CN101302251B - 霞水母来源有免疫增强活性的糖蛋白及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属天然生物活性物质领域，具体涉及一种霞水母来源的具有免疫增强活性的糖蛋白及其制备工艺和应用。它提供了一种新型的天然海洋生物活性糖蛋白，该霞水母来源的糖蛋白为淡黄至棕色，无嗅，略带苦味的粉末，自霞水母科海洋生物白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、发形霞水母(Cyaneacapillata)、棕色霞水母(Cyanea ferruginea Eschscholtz)或紫色霞水母(Cyanea purpurea Kishinouye)的新鲜捕捞品或其经过三矾腌制的腌制品中分离提取得到。其中含有40～50％的蛋白质，50～60％的糖，平均分子量在30,000左右。所含单糖以核糖为主。所含氨基酸中组氨酸占9％以上，苏氨酸占12％以上，缬氨酸7.51％以上，精氨酸8％以上。该糖蛋白应用于制备具有免疫增强功能的药品、保健品或护肤美容用品，效果显著，无明显毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种霞水母来源的具有免疫增强活性的糖蛋白及其制备工艺和应用，属天然生物活性物质领域。
背景技术
霞水母(Cyanea nozakii)，俗称麻蜇，是一种大型海洋浮游生物，属刺胞动物门(Phylum Cnidaria)，钵水母纲(Class Scyphomedusae)，旗口水母目(Order Phylum cnidaria)，霞水母科(Family Cyanea)。我国沿海已发现的有白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、发形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferrugineaEschscholtz)，和紫色霞水母(Cyanea purpurea Kishinouye)4个种，其中以白色霞水母数量最多、分布范围最广。霞水母通常以小型浮游动物为饵，其生殖腺发达，繁殖能力强，生长速度极快，在繁殖、生长过程中分泌大量毒素，造成大片海域海水遭受严重污染，致使大量的海洋生物、微生物死亡，成为近十年来我国东南沿海海域的一个十分突出的海洋生态问题。目前我国霞水母的年产量已经高达千万吨，构成了一种新的天然海洋生物资源。
海洋来源的多糖、蛋白聚糖和糖蛋白是十分重要的天然海洋药物与保健食品资源，常常具有显著的生物活性，如海参多糖、海藻多糖等均有许多的研究报道，证实其具有显著的多种生物活性。以霞水母为原料，从中分离提取制备糖蛋白的研究报道国内外尚很少见，迄今未见有从中分离提取具有免疫增强活性的糖蛋白的报道。
发明内容
本发明发明了一种霞水母来源的具有免疫增强活性的糖蛋白及制备工艺和用途。较为独特的是，它以一种新型的天然海洋生物资源-霞水母(Cyanea nozakii)-作为糖蛋白的制备原料进行加工，实现了对霞水母进行开发利用的目的。按照本发明进行操作，能够以极高的产率获得高纯度糖蛋白产品。这对于霞水母这一天然海洋生物资源的综合利用而言是至关重要的。
本发明发明的霞水母活性糖蛋白经初步的研究确认，基本无毒，具有显著的免疫增强活性，将作为新型的生物活性材料和保健食品原料被广泛应用于食品、美容保健品和医药用品等领域。
具体来说，首先，我们发现新鲜的或经过三矾腌制处理的市售麻蜇可以在经过脱盐处理之后用作糖蛋白的制备原料。其中所含的糖蛋白对水浸泡处理是稳定的，在我们所采取的浸泡工艺条件下，既不会因受到浸泡而被降解、被提取到水中流失，也不会因受过浸泡而影响其在后续的水解处理中的分散性，即经过三矾腌制处理的市售麻蜇与刚捕捞上岸的新鲜的霞水母具有同等的可加工性，均可用作制备高纯度高生物活性糖蛋白的原料。由此奠定了以霞水母为原料加工制备高纯度高生物活性糖蛋白的基础。
其次，在对pH、温度、压力等溶融和酶解条件以及氢氧化钠、盐酸、胶原蛋白酶等各种常用的溶融剂进行了系统的考察和对比后，我们发现，在适当的溶融条件下，霞水母中所含有的糖蛋白以及胶原蛋白不经过变性处理，便可直接被溶融，分散到水中，得到澄清透明，所含杂质很少的高纯度分散液。这种分散液经过酶解处理可有效的使其中所含的糖蛋白与胶原蛋白相分离。
我们发现，在浸泡pH、浸泡压力、浸泡时间、溶融(酶解)剂等水解工艺参数中，溶融(酶解)剂的种类和溶融(酶解)时所采用的温度对于得率而言是最为重要的。其中，有效的溶融剂为盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲酸、醋酸、苹果酸、乳酸或柠檬酸。当选用盐酸为溶融剂时，pH值应当在0.5-6.8范围之内，最好是在2～4的范围之内；有效的酶解剂为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原蛋白酶或弹性蛋白酶，或它们中的若干种的组合。酶解时，pH值应当在所选酶的最适pH范围之内。当选用盐酸为溶融剂时，溶融温度应当在0～120℃范围内，最好是在0～60℃的范围内，当选用胰蛋白酶为酶解剂时，应当在胰蛋白酶的最适温度下进行溶融。
