CN109851683B - 一种金属配合物、一种金属配合物的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金属配合物、一种金属配合物的制备方法及其应用。所述金属配合物包括式I所示的结构单元。本发明用天然水溶性的纤维素作为配体与金属离子复合来得到金属配合物，本发明合成金属配合物的制备方法工艺简单，条件温和；溶解度高、吸收率高、生物利用度高；而且制备无需其它佐剂，成本小，可以直接压成片剂，有望实现产业化。

Description

一种金属配合物、一种金属配合物的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种金属配合物、一种金属配合物的制备方法和应用领域。

背景技术

羧甲基纤维素(CMC)作为一种纤维素衍生物，近年来研究显示，具有诱导成骨分化的潜力。因其良好的生物相容性和水溶性，CMC已广泛应用于食品添加剂、洗涤剂、水净化剂、医药添加剂等领域。目前CMC也被用于生物医学工程，包括防粘连和组织工程材料。另外，有研究报道CMC可以刺激小鼠成纤维细胞在体外迁移、扩散和粘附。此外，有研究证明CMC可以抑制小鼠骨髓祖细胞破骨细胞的生长。含有β-磷酸三钙(β-TCP)的CMC凝胶，低浓度的CMC可以提高碱性磷酸酶(ALP)活性，促进人类骨髓基质细胞的增殖。这些研究表明CMC在骨再生中起着重要的作用。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种金属配合物、该金属配合物的制备方法以及其应用。

根据第一个方面，本发明提供了一种金属配合物，其包括式I所示的结构单元：

式I中，

R₁和R₂相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、硝基、氰基、氨基、单-C₁-C₆烷基取代的氨基和双-C₁-C₆烷基取代的氨基；

R₃和R₄相同或不同，各自独立地选自氢、C₁-C₆烷基和一个或多个羟基取代的C₁-C₆烷基；

W为-(CH₂)_n-，其中n为1-6，优选1-3，如1、2或3；

M为金属离子，优选选自钙离子、镁离子、锌离子和亚铁离子。

根据第二个方面，本发明提供了一种金属配合物的制备方法，其包括步骤S4：使具有式II所示的结构单元的纤维素或其衍生物与金属盐反应，生成具有式I所示的结构单元的金属配合物，

在上述式I和式II中，R₁和R₂相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、硝基、氰基、氨基、单-C₁-C₆烷基取代的氨基和双-C₁-C₆烷基取代的氨基；

R₃和R₄相同或不同，各自独立地选自氢、C₁-C₆烷基和一个或多个羟基取代的C₁-C₆烷基；

W为-(CH₂)_n-，其中n为1-6，优选1-3，如1、2或3；

M为金属离子，优选选自钙离子、镁离子、锌离子和亚铁离子。

根据本发明的一些实施方式，步骤S4中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂优选选自水、酮、醇、醚、DMF和DMSO中的一种或多种。根据一个实施例，所述溶剂为水。

根据本发明的一些实施方式，步骤S4中，所述金属盐选自碳酸盐、碳酸氢盐、硝酸盐、硫酸盐和卤化物中的一种或多种。根据一个实施例，所述金属盐为碳酸钙。

根据本发明的一些实施方式，所述制备方法还包括步骤S3：使具有式III所示的结构单元的纤维素或其衍生物与氧化剂优选高锰酸钾反应，生成具有式II所示的结构单元的纤维素或其衍生物，

其中，R₁和R₂相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、硝基、氰基、氨基、单-C₁-C₆烷基取代的氨基和双-C₁-C₆烷基取代的氨基；

R₃和R₄相同或不同，各自独立地选自氢、C₁-C₆烷基和一个或多个羟基取代的C₁-C₆烷基；

R₅和R₆相同或不同，各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基和醛基；

W为-(CH₂)_n-，其中n为1-6，优选1-3，如1、2或3。

根据本发明的一些实施方式，所述制备方法还包括步骤S2：使具有式IV所示的结构单元的纤维素或其衍生物与式V所示的化合物反应，生成具有式III所示的结构单元的纤维素或其衍生物，

式IV中，R选自氢、卤素和C₁-C₆烷基；R₃和R₄相同或不同，各自独立地选自氢、C₁-C₆烷基和一个或多个羟基取代的C₁-C₆烷基；W为-(CH₂)_n-，其中n为1-6，优选1-3，如1、2或3；

