CN101234126A - 霞水母来源具有抗疲劳活性的胶原蛋白肽及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明发明了一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的胶原蛋白活性肽及其制备工艺，属天然生物活性物质及其制备技术领域。它提供了一种新型的天然海洋生物活性肽。按照本发明进行操作，能够获得2％的纯度达到90％以上的胶原蛋白活性肽。这种新型胶原蛋白活性肽完全没有毒副作用，具有显著的抗疲劳活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的胶原蛋白活性肽及其制备工艺，属天然生物活性物质及其制备技术领域。
背景技术
霞水母(Cyanea nozakii)，俗称麻蜇，是一种大型海洋浮游生物，属刺胞动物门(Phylum Cnidaria)，钵水母纲(Class Scyphomedusae)，旗口水母目(Order Phylum cnidaria)，霞水母科(Family Cyanea)。我国沿海已发现的有白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、发形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyaneaferruginea Eschscholtz)，和紫色霞水母(Cyanea purpurea Kishinouye)4个种，其中以白色霞水母数量最多、分布范围最广。霞水母通常以小型浮游动物为饵，其生殖腺发达，繁殖能力强，生长速度极快，目前我国霞水母的年产量已经高达千万吨，构成了一种新的天然海洋生物资源。
海洋来源的多糖、蛋白聚糖和胶原蛋白活性肽是十分重要的天然海洋食品资源，常常具有显著的生物活性，如海参多糖、海藻多糖等均有许多的研究报道，证实其具有显著的生物活性。以霞水母为原料，从中分离提取制备胶原蛋白活性肽的研究国内外尚未见任何报道。
发明内容
本发明发明了一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的胶原蛋白活性肽及其制备工艺。较为独特的是，它以一种新型的天然海洋生物资源-霞水母(Cyanea nozakii)-作为胶原蛋白活性肽的制备原料进行加工，实现了对霞水母进行开发利用的目的。按照本发明进行操作，能够以极高的产率获得高纯度胶原蛋白活性肽产品。这对于霞水母这一天然海洋生物资源的综合利用而言是至关重要的。
本发明发明的霞水母活性胶原蛋白活性肽经初步的研究确认，基本无毒，具有显著的抗疲劳活性，将作为新型的生物活性材料和保健食品原料被广泛应用于食品工业和医药工业。
具体来说，首先，我们发现新鲜的或经过三矾腌制处理的市售麻蜇可以在经过脱盐处理之后用作胶原蛋白活性肽的制备原料。其中所含的胶原蛋白活性肽对水浸泡处理是稳定的，在我们所采取的浸泡工艺条件下，既不会因受到浸泡而被降解、被提取到水中流失，也不会因受过浸泡而影响其在后续的水解处理中的分散性，即经过三矾腌制处理的市售麻蜇与刚捕捞上岸的新鲜的霞水母具有同等的可加工性，均可用作制备高纯度高生物活性胶原蛋白活性肽的原料。由此奠定了以霞水母为原料加工制备高纯度高生物活性胶原蛋白活性肽的基础。
其次，在对温度、压力等水解条件以及氢氧化钠、盐酸、胶原蛋白酶等各种常用的溶融剂进行了系统的考察和对比后，我们发现，在适当的水解条件下，霞水母中所含有的胶原蛋白不经过变性处理，便可直接被水解，分散到水中，得到澄清透明，所含杂质很少的水解分散液。