其他各项参数，浸泡应在pH调节为2-12范围内某一定值，最好是在6.5～6.8，的水中进行，浸泡温度在0～98℃范围内，最好是在0～15℃的范围内，浸泡操作进行至浸泡水的电导率低于30μScm-1停止。离心分离在0～120℃，最好是在0～10℃条件下进行，离心机的转速在4000～12000rpm之间，最好是在6000～8000rpm之间，离心时间为10～60min。脱盐可以用透析的方式进行，亦可用恒容超滤的方式进行。当以透析的方式进行时，透析在pH 3.5～10.5，温度0～120℃，最好是低于或接近室温，操作压力0.0001～0.5MPa，最好是常压的条件下进行，透析操作进行至透析液的电导率低于30μScm-1停止；当以恒容超滤的方式进行时，超滤在pH 5.5～7.5，温度0～120℃，最好是0～20℃，操作压力0.15～3.5MPa，最好是0.3～1.5MPa的条件下进行，超滤操作进行至透过液的电导率低于30μScm-1停止。去除游离蛋白质的操作按照Sevage法进行，即按液体体积的1/5的量加入氯仿，然后按氯仿体积的1/5的量加入正丁醇，混合振荡20min，静置分层，将下层的凝胶状物质除去，收集上层清液，反复操作8-12次至下层的氯仿-正丁醇层不浑浊为止。干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例一
取1000g三矾腌制处理的市售麻蜇，沥水后，室温下浸没于2-5倍量的去离子水中浸泡，并每2-3小时换一次水，直至浸泡水中氯化钠的含量低于1.5ppm(氯离子检测呈阴性)，浸泡水的电导率低于30μScm-1为止。浸泡后的脱盐霞水母用柠檬酸将其pH调节至2.5-3.5，在30-60℃下保温融溶20-48小时，得到一澄清透明的粘性液体。然后用6molL-1NaOH溶液将粘性液体的pH调节至胰蛋白酶的最适pH，加入5g胰蛋白酶(市售，活力为4000unit)，在该酶的最适温度下保温处理8-16小时，然后在4℃，8000rpm下离心30min。弃去不溶性残渣，得到上清液。按其体积的1/5的量加入氯仿，然后按氯仿体积的1/5的量加入正丁醇，混合后振荡20min。用分液漏斗将其凝胶状物质除去，收集上层清液，反复操作8-12次至下层的氯仿-正丁醇层不浑浊为止，得到澄清的水相液。然后将水相液装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次，至透析液的电导率低于30μScm-1为止。透析后，向透析液中加入3倍体积95％乙醇，置4℃冰箱过夜，次日在4℃，8000rpm下离心30min，收集沉淀，即为糖蛋自固液混合物。将沉淀溶解在水中配成5％的溶液，然后冷冻干燥，得到20g纯度达到90％以上的具有显著的免疫增强活性的糖蛋白粉固体。
实例二
取100kg新鲜霞水母，3～10℃下浸没于2-5倍量的去离子水中浸泡，并每2-3小时换一次水，直至浸泡水的电导率低于30μScm-1为止。浸泡后的脱盐霞水母用盐酸将其pH调节至2.5～3.5，在30-60℃下保温融溶20-48小时，得到一澄清透明的粘性液体。然后用6molL-1NaOH溶液将粘性液体的pH调至6.5～6.8，加入500g复合酶制剂(由市售胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶和中性蛋白酶按照1∶1∶1∶1的配比组成)，在35～50℃下保温处理8-16小时，然后在4℃，8000rpm下离心30min。弃去不溶性残渣，收集上清液。按其体积的1/5的量加入氯仿，然后按氯仿体积的1/5的量加入正丁醇，搅拌混合30min，然后静置30min。用吸液管将其底部的凝胶状物质除去，对上层清液重复进行操作3-5次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止，放出氯仿-正丁醇层，得到澄清的水相液。将水相液用6molL-1NaOH调pH至9.0，然后滴加30％的H2O2(用量为溶液体积的8-10％)，室温下反应4h，随后用截流分子量为5000～8000Da的超滤膜在4℃，0.35～1.5MPa下进行恒容超滤脱盐，至透过液的电导率低于30μScm-1为止。然后向保留液中加入3倍体积95％乙醇，4℃下保温放置10～12h，然后在4℃，8000rpm下离心30min，收集沉淀，即为糖蛋白固液混合物。将沉淀用一定量的水调配成30％的悬浮液，然后喷雾干燥，得到1000g纯度达到90％以上的具有显著的免疫增强活性的糖蛋白粉固体。
实例三
