CN109811026B - 一种胶原蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胶原蛋白的提取方法，涉及胶原蛋白提取领域，包括以下步骤：（1）原料预处理：将深海鱼的鱼鳞和鱼皮按比例混合均匀，用清水清洗干净，沥干后放入组织捣碎机中搅碎；（2）胶原蛋白提取：在捣碎的组织中加入蒸馏水，并加入混合酶进行酶解，然后灭酶，得到胶原蛋白粗提液；（3）脱除重金属；利用酵母菌发酵法脱除提取液中的重金属；（4）成品：离心取上清液，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量为2000‑6000Da范围内的胶原蛋白，冷冻干燥即制得成品。本发明制备方法简单，有效去除深海鱼中的重金属物质，制备得到的胶原蛋白易被人体吸收，应用于保健食品中具有美容功效。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白提取领域，具体涉及一种胶原蛋白的提取方法。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，是一类蛋白质家族，已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子。胶原蛋白是皮肤主要成分，皮肤中胶原蛋白占72%，真皮中80%是胶原蛋白，胶原蛋白在皮肤中构成了一张细密的弹力网，锁住水分,支撑着皮肤。胶原蛋白的流失，导致支撑皮肤的弹力网断裂，皮肤组织萎缩、塌陷，肌肤就会显现干燥、粗糙、松弛、皱纹、毛孔粗大、暗淡、色斑等衰老现象。
目前，胶原蛋白的提取原料主要来源于动物结缔组织、水产动物皮、骨、鳞中。由于氨基酸组成和交联度等方面的差异，使得水产动物尤其是其加工废弃物-皮、骨、鳞中所含有的丰富的胶原蛋白具有很多牲畜胶原蛋白所没有的优点，另外来源于海洋动物的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白，比如具有低抗原性、低过敏性等特性。因此水产胶原蛋白可能逐步替代陆生动物胶原蛋白。
然而近年来，重金属污染对生态环境造成了巨大危害，同时也影响了鱼类的生长。重金属是常见的水体污染物，它富集性较强，且不易被分解，水体中的重金属被摄取后无法经自身代谢被排出体外，在鱼类的各组织器官聚集，这些重金属里面毒性较大的是汞、铅等，汞可以通过食物链在水生生物体内一步步富集，甲基汞能穿透细胞膜，吸收后的甲基汞能够顺利通过血脑屏障，蓄积在脑组织中，逐渐引起脑功能受损，造成感觉、视觉、听觉等障碍。并且，汞还能产生肾脏毒性，引起免疫功能异常，生殖能力下降以及肝脏损害等多系统毒性。因此，去除深海鱼胶原蛋白中的重金属，具有重要意义。
因此，本发明提供了一种胶原蛋白的提取方法，该方法简单，有效去除深海鱼中的重金属物质，制备得到的胶原蛋白易被人体吸收，应用于保健食品中具有美容功效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶原蛋白的提取方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：
（1）原料预处理：将深海鱼的鱼鳞和鱼皮按比例混合均匀，用清水清洗干净，沥干后放入组织捣碎机中搅碎；
（2）胶原蛋白提取：在捣碎的组织中加入蒸馏水，并加入混合酶进行酶解，然后灭酶，得到胶原蛋白粗提液；
（3）脱除重金属；利用酵母菌发酵法脱除提取液中的重金属；
（4）成品：离心取上清液，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量为2000-6000Da范围内的胶原蛋白，冷冻干燥即制得成品。
步骤（1）所述深海鱼包括带鱼、鳕鱼、鲷鱼中的一种。
步骤（1）所述鱼鳞和鱼皮按质量比1:10-15混合均匀。
步骤（2）所述蒸馏水的加入量为捣碎组织质量的10-18倍。
步骤（2）所述混合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比1:2-4混合，所述酶的加入总质量为鱼鳞鱼皮总质量的1-2%。
步骤（3）所述酵母菌发酵法具体包括以下步骤：
1）在胶原蛋白粗提液中加入质量分数0.1-1%的活性干酵母，混合均匀；
2）控制搅拌速度150-180r/min，在28-32℃条件下，培养16-24h；
3）转移至10℃，静置冷藏2-6h后取出备用。
进一步地，将上述提取方法制备得到的胶原蛋白应用于保健食品中。
