 150 155 160
Lys Gly Trp Phe Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Thr Tyr
165 170 175
Ala Ala Met Tyr Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys Lys Ala Val Leu
180 185 190
Ser Ile Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser Leu Gln Gly Ile
195 200 205
His Gly Asp Met Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln Ser Gly Ile Leu
210 215 220
His Phe Cys Gly Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu Thr Tyr Ser Ile
225 230 235 240
Gly His Thr Pro Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu Glu Gly Trp Lys
245 250 255
Lys Arg Leu Glu Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu Tyr Phe Ala Pro
260 265 270
Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys Lys
275 280 285
Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val Gly
290 295 300
His His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala Arg
305 310 315 320
Lys
<210> 20
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NQO1-HRV3Csite-DED
<400> 20
Met Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr
1 5 10 15
Ser Phe Asn Tyr Ala Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys
20 25 30
Lys Gly Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn
35 40 45
Pro Ile Ile Ser Arg Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys Asp Pro Ala
50 55 60
Asn Phe Gln Tyr Pro Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys Glu Gly His
65 70 75 80
Leu Ser Pro Asp Ile Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asp
85 90 95
Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val Pro Ala Ile
100 105 110
Leu Lys Gly Trp Phe Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Thr
115 120 125
Tyr Ala Ala Met Tyr Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys Lys Ala Val
130 135 140
Leu Ser Ile Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser Leu Gln Gly
145 150 155 160
Ile His Gly Asp Met Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln Ser Gly Ile
165 170 175
Leu His Phe Cys Gly Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu Thr Tyr Ser
180 185 190
Ile Gly His Thr Pro Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu Glu Gly Trp
195 200 205
Lys Lys Arg Leu Glu Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu Tyr Phe Ala
210 215 220
Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Lys Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val
245 250 255
Gly His His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala
260 265 270
Arg Lys Gly Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Ser Asp Leu Ser
275 280 285
Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu Glu Glu Glu
290 295 300
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
305 310 315 320
Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu Ile Gln Asp Asp Asp Glu Glu
325 330 335
Gly Phe Asp Asp Glu Glu Glu Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu His
340 345 350
Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asn Glu Glu Asn Glu Leu Glu Glu Leu Glu
355 360 365
Glu Arg Val Glu Ala Arg Lys Lys Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
370 375 380
Asp Lys
385
<210> 21
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NQO1-HRV3Csite-DES
<400> 21
Met Val Gly Arg Arg Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr
1 5 10 15
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Lys Gly Trp Glu Val Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn
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Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Lys Glu Val Gln Asp Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val
245 250 255
Gly His His Leu Gly Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala
260 265 270
Arg Lys Gly Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Ser Asp Leu Ser
275 280 285
Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu Glu Glu Glu
290 295 300
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
305 310 315 320
Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Asp
325 330 335
Asp Asp Lys
<210> 22
<211> 660