对一份糖蛋白粉样品进行了蛋白含量的测定，总糖含量的测定，氨基酸组成的测定以及单糖组成的测定。测定结果表明，该样品中含45.3％的蛋白质，54.7％的糖，平均分子量为30,000Da左右。所含氨基酸的组成见表1，所含单糖的组成见表2。
表1供试样品的氨基酸组成
表2霞水母多糖的单糖组成及相对质量分数
实例四
对一份糖蛋白粉样品进行了SDS-PAGE电泳测定，所得结果见附图。
附图说明：霞水母来源的具有免疫增强活性的糖蛋白的SDS-PAGE电泳图谱
SDS-PAGE电泳结果显示，糖蛋白，那个能够同时被考马斯亮蓝和高碘酸-席夫试剂染色的主条带，的分子量在30kDa左右。
实例五
以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18-22g，由无锡市惠山江南实验动物场提供【批准号：SCXK(苏)2002-0006】)为实验动物，对所得到的糖蛋白粉进行急性毒性试验，所得结果见表3和表4。
通过观察，给药后1h内小鼠活动均减少，4h后逐渐恢复正常活动。试验组2d内进食量有所减少，以后的5d内小鼠食欲、精神、毛色均正常；7d后，脱颈处死，肉眼尸检未见心、肝、脾、肺、肾等主要脏器病变和中毒现象。观察期7d内每天称重，试验组小鼠的体重在给药后2d内下降，说明这2d小鼠的进食量减少，以后的5d内，体重逐渐恢复并不断增加。研究结果表明，在供试样品大剂量灌胃的情况下，未出现小鼠死亡，也未有明显毒性反应。说明其无毒性或毒性很小，其最大安全剂量在7500mg/Kg以上。
实例六
以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18-22g，由无锡市惠山江南实验动物场提供【批准号：SCXK(苏)2002-0006】)为实验动物，对所得到的糖蛋白粉进行免疫增强测试，所得结果见表5～7。
表3供试样品对小鼠体重的影响
表4急性毒性实验结果
1小鼠血清溶血素测定
表5供试样品对小鼠血清溶血素的影响
方差分析，P＜0.05；与对照组比较*P＜0.05
溶血素(IgM)是反映体液免疫功能状况的一种方法，如果用药后溶血素生成增多，则出现红细胞溶血时的吸光度值增高，表明用药后机体的体液免疫作用增强。由表5结果可知，中剂量组和高剂量组与空白对照組比较，差异有显著性(P＜0.05)，低剂量组与对照组比较无差异性(P＞0.05)，这说明，中剂量组和高剂量供试样品对血清溶血素(IgM)的生成都有十分明显的影响，表现出较好的体液免疫增强作用。
2小鼠迟发型超敏反应(DTH)测定
表6供试样品对小鼠迟发型超敏反应的影响
方差分析，P＜0.01；与对照组比较**P＜0.01
迟发型超敏反应是反映细胞免疫功能状况的一种方法，由表6结果可知，低剂量组和中剂量组的小鼠左右耳廓片重量之差与对照组比较均有高度显著性差异(P＜0.01)，高剂量组与对照组比较无差异(P＞0.05)。
表明一定剂量的供试样品能显著提高小鼠细胞免疫功能。
3小鼠吞噬细胞吞噬功能测定
表7供试样品对小鼠吞噬细胞吞噬功能的影响
方差分析，P＜0.01；与对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01
吞噬细胞吞噬功能是反映非特异性免疫功能状况的一种方法，由表7结果可知，各剂量组与对照组比较吞噬指数有高度显著性差异(P＜0.01)，在吞噬百分率方面中剂量组和高剂量组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，说明一定剂量的供试样品能激活吞噬活性，提高单核吞噬细胞系统的吞噬功能。
免疫增强实验结果表明一定剂量的供试样品对小鼠体液免疫功能，细胞免疫功能和单核-巨噬细胞功能都有一定的增强作用。
根据功能学评价检验方法，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。本实验在实验小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能三个方面结果阳性，因此可判定供试样品具有免疫增强作用。
Claims (14)
1.一种霞水母来源的具有免疫增强活性的糖蛋白，其特征在于该糖蛋白是通过如下步骤得到的：
(1)将霞水母用水浸泡；
(2)使用0.1～10molL-1的盐酸或柠檬酸为溶融剂对浸泡后的霞水母进行溶融处理，得到一黄色至棕黄色的粘稠液体；
(3)对所得到的粘稠液体，进行酶解处理，得到一有沉淀形成的悬浮液，其中所述的酶为胰蛋白酶或由胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶及中性蛋白酶按照1∶1∶1∶1的配比组成的复合酶；
(4)对悬浮液进行离心分离，得到黄色至棕黄色的上清液；
(5)对上清液进行脱盐、去除游离蛋白质处理，得到澄清的水相液：
(6)向水相液中加入3倍体积的95％乙醇.然后进行离心分离.收集沉淀，得到一膏状物；