本发明的优点在于：
（1）本发明提取原料为深海鱼皮、鱼鳞，属于加工废弃物，成本低。
（2）采用鱼皮、鱼鳞为原料制备胶原蛋白，相比于畜禽源动物组织，工艺简单，省去了复杂的预处理步骤，简化提取流程，降低成本。
（3）由于氨基酸组成和交联度等方面的差异，使得水产动物尤其是其加工废弃物-皮、骨、鳞中所含有的丰富的胶原蛋白具有很多牲畜胶原蛋白所没有的优点，另外来源于海洋动物的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白，比如具有低抗原性、低过敏性等特性。
（4）本发明针对深海鱼类重金属含量高的问题，利用酵母菌发酵法去除酶解液中的重金属物质，并且酵母菌代谢产物还可产生多种风味物质以及活性物质，应用于食品中可使其拥有较好的风味和特殊的保健功效。
具体实施方式
实施例1
一种胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料预处理：将带鱼的鱼鳞和鱼皮按质量比1:10混合均匀，用清水清洗干净，沥干后放入组织捣碎机中搅碎。
（2）胶原蛋白提取：在捣碎的组织中加入10倍质量的蒸馏水，并加入混合酶进行酶解，然后灭酶，得到胶原蛋白粗提液；所述混合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比1:2混合，所述酶的加入总质量为鱼鳞鱼皮总质量的2%。
（3）脱除重金属；利用酵母菌发酵法脱除提取液中的重金属，包括以下步骤：
1）在胶原蛋白粗提液中加入质量分数0.1%的活性干酵母，混合均匀；
2）控制搅拌速度180r/min，在28-32℃条件下，培养24h；
3）转移至10℃，静置冷藏2h后取出备用。
（4）成品：离心取上清液，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量为2000-6000Da范围内的胶原蛋白，冷冻干燥即制得成品，测得提取率为65.4%。
实施例2
一种胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料预处理：将鳕鱼的鱼鳞和鱼皮按质量比1:12混合均匀，用清水清洗干净，沥干后放入组织捣碎机中搅碎。
（2）胶原蛋白提取：在捣碎的组织中加入15倍质量的蒸馏水，并加入混合酶进行酶解，然后灭酶，得到胶原蛋白粗提液；所述混合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比1:3混合，所述酶的加入总质量为鱼鳞鱼皮总质量的1.5%。
（3）脱除重金属；利用酵母菌发酵法脱除提取液中的重金属，包括以下步骤：
1）在胶原蛋白粗提液中加入质量分数0.5%的活性干酵母，混合均匀；
2）控制搅拌速度170r/min，在28-32℃条件下，培养20h；
3）转移至10℃，静置冷藏4h后取出备用。
（4）成品：离心取上清液，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量为2000-6000Da范围内的胶原蛋白，冷冻干燥即制得成品，测得提取率为70.8%。
实施例3
一种胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料预处理：将鳕鱼的鱼鳞和鱼皮按质量比1:15混合均匀，用清水清洗干净，沥干后放入组织捣碎机中搅碎。
（2）胶原蛋白提取：在捣碎的组织中加入18倍质量的蒸馏水，并加入混合酶进行酶解，然后灭酶，得到胶原蛋白粗提液；所述混合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比1:4混合，所述酶的加入总质量为鱼鳞鱼皮总质量的1%。
（3）脱除重金属；利用酵母菌发酵法脱除提取液中的重金属，包括以下步骤：
1）在胶原蛋白粗提液中加入质量分数1%的活性干酵母，混合均匀；
2）控制搅拌速度150r/min，在28-32℃条件下，培养16h；
3）转移至10℃，静置冷藏6h后取出备用。
（4）成品：离心取上清液，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量为2000-6000Da范围内的胶原蛋白，冷冻干燥即制得成品，测得提取率为68.3%。
对比例
一种胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料预处理：将鳕鱼的鱼鳞和鱼皮按质量比1:15混合均匀，用清水清洗干净，沥干后放入组织捣碎机中搅碎。