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DED-HRV3Csite-荧光素酶
<400> 22
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Met Ala Ser Asp Leu Ser
1 5 10 15
Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
35 40 45
Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu Ile Gln Asp Asp Asp Glu Glu
50 55 60
Gly Phe Asp Asp Glu Glu Glu Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu His
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile
145 150 155 160
Glu Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu
165 170 175
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180 185 190
Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala
195 200 205
Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu
210 215 220
Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe
225 230 235 240
Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu
245 250 255
Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln
260 265 270
Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly
275 280 285
Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr
290 295 300
Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly
305 310 315 320
Val Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg
325 330 335
Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser
340 345 350
Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr
355 360 365
Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu
370 375 380
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Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro
465 470 475 480
Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly
485 490 495
Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser
500 505 510
Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp
515 520 525
Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His
530 535 540
Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr
545 550 555 560
Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn
565 570 575
Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu
580 585 590
Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu
595 600 605
Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys
610 615 620
Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr
625 630 635 640
Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys
645 650 655
Lys Gly Gly Lys
660
<210> 23
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DES-HRV3Csite-荧光素酶
<400> 23
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Met Ala Ser Asp Leu Ser
1 5 10 15
Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
35 40 45
Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu Ala Ser Leu Glu Val Leu Phe
50 55 60
Gln Gly Pro Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe
65 70 75 80
Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met
85 90 95
Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His
100 105 110
Ile Glu Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg
115 120 125
Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile
130 135 140
Val Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly
145 150 155 160
Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn
165 170 175
Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val
180 185 190
Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys
195 200 205
Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr
210 215 220
Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro
225 230 235 240
Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys
245 250 255
Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys
260 265 270
Gly Val Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala
275 280 285
Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu
290 295 300
Ser Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly
305 310 315 320
Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu
325 330 335
Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu
340 345 350
Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp
355 360 365
Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro
370 375 380
Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro
385 390 395 400
Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu
405 410 415
Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val
420 425 430
Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu
435 440 445
Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met
450 455 460
Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys
465 470 475 480
Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu
485 490 495
His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly
500 505 510
Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro
515 520 525
Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly
530 535 540
Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr
545 550 555 560
Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys
565 570 575
Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu
580 585 590
Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala
595 600 605
Lys Lys Gly Gly Lys
610
<210> 24
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DED-HRV3C
<400> 24
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Met Ala Ser Asp Leu Ser
1 5 10 15
Asn Val Glu Gly Lys Thr Gly Asn Ala Thr Asp Glu Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
35 40 45
Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gly Ala Glu Ile Gln Asp Asp Asp Glu Glu
50 55 60
Gly Phe Asp Asp Glu Glu Glu Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu His
65 70 75 80
Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asn Glu Glu Asn Glu Leu Glu Glu Leu Glu
85 90 95
Glu Arg Val Glu Ala Arg Lys Lys Met His His His His His His Ser
100 105 110
Ser Gly Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val
115 120 125
Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu
130 135 140
His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe
145 150 155 160
Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp
165 170 175
Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys
180 185 190
His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met
195 200 205
Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala
210 215 220
Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu
225 230 235 240
Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr
245 250 255
Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala
260 265 270
Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro
275 280 285
Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp
290 295 300
Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp
305 310 315 320
Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val
325 330 335
Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg
340 345 350
Asp Gly Pro Asn Thr Glu Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Lys Asn Ile
355 360 365
Met Thr Ile Thr Thr Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Leu Gly Ile His
370 375 380
Asp Arg Val Cys Val Ile Pro Thr His Ala Gln Pro Gly Asp Asp Val
385 390 395 400
Leu Val Asn Gly Gln Lys Ile Arg Val Lys Asp Lys Tyr Lys Leu Val
405 410 415
Asp Pro Glu Asn Ile Asn Leu Glu Leu Thr Val Leu Thr Leu Asp Arg
420 425 430
Asn Glu Lys Phe Arg Asp Ile Arg Gly Phe Ile Ser Glu Asp Leu Glu
435 440 445
Gly Val Asp Ala Thr Leu Val Val His Ser Asn Asn Phe Thr Asn Thr
450 455 460
Ile Leu Glu Val Gly Pro Val Thr Met Ala Gly Leu Ile Asn Leu Ser
465 470 475 480
Ser Thr Pro Thr Asn Arg Met Ile Arg Tyr Asp Tyr Ala Thr Lys Thr
485 490 495
Gly Gln Cys Gly Gly Val Leu Cys Ala Thr Gly Lys Ile Phe Gly Ile
500 505 510
His Val Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Ser Ala Gln Leu Lys Lys
515 520 525
Gln Tyr Phe Val Glu Lys Gln
530 535
<210> 25
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE12
<400> 25
gatgacaaag gtatggctag cgaggaggaa gaggaagaag atgatgatga tgacgacgct 60
agcctggaag ttctgttc 78
<210> 26
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE12
<400> 26
gaacagaact tccaggctag cgtcgtcatc atcatcatct tcttcctctt cctcctcgct 60
agccatacct ttgtcatc 78
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物1
<400> 27
cgatacaaat ggaaataata accatctcgc 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2