式V中，R₁和R₂相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、硝基、氰基、氨基、单-C₁-C₆烷基取代的氨基和双-C₁-C₆烷基取代的氨基；R₅和R₆相同或不同，各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基和醛基。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中，所述反应在缩合剂和溶剂存在下进行，优选地，所述缩合剂选自EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉)、DCC/DMAP、DIC/DMAP、EDC/HOBt/NMM和HATU/NMM；所述溶剂选自DMF、DMSO、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中，所述反应的时间为24-96小时，优选60-80小时；所述反应的温度为15-35℃，优选为20-28℃。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中，所述反应在酸性条件下进行，所述反应的温度为15-35℃，优选为20-28℃；和/或，所述反应的时间为1-60小时，优选为10-60小时，更优选为20-50小时；

根据本发明的一些实施方式，所述制备方法的合成路线如下所示：

根据第三个方面，本发明提供了一种药物组合物或金属元素补充剂，其包含根据第一个方面所述的金属配合物和/或根据第二个方面所述的制备方法制备的金属配合物，优选进一步包含药学上可接受的载体。

根据第四个方面，本发明提供了根据第一个方面所述的金属配合物和/或根据第二个方面所述的制备方法制备的金属配合物在制备用于治疗金属元素缺乏导致的疾病的药物中的应用。

本发明用天然水溶性的纤维素或其衍生物作为配体与金属离子复合来得到金属配合物。本发明合成金属配合物的制备方法工艺简单，条件温和；溶解度高、吸收率高、生物利用度高；而且制备无需其它佐剂，成本小，可以直接压成片剂，有望实现产业化。

本发明提供的金属配合物的制备方法关键在于利用纤维素或其衍生物的天然水溶性且对骨骼生长起促进作用，合成了高生物利用度的纳米纤维素金属补充剂。经试验本发明可广泛应用于大多数纤维素的功能化，利用简单的化学修饰，合成金属配合物，大大简化了反应流程，条件温和，步骤简单，实验周期短，产物溶解性好，生物利用度高。另外，材料制备无需其它佐剂，成本小，具有较高的经济价值，易实现产业化。

附图说明

图1(A)为化合物1、2、3和4的红外光谱；图1(B)为化合物3和4的N1s的高分辨XPS光谱；图1(C)为化合物3和4的O1s的高分辨XPS光谱；图1(D)为CaCMC水凝胶照片，图1(E)为经NaCl处理的CaCMC溶液照片；图1(F)为CaCMC气凝胶冷冻干燥后的照片；图1(G)为NaCl处理CaCMC溶液后形成粉末的照片。

图2为化合物1、2、3和4的XPS图谱。

图3(A)为CaCMC的SEM，图3(B-E)元素分布图像。

图4(A)为CaCMC和CaCl₂在pH 2～8范围内测定的钙溶解度；图4(B)为模拟胃肠道消化环境下CaCMC和CaCl₂测定的钙溶解度。

图5为CaCMC在HeLa和NIH3T3细胞中的毒性分析结果图。

图6为CaCMC小鼠体内骨质疏松症的治疗效果图，其中图6(A)为小鼠体重的计量学统计结果；图6(B)股骨长度的计量学统计结果；图6(C)股骨重量的计量学统计结果。

图7(A)为股骨钙含量测定结果图；图7(B)为股骨外侧骨密度测定结果图；图7(C-G)为大鼠股骨组织形态学结果图；图7(H-L)为大鼠股骨微CT三维图像。其中(C、H)为对照组，(D、I)为模型组，(E、J)为CaCO₃组(61.8mg/kg)，(F、K)为低剂量CaCMC组(30.9mg/kg)，(G、L)为高剂量CaCMC组(61.8mg/kg)。

图8为血清中ALP活性检测结果图。

图9(A)为血清中ALT含量检测结果图，图9(B)为血清中AST含量检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

实施例1：一种Ca²⁺金属配合物(CaCMC)

1、羧甲基纤维素(CMC-COOH)的制备

将1g羧甲基纤维素钠悬浮在100mL蒸馏水中，然后注入0.5mL浓盐酸。悬浮液在25℃下搅拌48小时。将功能化的CMC用水透析，得到羧甲基纤维素(CMC-COOH)。