我们发现，在浸泡溶剂、浸泡时间、水解剂等水解工艺参数中，水解剂的种类和水解时所采用的温度对于水解得率而言是最为重要的。其中，有效的溶融剂为常见的碱(如钠、钾、钙、钡的氢氧化物或碳酸盐、氨水等)、常见的酸(如盐酸、磷酸、硫酸等无机酸或甲酸、醋酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸等有机酸)或各种蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶等)中的一种或若干种。当选用氢氧化钠为溶融剂时，pH值应当在7.0-14.0范围之内，当选用盐酸为溶融剂时，pH值应当在0.5-6.8范围之内，当选用蛋白酶类为溶融剂时，pH值应当在所选酶的最适pH范围之内；当选用酸碱为溶融剂时，水解温度应当在-30-200℃范围内，最好是在0-60℃的范围内，当选用蛋白酶类为溶融剂时，应当在蛋白酶类的最适温度下进行水解。其他各项参数，浸泡脱盐需进行6-15次，每次浸泡所需的用水量为所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡温度在-50-98℃范围内，浸泡时间为0.5-12hr次-1。液体的干燥方式，可以是冷冻干燥，也可以是喷雾干燥。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例一
取1000g三矾腌制处理的市售麻蜇，沥水后，室温下浸没于2-5倍量的去离子水中浸泡，并每2-3小时换一次水，直至浸泡水中氯化钠的含量低于1.5ppm为止(氯离子检测呈阴性)。浸泡后的脱盐霞水母添加活力为4000 Units的胰蛋白酶10g，在30-60℃下保温溶融4-24小时，得到一悬浮液。然后离心(4℃，8000rpm，30min)，弃去不溶性残渣，得到澄清透明的液体，即为胶原蛋白活性肽液；胶原蛋白活性肽液置旋转蒸发仪上，40℃，0.001MPa下浓缩至原体积的1/5后喷雾干燥(进风温度185℃，出风温度85℃)，得到20g纯度达到90％以上的具有显著的抗疲劳活性的胶原蛋白活性肽粉固体。
实例二
取1000g新鲜霞水母，室温下浸没于2-5倍量的去离子水中浸泡，并每2-3小时换一次水，直至浸泡水中氯化钠的含量低于1.5ppm为止(氯离子检测呈阴性)。浸泡后的脱盐霞水母添加活力为4000 Units的胰蛋白酶10g，在30-60℃下保温溶融4-24小时，得到一悬浮液。然后离心(4℃，8000rpm，30min)，弃去不溶性残渣，得到澄清透明的液体，即为胶原蛋白活性肽液；胶原蛋白活性肽液置旋转蒸发仪上，40℃，0.001MPa下浓缩至原体积的1/5后冷冻干燥，得到10g纯度达到95％以上的具有显著的抗疲劳活性的胶原蛋白活性肽粉固体。
实例三
对一份胶原蛋白活性肽粉样品进行了蛋白含量的测定，总糖含量的测定，氨基酸组成的测定以及单糖组成的测定。测定结果表明，该样品中含88％的蛋白质，7.5％的糖，平均分子量为1274。所含单糖以葡萄糖为主，所含氨基酸的组成见表1。
表1 供试样品的氨基酸组成
实例四
以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18-22g，由无锡市惠山江南实验动物场提供【批准号：SCXK(苏)2002-0006】)为实验动物，对所得到的胶原蛋白活性肽粉进行急性毒性试验，所得结果如下：
表2 供试样品对小鼠体重的影响
| 天数/组别 | 空白对照 | 试验组 |
| 1d | 22.806g | 22.667 |
| 2d | 22.985g | 23.075 |
| 3d | 24.300g | 23.635 |
| 4d | 24.688g | 23.766 |
| 5d | 25.146g | 24.566 |
| 6d | 26.084g | 25.066 |
| 7d | 26.180g | 25.966 |
表3急性毒性实验结果
| 组别 | 小鼠数量 | 给药剂量 | 一周体重增长 | 增长率 | 死亡数 |
| 空白对照 | 10 | 0.5ml/只 | 3.374g | 14.79％ | 0 |
| 试验组 | 10 | 7500mg/kg | 3.299g | 14.55％ | 0 |
通过观察，给药后1h内小鼠活动均减少，4h后逐渐恢复正常活动。试验组7d内进食量逐渐增加，且小鼠食欲、精神、毛色均正常；7d后，脱颈处死，肉眼尸检未见心、肝、脾、肺、肾等主要脏器病变和中毒现象。观察期7d内每天称重，试验组小鼠的体重不断增加。研究结果表明，在供试样品大剂量灌胃的情况下，未出现小鼠死亡，也未有明显毒性反应。说明其无毒性或毒性很小，其最大安全剂量在7500mg/Kg以上。
实例五