<400> 28
cgcacagaat ctaacgctta ataaatgtac 30
<210> 29
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NQ01
<400> 29
atggtgggac gccgtgctct gatcgtgctc gctcactcgg aaagaacatc gttcaactac 60
gctatgaagg aggctgctgc cgctgccctg aagaagaagg gctgggaggt ggtcgaatcc 120
gacttgtacg ctatgaactt caaccccatc atctctcgta aggacatcac cggcaagctg 180
aaggatccag ccaacttcca gtacccggct gagtcagttt tggcctacaa ggaaggccac 240
ctgtcgcctg acatcgtggc tgagcaaaag aagctcgaag ctgccgattt ggttatcttc 300
cagttcccct tgcaatggtt cggtgtgcct gctatcctga agggctggtt cgagagggtc 360
ttcatcggag aattcgccta cacttacgct gccatgtacg acaagggtcc attcagatcg 420
aagaaggccg tcctgtccat caccactggt ggcagcggat caatgtacag cctccaggga 480
atccacggtg acatgaacgt catcctgtgg ccgatccaat ctggcatcct ccacttctgc 540
ggattccagg tgttggagcc acaactgaca tactccatcg gacacacccc agctgacgct 600
cgtatccaga tcctcgaagg atggaagaag cgcttggaga acatctggga cgaaactccc 660
ttgtacttcg ctccttcctc tctgttcgat ctcaacttcc aggccggttt cctcatgaag 720
aaggaggtcc aagacgagga aaagaacaag aagttcggcc tgtctgttgg acaccacctc 780
ggcaagagca tccccacaga taaccagatc aaggctagga agtaa 825
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物3F
<400> 30
ctgttccagg gtcccatggt gggacgccgt 30
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物3R
<400> 31
ggagctcgaa ttcccttact tcctagcctt gatctg 36
<210> 32
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE18
<400> 32
gatgacaaag gtatggctag cgaagaagag gaggaggaag aggaagaaga tgatgatgat 60
gacgacgacg acgacgctag cctggaagtt ctgttc 96
<210> 33
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE18
<400> 33
gaacagaact tccaggctag cgtcgtcgtc gtcgtcatca tcatcatctt cttcctcttc 60
ctcctcctct tcttcgctag ccataccttt gtcatc 96
<210> 34
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DED
<400> 34
gatctaagta atgtggaagg taagacagga aatgcaacag atgaagagga ggaagaagag 60
gaggaggaag aggaagaaga tgatgatgat gacgacgacg acgacgatga tgatgaagac 120
tctggagctg agatacaaga tgatgatgag gaaggttttg atgatgaaga ggaatttgat 180
gatgacgatg atgatgaaca tgatgatgat gatcttgaga atgaggaaaa cgaactggaa 240
gagttggaag agagggtaga agccaggaag aaa 273
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物4F
<400> 35
aatagatctt ggtacccatg gaagaggagg aaga 34
<210> 36
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物4R
<400> 36
ggagctcgaa ttcccgggac cctggaacag aacttccagg gtacctttat catcatcgtc 60
gtc 63
<210> 37
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE30
<400> 37
gaacagaact tccaggctag catcatcatc gtcgtcgtcg tcgtcatcat catcatcgtc 60
gtcgtcctct tcctcttctt cctcttcctc ctcctcttct tcctcctctt cgctagccat 120
acctttgtca tc 132
<210> 38
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE30
<400> 38
gatgacaaag gtatggctag cgaagaggag gaagaagagg aggaggaaga ggaagaagag 60
gaagaggacg acgacgatga tgatgatgac gacgacgacg acgatgatga tgctagcctg 120
gaagttctgt tc 132
<210> 39
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE36
<400> 39
gaacagaact tccaggctag catcatcatc gtcgtcgtcg tcgtcatcat catcatcgtc 60
gtcgtcgtcg tcgtcctctt cctcctcttc ctcttcttcc tcttcctcct cctcttcttc 120
ctcctcttcg ctagccatac ctttgtcatc 150
<210> 40
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE36
<400> 40
gatgacaaag gtatggctag cgaagaggag gaagaagagg aggaggaaga ggaagaagag 60
gaagaggagg aagaggacga cgacgacgac gacgatgatg atgatgacga cgacgacgac 120
gatgatgatg ctagcctgga agttctgttc 150
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5F
<400> 41
caaaggtatg gctagcgatc taagtaatgt ggaagg 36
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5R
<400> 42
gaacttccag gctagctttc ttcctggctt ctacc 35
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物6F
<400> 43
gacaaaggta tggctagcga tctaagtaat gtggaagg 38
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物6R
<400> 44
ggaacagaac ttccaggcta gcctcagctc cagagtc 37
<210> 45
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EO24
<400> 45
gatgacaaag gtatggctag cgaagaggag gaagaagagg aggaggaaga ggaagaagaa 60
gaggaggaag aagaggagga ggaagaggaa gaagctagcc tggaagttct gttc 114
<210> 46
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EO24
<400> 46
gaacagaact tccaggctag cttcttcctc ttcctcctcc tcttcttcct cctcttcttc 60