2、CaCMC的制备

在50ml DMF中分别加入100mg CMC-COOH,12.2mg 2，6-二甲基吡啶-4-胺和24.7mgEEDQ，混合搅拌72h。继续添加31.6mg KMnO₄持续搅拌48h，然后用盐酸酸化。将混合物离心，沉淀溶于水中，加入20mg碳酸钙。用透析法纯化得到的CaCMC，总收率为30-45wt％。CaCMC的合成路径如下所示。

3、合成的CaCMC的表征

合成的化合物2、3和4分别由红外光谱和x射线光电子能谱(XPS)证实。

化合物1、2、3和4(CaCMC配合物)的红外光谱结果如图1(A)所示。对于化合物2，在1736cm^-1左右的出现带属于C＝O基团，表明在CMC表面形成了酰胺键。CaCMC配合物形成后，1632^-1和1375cm^-1处的强吸收峰归因于-COO-的反对称和对称伸缩振动的吸收峰。此外，还分别观察到Ca-O在669cm^-1处和Ca-N伸缩振动模式在469cm^-1处的吸光度峰。

化合物1、2、3和4(CaCMC配合物)的XPS结果如图2所示，化合物2和4(CaCMC配合物)分别展示了C、O、N元素和C、O、N、Ca元素。如图1(B)所示，CaCMC的形成使得N1s从400.01eV向上移动到400.15eV，说明N原子与Ca²⁺配合。如图1(C)所示，由于钙和氧的配合，O1s从533eV移动到532.4。

CaCMC复合材料很容易形成凝胶(图1D和F)，但加入NaCl后，CaCMC复合溶液很容易转化成溶液(图1E)，并且冻干后容易形成粉末(图1G)，简化了与食品的混合和运输过程。这些结果表明，通过简单的化学反应生成的CaCMC配合物可以很容易地以液体、凝胶或粉末的形式进行处理。

用冷冻干燥法处理样品，用扫描电镜(SEM)观察干燥的CaCMC样品形貌。图3(A)显示，CMC气凝胶和相应的CaCMC复合气凝胶呈现片状结构，图3(B-E)显示CaCMC复合体中存在Ca、O、N和C元素。

4、钙溶解度测定

将10μg/ml CaCMC和CaCl₂分别溶解在去离子水中，pH值分别调整为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。在37℃孵育2h，10000g离心10分钟。用ICP测定上清液中的总钙含量，结果如图4所示。

结果显示，图4(A)为不同pH值下CaCMC和CaCl₂在去离子水中的钙溶解度。这两种钙试剂的溶解度随pH值的增加而降低，但在任何pH值下，CaCMC的溶解度明显高于CaCl₂。在pH 2～8范围内，CaCMC的溶解度相对稳定，保持在93％以上，而CaCl₂的溶解度从pH＝2时的94％下降到pH＝8时的78％。图4(B)显示，CaCMC和CaCl₂的钙溶解度在胃消化(pH＝2)和肠道消化(pH＝7.5)过程中均保持在84％以上，而且CaCMC的钙溶解度高于CaCl₂的钙溶解度。这些结果清楚地表明，CaCMC配合物在不同体系中均具有较高的溶解度。

5、CaCMC的细胞相容性测试

HeLa和NIH3T3细胞在含有10％(v/v)胎牛血清、5％CO₂的DMEM培养基中37℃条件下培养。通过CCK-8法检测CaCMC配合物的体外细胞毒性。CaCMC悬浮于PBS溶液中，随后加入HeLa和NIH3T3细胞悬液。CMC终浓度为50μg mL^-1。将混合液接种至96孔板，每个孔接种5*10³个细胞，培养48小时。随后，在每个孔中注射10μL的CCK-8细胞，在37℃、5％CO₂下孵化两小时。使用酶标仪测量培养液在450nm处的光密度。

结果如图5显示，CaCMC配合物的浓度高达50μg mL^-1时，HeLa和NIH3T3细胞的存活率均高于90％，表明CaCMC配合物具有很低的细胞毒性。

6、构建动物模型

选取50只体重约16-20克的雌性c57小鼠，随机分为正常组、模型组、阳性组和低剂量药物组和高剂量药物组。除正常对照组外，其他组每天一次服用80mg/kg维甲酸诱导骨质疏松症。建模后，阳性组和药物组给予相关药物进行灌胃，正常和模型组给予生理盐水灌胃，一天一次，连续14天。