以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18-22g，由无锡市惠山江南实验动物场提供【批准号：SCXK(苏)2002-0006】)为实验动物，对所得到的胶原蛋白活性肽粉进行抗疲劳保健功能测试，所得结果如下：
1负重游泳实验
表4 供试样品对小鼠负重游泳时间的影响
| 组别 | 给药剂量(mg/kg) | 持续游泳时间(min) |
| 空白对照 | - | 15.25±0.64 |
| 试验组 | 50 | 30.08±1.39＊＊ |
| 100 | 23.02±1.08＊＊ | |
| 200 | 19.35±1.54＊＊ |
方差分析，P＜0.05；与对照组比较＊＊P＜0.01
由表4可知，试验组小鼠的负重(5％)游泳时间均比对照组的延长，且低剂量组、中剂量组、高剂量组与对照组比较，游泳时间的差异具有高度显著性(P＜0.01)，表明供试样品能延长小鼠的负重游泳时间，增强其耐力。并且各剂量组之间差异显著(P＜0.01)。
2 血清尿素氮测定
表5 供试样品对小鼠血清尿素氮的影响
| 组别 | 给药剂量(mg/kg) | 尿素氮含量(m mol/L) |
| 空白对照 | - | 14.503±0.77 |
| 试验组 | 50 | 8.087±0.17＊＊ |
| 200 | 12.997±1.22＊ |
方差分析，P＜0.05；与对照组比较＊P＜0.05；＊＊P＜0.01
由表5可知，试验组的小鼠血清尿素氮含量均低于对照组，其中低剂量组与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，表明水母胶原蛋白活性肽粉能减少或抑制疲劳小鼠血清尿素氮产生。剂量组之间的差异具有高度显著性(P＜0.05)。
3 肝糖元含量测定
表6 供试样品对小鼠肝糖原含量的影响
| 组别 | 给药剂量(mg/kg) | 肝糖元(g/100mg肝) |
| 空白对照 | - | 0.326±0.11 |
| 试验组 | 50 | 1.126±0.23＊＊ |
| 200 | 1.437±0.16＊＊ |
方差分析，P＜0.05；与对照组比较＊＊P＜0.01
由表6可知，试验组小鼠肝糖原含量均高于对照组，且各剂量组与对照组比较，差异有高度显著性(P＜0.01)，表明供试样品具有促进肝糖原储备的作用。
4 血乳酸测定
表7 供试样品对小鼠血乳酸的影响
| 组别 | 运动前(mmol/L) | 游泳10min后(mmol/L) | 游泳10min后20min(mmol/L) | 血乳酸曲线下面积(mmol/L) |
| 空白 | 3.56±0.39 | 9.87±0.12 | 4.63±0.32 | 212.11±3.27 |
| 试验组(50mg/kg) | 2.81±0.53＊ | 8.07±0.47＊＊ | 3.75±0.33＊ | 172.61±9.84＊＊ |
| (100mg/kg) | 2.89±0.17 | 8.17±0.72＊＊ | 3.85±0.56 | 175.51±7.23＊＊ |
| (200mg/kg) | 2.95±0.39 | 8.30±0.60＊＊ | 3.87±0.42 | 177.90±10.78＊＊ |
方差分析，P＜0.05；与对照组比较＊＊P＜0.01，＊P＜0.05
由表7可知，试验组中低剂量组安静时的血乳酸值与对照组有显著差异(P＜0.05)，中剂量组和高剂量组与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。而各剂量组游泳10min后的血乳酸值均明显低于对照组，差异均有显著性(P＜0.01)，低剂量组在游泳10min后20min的乳酸值与对照组相比，差异具有显著性(P＜0.05)。但各剂量组之间差异无显著性(P＞0.05)。各剂量组的乳酸曲线下面积与对照组相比，差异具有高度显著性(P＜0.01)。表明供试样品能降低小鼠运动后血乳酸含量。
抗疲劳实验结果表明水母胶原蛋白活性肽粉能延长小鼠的负重游泳时间，减少或抑制疲劳小鼠血清尿素氮产生，降低小鼠运动后血乳酸含量，促进肝糖原储备的作用。