ttcctcttcc tcctcctctt cttcctcctc ttcgctagcc atacctttgt catc 114
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物7F
<400> 47
gttccagggt ccagctagcg atctaagtaa tgtgg 35
<210> 48
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物7R
<400> 48
cgtccttgta gtcgctagct ttcttcctgg cttc 34
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物8F
<400> 49
cctataaata gatctcccat ggtgggacgc cgt 33
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物8R
<400> 50
gaacagaact tccagcccct tcctagcctt gatctg 36
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物9F
<400> 51
gttccagggt ccagctagcg atctaagtaa tgtggaagg 39
<210> 52
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物9R
<400> 52
catcgtcctt gtagtcgcta gcctcagctc cagagtc 37
<210> 53
<211> 1638
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 53
gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atcctctaga ggatggaacc 60
gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg aacaattgct 120
tttacagatg cacatatcga ggtgaacatc acgtacgcgg aatacttcga aatgtccgtt 180
cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat cgtcgtatgc 240
agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg cgttatttat cggagttgca 300
gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa cgtgaattgc tcaacagtat gaacatttcg 360
cagcctaccg tagtgtttgt ttccaaaaag gggttgcaaa aaattttgaa cgtgcaaaaa 420
aaattaccaa taatccagaa aattattatc atggattcta aaacggatta ccagggattt 480
cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat ctacctcccg gttttaatga atacgatttt 540
gtaccagagt cctttgatcg tgacaaaaca attgcactga taatgaattc ctctggatct 600
actgggttac ctaagggtgt ggcccttccg catagaactg cctgcgtcag attctcgcat 660
gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc attccggata ctgcgatttt aagtgttgtt 720
ccattccatc acggttttgg aatgtttact acactcggat atttgatatg tggatttcga 780
gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag ctgtttttac gatcccttca ggattacaaa 840
attcaaagtg cgttgctagt accaacccta ttttcattct tcgccaaaag cactctgatt 900
gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa attgcttctg ggggcgcacc tctttcgaaa 960
gaagtcgggg aagcggttgc aaaacgcttc catcttccag ggatacgaca aggatatggg 1020
ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt acacccgagg gggatgataa accgggcgcg 1080
gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg aaggttgtgg atctggatac cgggaaaacg 1140
ctgggcgtta atcagagagg cgaattatgt gtcagaggac ctatgattat gtccggttat 1200
gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg attgacaagg atggatggct acattctgga 1260
gacatagctt actgggacga agacgaacac ttcttcatag ttgaccgctt gaagtcttta 1320
attaaataca aaggatatca ggtggccccc gctgaattgg aatcgatatt gttacaacac 1380
cccaacatct tcgacgcggg cgtggcaggt cttcccgacg atgacgccgg tgaacttccc 1440
gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag acgatgacgg aaaaagagat cgtggattac 1500
gtcgccagtc aagtaacaac cgcgaaaaag ttgcgcggag gagttgtgtt tgtggacgaa 1560
gtaccgaaag gtcttaccgg aaaactcgac gcaagaaaaa tcagagagat cctcataaag 1620
gccaagaagg gcggaaag 1638
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物10F
<400> 54
ctgttccagg gtcccgaaga cgccaaaaac 30
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物10R
<400> 55
ggagctcgaa ttcccttact ttccgccctt cttgg 35
<210> 56
<211> 1296
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRV3C
<400> 56
atgcaccacc accatcatca ttcgagcggt atgagcccca ttttggggta ttggaaaatc 60
aaaggtctgg ttcaaccaac ccggctcctg cttgaatatc ttgaagagaa atacgaagag 120
catctgtatg aacgtgacga aggcgataaa tggcgcaata agaagtttga acttggcctg 180
gagtttccga acttgccgta ttacattgat ggcgatgtga aactgacaca gtctatggcg 240
attattcgct atattgcgga caaacacaac atgttaggcg gttgcccgaa agaacgtgcg 300
gaaatctcaa tgttagaagg ggctgttctc gatattcgct atggcgtgtc tcgtatcgca 360
tacagtaaag actttgaaac gctgaaagtc gattttcttt cgaaattgcc ggagatgctg 420
aaaatgttcg aagatcggtt gtgccacaaa acgtatctga acggggatca tgtcacccat 480
ccggatttca tgttgtacga tgctctggat gtggtgctgt atatggaccc aatgtgcttg 540
gacgcgtttc caaagctggt gtgtttcaag aaacgcattg aggccattcc gcagattgat 600
aaatacctga aaagctcgaa atatattgcg tggcctctgc agggttggca agccaccttt 660