（2）胶原蛋白提取：在捣碎的组织中加入18倍质量的蒸馏水，并加入混合酶进行酶解，然后灭酶，得到胶原蛋白粗提液；所述混合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比1:4混合，所述酶的加入总质量为鱼鳞鱼皮总质量的1%。
（3）成品：离心取上清液，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量为2000-6000Da范围内的胶原蛋白，冷冻干燥即制得成品，测得提取率为72.9%。
测定实施例1-3中提取得到的胶原蛋白中重金属离子的含量，参照GB31645-2018标准，结果见表1。
表1
由此可见，本发明与对比例相比，重金属含量显著降低，并且符合国家标准。
应用例
（1）胶原蛋白对小鼠免疫器官指数的影响
SPF雌性小鼠，体重18-22kg，对购买的动物先进行三天适应性喂养，然后随机分成4组，试验组给1.0g/kg的实施例1-3制备得到的胶原蛋白粉末用蒸馏水溶解后口服，对照组口服相同剂量的蒸馏水，每日灌胃两次，连续灌胃30d后称量体重，颈椎脱臼处死，解剖动物，摘取胸腺、脾脏两处免疫器官，用滤纸吸干表面血迹，立刻用电子天平称重，记录数据并用公式计算胸腺指数和脾脏指数：
胸腺指数=胸腺重量（mg）/体重（g）×100%；
脾脏指数=脾脏重量（mg）/体重（g）×100%。
试验结果见表2。
表2胶原蛋白对小鼠免疫器官指数的影响
结果显示，与对照组相比，实施例1-3的试验组的脾脏指数和胸腺指数与对照组比较有显著提高，说明本发明制备得到的胶原蛋白具有显著提高免疫力的功效。
（2）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
SPF雌性小鼠，体重18-22kg，对购买的动物先进行三天适应性喂养，然后随机分成4组，试验组给1.0g/kg的实施例1-3制备得到的胶原蛋白粉末用蒸馏水溶解后口服，对照组口服相同剂量的蒸馏水，每日灌胃两次，连续灌胃30d后取每只小鼠腹腔内注射20%鸡红细胞悬液1mL。30min后，颈椎脱臼处死，解剖动物，固定在蜡板上，经腹腔注入2mL生理盐水，使生理盐水和腹腔液混合均匀，然后取出1mL，平均分滴于2片载玻片上，37℃孵育30min。然后取出载玻片，在生理盐水中漂洗以出去未贴片的细胞，晾干后，以1:1丙酮甲醇固定20min，Giemsa染液染色3min，再用蒸馏水漂洗后晾干，在显微镜下计数巨噬细胞，计算吞噬率，计算公式如下：
吞噬率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/计数的巨噬细胞×100%，结果见表3。
表3
由表3可知，与对照组相比，试验组小鼠可显著提高巨噬细胞吞噬率，有显著增强免疫效果的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种鱼鳞鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料预处理：将深海鱼的鱼鳞和鱼皮按比例混合均匀，用清水清洗干净，沥干后放入组织捣碎机中搅碎；
（2）胶原蛋白提取：在捣碎的组织中加入蒸馏水，并加入混合酶进行酶解，然后灭酶，得到胶原蛋白粗提液；
（3）脱除重金属；利用酵母菌发酵法脱除提取液中的重金属；
（4）成品：离心取上清液，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量为2000-6000Da范围内的胶原蛋白，冷冻干燥即制得成品；
步骤（1）所述深海鱼包括带鱼、鳕鱼、鲷鱼中的一种；
步骤（1）所述鱼鳞和鱼皮按质量比1:10-15混合均匀；
步骤（2）所述蒸馏水的加入量为捣碎组织质量的10-18倍；
步骤（2）所述混合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比1:2-4混合，所述酶的加入总质量为鱼鳞鱼皮总质量的1-2%；
步骤（3）所述酵母菌发酵法具体包括以下步骤：
1）在胶原蛋白粗提液中加入质量分数0.1-1%的活性干酵母，混合均匀；
2）控制搅拌速度150-180r/min，在28-32℃条件下，培养16-24h；
3）转移至10℃，静置冷藏2-6h后取出备用。
2.一种如权利要求1所述方法制备得到的胶原蛋白在保健食品中的应用。
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