7、CaCMC小鼠体内骨质疏松症的治疗效果

分离股骨，清除软组织，进行组织形态学分析。股骨在60℃干燥24小时。

在研究期间，每日测量小鼠体重、股骨长度、股骨重量。

结果如图6所示，与对照组相比，模型组的小鼠体重明显减轻，股骨湿重、干重和股骨长度也有所下降。这说明模型小鼠的骨生长受到明显抑制。分别给予CaCO₃、低剂量CaCMC和高剂量CaCMC后，小鼠体重、股骨湿重、干重和股骨长度均明显增加，与CaCO₃钙含量相同的高剂量CaCMC效果最为明显。这些结果表明，CaCMC可以改善维甲酸引起的骨生长缓慢，使骨生长趋于正常，从而在骨质疏松症的治疗中发挥作用。

8、骨钙含量测定

选取各组小鼠左股骨测定骨钙含量。所有股骨被干燥至恒重。加入硝酸和高氯酸(8:1)，加热使其无色透明。用氯化钡稀释后，用原子吸收光谱法测定钙的含量。

结果如图7(A)所示，与对照组相比，CaCO₃组、低剂量CaCMC组和高剂量CaCMC组的钙含量均有显著提高。此外，高剂量CaCMC组的钙含量高于其他组。

骨密度(BMD)是衡量骨质量的重要指标之一。它已成为骨质疏松症临床诊断的重要手段之一。如图7(B)所示，模型组股骨骨密度与对照组无明显差异。高剂量CaCMC组小鼠的骨密度高于CaCO₃组。以上结果表明，CaCMC具有较高的生物活性和生物利用度。

9、骨组织形态学分析

采用苏木精-伊红(H&E)染色对各组小鼠股骨进行骨组织形态学分析。骨样本在4％福尔马林中固定24小时，然后用10％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脱钙2周。之后，将骨头样本切碎并包埋在石蜡中，切片，染色，在彩色光学显微镜下观察组织形态。

结果如图7(C-G)所示，模型组骨小梁稀疏薄，与对照组相比连通性缺失。而CaCO₃、低剂量CaCMC和高剂量CaCMC处理后小梁较宽，网状结构较明显。

10、股骨微断层扫描(Micro-CT)

将小鼠股骨用4％PFA固定24小时，用x射线断层扫描机扫描。用NRecon软件(Bruker micro-CT)将扫描结果重构为二维模型。然后，通过CTAn软件(Bruker micro-CT)分析骨质密度等特征，用CTvol软件(Bruker micro-CT)构建三维模型，分析股骨的微结构。

股骨微断层扫描的三维图像如图7(H-L)所示，与对照组相比，模型组小鼠骨微结构发生明显变化。对照组中，能观察到致密的松质骨和较粗的骨小梁。模型组中松质骨比较疏松，骨小梁偏小。结果表明，CaCMC和CaCO₃治疗组能有效抑制骨质疏松，使骨结构致密。高剂量CaCMC治疗骨质疏松效果最好。

11、血清中Ca含量和ALP活性测定。

ALP是成骨细胞分化的特异性标志物之一。ALP活性的变化可以反映成骨细胞的增殖程度。在最后一次给药24小时后，从小鼠体内提取血清样本。由于无色对硝基苯基磷酸酯(pNPP)在碱性条件和酸性条件下，与碱性磷酸酯(ALP)反应都能变为黄色，因此，通过对pNPP的比色分析可以评价ALP的酶活性。分别在400-415nm的碱性和酸性条件下测定血清样品的吸光度，检测其酶活性。同时检测血清中ALT、AST含量。

对小鼠血清中的ALP活性的检测结果如图8所示，与模型组相比，CaCO₃、低剂量CaCMC组和高剂量CaCMC组的小鼠血清ALP活性明显升高。

对小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的表达水平的检测结果如图9所示，模型组血清ALT、AST水平明显高于对照组，说明模型的制备对肝功能有影响。然而，与模型组相比，给予CaCO₃、低剂量和高剂量的CaCMC后，ALT和AST水平并没有显著变化，说明这些钙试剂并没有影响肝脏的正常代谢。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不对本发明构成任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性的词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可以扩展至其它所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (23)