ggtggcggag atcaccctcc gaaaagcgat ctggtcccgc gtgggagtcc tgaatttcca 720
ggtcgccttg agcgcccgca tcgtgatggt ccgaacacgg aattcgcact gtccctcctg 780
cgcaagaaca ttatgacaat caccacgagc aaaggcgaat tcactggact gggaatccat 840
gatcgcgtgt gtgttattcc cacccatgca cagcctggtg atgacgtcct ggtaaatggc 900
cagaaaatcc gcgttaaaga caaatacaaa ctggtagacc cggaaaacat caatctcgaa 960
ctgaccgtgt taaccttaga ccgtaacgag aaatttcgcg acattcgcgg tttcatttcc 1020
gaggacctcg aaggtgtgga tgcaacgctg gtagtgcatt ccaacaattt cacgaatacc 1080
atcctggaag ttggcccggt tacaatggcc ggcttaatca acctgtctag tactcccacc 1140
aatcgtatga ttcgctatga ttacgcgacc aagactggcc aatgtggtgg agtcttatgc 1200
gctactggca aaatctttgg gatccacgtt ggtggcaatg gccgtcaggg cttttcagcc 1260
caactgaaga aacagtactt cgtagaaaag cagtaa 1296
<210> 57
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物11F
<400> 57
cgatgacaaa ggtatggcta gcgatctaag taatgtggaa gg 42
<210> 58
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物11R
<400> 58
gatgatggtg gtggtgcatt ttcttcctgg cttctaccc 39
<210> 59
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物12F
<400> 59
gggtagaagc caggaagaaa atgcaccacc accatcatc 39
<210> 60
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物12R
<400> 60
ctcgaggagc tcgaattccc ttactgcttt tctacgaagt actg 44
<210> 61
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物13F
<400> 61
ctttaagaag gagatataca tatggactac aaggacgacg atgac 45
<210> 62
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物13R
<400> 62
ccaccagtca tgctagccat atgttactgc ttttctacga agtac 45
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物14
<400> 63
atgcgtccgg cgtaga 16
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物15
<400> 64
ccctcaagac ccgtttag 18
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DE6
<400> 65
Glu Glu Glu Asp Asp Asp
1 5
<210> 66
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE6
<400> 66
gatgacaaag gtatggctag cgaggaagaa gatgatgatg ctagcctgga agttctgttc 60
<210> 67
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DE6
<400> 67
gaacagaact tccaggctag catcatcatc ttcttcctcg ctagccatac ctttgtcatc 60

Claims (19)

1.蛋白质的纯化方法，其包括：
调制含有含肽标签的氨基酸序列和目标蛋白质的氨基酸序列的融合蛋白质的试样的工序、及
将与上述融合蛋白质一同含在上述试样中的混杂蛋白质和上述试样中的融合蛋白质分离的工序，
上述肽标签含12个残基以上的酸性氨基酸残基。
2.权利要求1所述的方法，其中上述肽标签有SEQ ID NO：1～8的任一个的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的方法，其中上述肽标签含18个残基以上的酸性氨基酸残基。
4.权利要求1所述的方法，其中上述融合蛋白质的等电点不足6。
5.权利要求1所述的方法，其中上述试样的盐浓度是50mM以上500mM以下。
6.权利要求1所述的方法，其中在上述试样调制工序中，向宿主细胞导入含编码上述融合蛋白质的多核苷酸的载体，使蛋白质在宿主细胞表达而取得上述试样。
7.权利要求1所述的方法，其中上述融合蛋白质在肽标签的氨基酸序列和上述目标蛋白质的氨基酸序列之间还含蛋白质分解酶识别的切断位点。
8.权利要求1所述的方法，其中在上述分离工序中，使用离子交换树脂进行上述融合蛋白质和上述混杂蛋白质的分离。
9.权利要求1所述的方法，其中上述离子交换树脂是阴离子交换树脂。
10.权利要求1所述的方法，其中在上述分离工序中，通过使上述试样通过阴离子交换树脂而取得结合了上述融合蛋白质的阴离子交换树脂和含上述混杂蛋白质的通过级分，使用盐浓度600mM以上的缓冲液从上述阴离子交换树脂溶出上述融合蛋白质。
11.权利要求1～10之任一项所述的蛋白质的纯化方法，其中在上述分离工序之后，还包括使用识别上述切断位点的蛋白质分解酶，在溶液中将上述融合蛋白质分离为上述目标蛋白质和上述肽标签，取得上述目标蛋白质的工序。
12.权利要求11所述的蛋白质的纯化方法，其中在上述目标蛋白质取得工序中，使含上述目标蛋白质及上述肽标签的溶液通过阴离子交换树脂，取得结合了上述肽标签的阴离子交换树脂和含上述目标蛋白质的阴离子交换树脂的通过级分。
13.权利要求10所述的方法，其中含上述目标蛋白质及上述肽标签的溶液的盐浓度是500mM以下。
14.融合蛋白质，其含肽标签的氨基酸序列和目标蛋白质的氨基酸序列，所述肽标签含12个残基以上的酸性氨基酸残基。
15.权利要求14所述的融合蛋白质，其中上述肽标签有SEQ ID NO：1～8的任一个的氨基酸序列。
16.权利要求14所述的融合蛋白质，其中上述肽标签含18个残基以上的酸性氨基酸残基。
17.权利要求14所述的融合蛋白质，其中上述融合蛋白质的等电点不足6。
18.权利要求14所述的融合蛋白质，其中上述融合蛋白质在肽标签的氨基酸序列和上述目标蛋白质的氨基酸序列之间还含蛋白质分解酶识别的切断位点。
19.权利要求14～18之任一项所述的融合蛋白质的生产方法，其包括：
向宿主细胞导入含编码上述肽标签的氨基酸序列的碱基序列和编码上述融合蛋白质的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸的工序、及
在上述宿主细胞中表达上述融合蛋白质的工序。
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CN109929023A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 中国医学科学院药物研究所 一种金属亲和性融合蛋白标签及其应用
CN111072772A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 上海良润生物医药科技有限公司 一种肽标签及其在检测或纯化融合蛋白质的应用

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107266526A (zh) * 2016-04-07 2017-10-20 希森美康株式会社 目标蛋白质的纯化方法
CN109929023A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 中国医学科学院药物研究所 一种金属亲和性融合蛋白标签及其应用
CN109929023B (zh) * 2017-12-15 2022-06-21 中国医学科学院药物研究所 一种金属亲和性融合蛋白标签及其应用
CN111072772A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 上海良润生物医药科技有限公司 一种肽标签及其在检测或纯化融合蛋白质的应用
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