根据功能学评价检验方法，实验小鼠负重游泳实验结果阳性，血乳酸、血清尿素、肝糖元三项生化指标中任二项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解体力疲劳功能的作用。本实验在实验小鼠负重游泳实验结果阳性基础上，其余三项生化指标均阳性，因此可判定水母胶原蛋白活性肽粉具有缓解体力疲劳功能的作用。
Claims (9)
1. 一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的胶原蛋白活性肽。
2. 如权利要求1所述的胶原蛋白活性肽的制备工艺。该工艺由下列步骤组成：
(1)以水为溶剂对霞水母进行浸泡，脱除原料霞水母中所含有的盐分。
(2)对脱除了盐分的霞水母进行溶融处理，使霞水母消融，得到一无色或淡黄色的液体。
(3)所得到的液体，经过(或不经过)均质、脱色、脱盐处理，然后干燥，得到-白色-浅黄色的粉末，即为胶原蛋白活性肽。
所宣称的霞水母，俗称麻蜇，系指霞水母科海洋生物白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、发形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferruginea Eschscholtz)或紫色霞水母(Cyaneapurpurea Kishinouye)的新鲜捕捞品或其经过三矾腌制的腌制品。
所宣称的溶融处理，系指在一定的pH、温度、压力下，用特定的溶融剂进行的将霞水母融化在水中，形成液体的加工过程。
所宣称的干燥为使液体脱除水分，得到固体的加工过程。
所宣称的胶原蛋白活性肽为自霞水母中分离提取得到的一种产物。它是一种白色或淡黄色粉末，无嗅，略带苦味，其中含有80～90％的蛋白质，10～20％的糖，平均分子量在1,000～3,000之间。该胶原蛋白活性肽无毒，具有显著的抗疲劳生物活性。
3. 权利要求2中宣称的水系指pH调节为某一定值的自来水或去离子水，其pH值在2-12范围之内。
4. 权利要求2中宣称的浸泡，进行6-15次，每次浸泡所需的用水量为所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡温度在-50-98℃范围内，浸泡时间为0.5-12hr次-1。
5. 权利要求2中宣称的溶融处理，其操作pH为0.5-14.0。
6. 权利要求2中宣称的溶融处理，其操作温度为-30-200℃。
7. 权利要求2中宣称的溶融处理，其操作压力为0.0001-0.5MPa。
8. 权利要求2中宣称的溶融处理，可供选用的溶融剂为0.1～10molL-1的碱(如钠、钾、钙、钡的氢氧化物或碳酸盐、氨水等)、0.1～10molL-1的酸(如盐酸、磷酸、硫酸等无机酸或甲酸、醋酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸等有机酸)或各种蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶等)中的一种或若干种。
9. 权利要求2中宣称的干燥，可以是冷冻干燥，也可以是喷雾干燥。
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| WO2009140833A1 (zh) * | 2008-05-20 | 2009-11-26 | 张丽丽 | 霞水母来源有免疫增强活性的胶原蛋白肽及制备和应用 |
| CN103451258A (zh) * | 2013-06-19 | 2013-12-18 | 浙江海洋学院 | 具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺 |
| CN104334572A (zh) * | 2012-07-02 | 2015-02-04 | 诺维信公司 | 具有木聚糖酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸 |
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