(7)将膏状物直接干燥或经溶解、脱色处理后干燥，得到一淡黄至棕色的粉末，即为糖蛋白。
2.权利要求1所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于该工艺由下列步骤组成：
(1)将霞水母用水浸泡；
(2)使用0.1～10molL-1的盐酸或柠檬酸为溶融剂对浸泡后的霞水母进行溶融处理，得到一黄色至棕黄色的粘稠液体；
(3)对所得到的粘稠液体，进行酶解处理，得到一有沉淀形成的悬浮液，其中所述的酶为胰蛋白酶或由胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶及中性蛋白酶按照1∶1∶1∶1的配比组成的复合酶；
(4)对悬浮液进行离心分离，得到黄色至棕黄色的上清液；
(5)对上清液进行脱盐、去除游离蛋白质处理，得到澄清的水相液：
(6)向水相液中加入3倍体积的95％乙醇.然后进行离心分离.收集沉淀，得到一膏状物；
(7)将膏状物直接干燥或经溶解、脱色处理后干燥，得到一淡黄至棕色的粉末，即为糖蛋白。
3.如权利要求2所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于将霞水母在pH调节为2-12范围内某一定值的水中浸泡至浸泡水的电导率低于30μScm-1为止，浸泡温度在0～98℃范围内。
4.如权利要求2所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的溶融处理指采用溶融剂将霞水母融化于水中形成粘稠液体。
5.如权利要求4所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的溶融处理在pH 0.5～6.8，温度0～120℃，操作压力0.0001～0.5MPa条件下进行。
6.如权利要求2所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的酶解处理指采用特定的酶对霞水母融化在水中形成的粘稠液体的加工过程。
7.如权利要求6所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的酶解处理在pH 5.5～7.5，温度0～120℃，操作压力0.0001～0.5MPa条件下进行。
8.如权利要求2所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的离心分离在温度0～120℃条件下进行，离心机的转速在4000～12000rpm之间，离心时间为10～60min。
9.如权利要求2所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的脱盐为透析脱盐或恒容超滤脱盐。
10.如权利要求9所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的透析脱盐在pH 3.5～10.5，温度0～120℃，操作压力0.0001～0.5MPa条件下进行，透析至透析液的电导率低于30μScm-1为止。
11.如权利要求9所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的恒容超滤脱盐在pH 3.5～10.5，温度0～120℃，操作压力0.15～3.5MPa条件下进行，超滤至透过液的电导率低于30μScm-1为止。
12.如权利要求2所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的去除游离蛋白质处理为Sevage法去除游离蛋白，即按液体体积的1/5的量加入氯仿，然后按氯仿体积的1/5的量加入正丁醇，混合振荡20min，静置分层，将下层的凝胶状物质除去，收集上层清液，反复操作8～12次至下层的氯仿一正丁醇层不浑浊为止。
13.如权利要求2所述的糖蛋白的制备工艺，其特征在于所述的干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
14.权利要求1所述的糖蛋白在具有免疫增强功能的药品、保健品、护肤美容用品的制备中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
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| 聂菲等.发形霞水母毒素分离产物溶血活性的比较及其影响因素分析.《第二军医大学学报》.2008,第29卷(第1期),83-86. * |
| 黄建设等.海洋天然产物及其生理活性的研究进展.《海洋通报》.2001,第20卷(第4期),83-89. * |
Cited By (1)
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