1.一种金属配合物，其包括式I所示的结构单元：

式I中，

R₁和R₂相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、硝基、氰基、氨基、单-C₁-C₆烷基取代的氨基和双-C₁-C₆烷基取代的氨基；

R₃和R₄相同或不同，各自独立地选自氢、C₁-C₆烷基和一个或多个羟基取代的C₁-C₆烷基；

W为-(CH₂)_n-，其中n为1-6；

M为金属离子，并且选自钙离子、镁离子、锌离子和亚铁离子。

2.根据权利要求1所述的金属配合物，其特征在于，所述-(CH₂)_n-中，n为1、2或3。

3.一种金属配合物的制备方法，包括步骤S4：使具有式II所示的结构单元的纤维素或其衍生物与金属盐反应，生成具有式I所示的结构单元的金属配合物，

其中，R₁和R₂相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、硝基、氰基、氨基、单-C₁-C₆烷基取代的氨基和双-C₁-C₆烷基取代的氨基；

R₃和R₄相同或不同，各自独立地选自氢、C₁-C₆烷基和一个或多个羟基取代的C₁-C₆烷基；

W为-(CH₂)_n-，其中n为1-6；

M为金属离子，并且选自钙离子、镁离子、锌离子和亚铁离子。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述-(CH₂)_n-中，n为1、2或3。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应在溶剂中进行；和/或所述金属盐选自碳酸盐、碳酸氢盐、硝酸盐、硫酸盐和卤化物中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自水、酮、醇、醚、DMF和DMSO中的一种或多种。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤S3：使具有式III所示的结构单元的纤维素或其衍生物与氧化剂反应，生成具有式II所示的结构单元的纤维素或其衍生物，

其中，R₁和R₂相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、硝基、氰基、氨基、单-C₁-C₆烷基取代的氨基和双-C₁-C₆烷基取代的氨基；

R₃和R₄相同或不同，各自独立地选自氢、C₁-C₆烷基和一个或多个羟基取代的C₁-C₆烷基；

R₅和R₆相同或不同，各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基和醛基；

W为-(CH₂)_n-，其中n为1-6。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为高锰酸钾。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，式III中，W为-(CH₂)_n-，其中n为1、2或3。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤S2：使具有式IV所示的结构单元的纤维素或其衍生物与式V所示的化合物反应，生成具有式III所示的结构单元的纤维素或其衍生物，

式IV中，R选自氢、卤素和C₁-C₆烷基；R₃和R₄相同或不同，各自独立地选自氢、C₁-C₆烷基和一个或多个羟基取代的C₁-C₆烷基；W为-(CH₂)_n-，其中n为1-6；

式V中，R₁和R₂相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、硝基、氰基、氨基、单-C₁-C₆烷基取代的氨基和双-C₁-C₆烷基取代的氨基；R₅和R₆相同或不同，各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基和醛基。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，式IV中，W为-(CH₂)_n-，其中n为1、2或3。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述反应在缩合剂和溶剂存在下进行。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述缩合剂选自EEDQ、DCC/DMAP、DIC/DMAP、EDC/HOBt/NMM和HATU/NMM；所述溶剂选自DMF、DMSO、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺。

14.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述反应在酸性条件下进行，所述反应的温度为15-35℃；和/或，所述反应的时间为1-60小时。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述反应的温度为20-28℃。

16.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述反应的时间为10-60小时。

17.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述反应的时间为20-50小时。

18.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述反应的时间为24-96小时；所述反应的温度为15-35℃。

19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述反应的时间为60-80小时。

20.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述反应的温度为20-28℃。

21.一种药物组合物或金属元素补充剂，其包含根据权利要求1或2所述的金属配合物和/或根据权利要求3-20中任一项所述的制备方法制备的金属配合物。

22.根据权利要求21所述的药物组合物或金属元素补充剂，其特征在于，进一步包含药学上可接受的载体。

23.根据权利要求1或2所述的金属配合物和/或根据权利要求3-20中任一项所述的制备方法制备的金属配合物在制备用于治疗金属元素缺乏导致的疾病的药物中的应用。

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