CN112998160A - 一种含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于饲料加工技术领域，具体涉及一种含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料及其制备方法。本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料不仅可以提高珍珠龙胆石斑鱼的抗氧化能力、免疫力，还可以抑制珍珠龙胆石斑鱼的脂质积累和改善肝脏结构和肝脏病理损伤程度，而且无毒副作用、对环境友好。同时，该含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料投放到水体中维生素流失率低，可以很好的保持饲料中的维生素含量，保证珍珠龙胆石斑鱼维生素的吸收，更有利于石斑鱼的生长繁殖。

Description

一种含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料及其制备方法
技术领域
本发明属于饲料加工技术领域，具体涉及一种含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料及其制备方法。
背景技术
目前，为了节约饲料中蛋白质含量，常用脂肪来代替蛋白。然而，长时间饲喂脂肪含量高的饲料会造成鱼体生长缓慢、免疫机能下降、发病率升高等危害，并降低水产品质量和饲料转化率，给水产养殖业造成严重经济损失。严重的还会导致脂肪肝。脂肪肝不仅会影响了水产动物的健康生长，而且会大大的降低经济效益，给渔业生产带来巨大的危害。鱼类肝脏疾病已成为世界鱼类可持续发展的主要制约因素之一。因此，对鱼类肝病的研究很重要，不仅要阐明肝病的发病机制，而且要从商业角度进行研究。
肝脏是鱼体内最主要的代谢器官及最大的消化腺。鱼类肝病已成为当前水产养殖中一种常见而危害很大的疾病，引起了广泛的重视。因此，研究具有保肝护肝作用的饲料添加剂，对于水产品质量安全和品质的提升具有重要的现实意义。
植物提取物可以调节鱼类的免疫系统，提高养殖鱼类的抗应激能力和免疫机能。同时，也可以作为饲料添加剂促进鱼体的生长，增强抗病力，提高抗氧化能力。因此，植物提取物作为水产养殖动物的饲料添加剂具有广阔的意义前景。
金柚为芸香科、柑橘属植物，座果率低，幼果由于生理原因凋落为生理落果，同时，为了提高金柚的质量与产量，出于保花保果的目的，也会对金柚果树进行疏花疏果，从而产生了大量废弃的金柚幼果。金柚幼果是一类营养丰富的农业资源，如果不对这些废弃的金柚幼果进行有效的处理，不仅造成资源浪费，而且还会滋生大量病原菌，污染环境。
随着研究的深入，对于金柚幼果的可资源化研究也越来越多。专利文献CN104223122A公开了一种金柚膳食纤维及其制备方法，金柚膳食纤维由均呈粉末状且干燥的金柚粉末组成，所述金柚粉末包括柚皮粉末、柚囊粉末、柚囊衣粉末、柚肉粉末和柚核粉末；制备方法包括清洁柚果、切粒、水解、干燥和粉碎。由于利用整个金柚柚果制备金柚粉末，既包括柚皮粉末和柚囊粉末，又包括柚囊衣粉末、柚肉粉末和柚核粉末；柚果中柚皮、柚囊、柚囊衣、柚肉和柚核的有效营养成分均得以保留，有效营养成分保留全面，柚果利用率高，且由于无需进行柚果的皮肉分离等工序，工艺简便。
专利文献CN109206393A公开了一种金柚幼果黄酮类化合物的提取方法，该方法是以金柚幼果为原料，采用真空冷冻干燥的方法对金柚幼果进行干燥，并以质量分数为55～65％的乙醇为溶剂，采用超声波-微波协同提取的方法对金柚幼果黄酮类化合物进行提取，不仅充分利用了金柚幼果资源，提高了金柚的综合利用价值，同时还有效提高了金柚幼果黄酮类化合物的提取率，有效保护了金柚幼果黄酮类化合物的结构及保持了金柚幼果黄酮类化合物的活性。
石斑鱼，属于鲈形目、鮨科、石斑鱼属，主要分布于热带、亚热带暖水海域，是最重要的海洋鱼类之一。珍珠龙胆石斑鱼是褐点石斑鱼(母本)和鞍带石斑鱼(父本)杂交的一种新兴的海水养殖鱼类新品种，具有生长快速、肉质鲜美、营养价值高、抗病能力强等优点，在我国沿海地区得到了快速发展。但由于养殖规模的扩大，水环境的恶化，疾病防控不足，抗生素等化学物质的滥用，导致石斑鱼肝脏疾病爆发频繁，造成了大量鱼类死亡以及经济损失。因此寻找无污染纯天然无公害饲料添加剂对于石斑鱼的养殖具有重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料及其制备方法，以解决上述缺陷。本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料为珍珠龙胆石斑鱼的配合饲料，本发明创造性的将金柚幼果多糖添加到珍珠龙胆石斑鱼饲料中，研究发现该金柚幼果多糖能增强珍珠龙胆石斑鱼的免疫力、抑制脂质积累、提高抗氧化能力和具有保肝护肝的作用。
本发明提供了一种含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，包括以下成分及其重量份数：
白鱼粉45份、豆粕18份、面粉19.8～20份、啤酒酵母2份、鱼油5份、大豆油5份、大豆卵磷脂1份、氯化胆碱0.5份、维生素C磷酸酯0.5份、磷酸二氢钙1份、维生素和矿物质预混料2份和添加剂0.04～0.08份，所述添加剂为金柚幼果多糖。
进一步地，所述金柚幼果多糖的制备方法为：
S1金柚幼果干燥后制成粉末，按照料液比为1:30加入去离子水，用果胶酶和纤维素酶(2％w/v，pH6.0，50℃)发酵1.5-3h；
S2对步骤S1获取的产物灭酶后，通过超声波破壁萃取；
S3超声破壁萃取后，对萃取液进行离心和浓缩，采用三氯乙酸脱蛋白，用四倍体积的乙醇在4℃条件下沉淀过夜分层，取沉淀；
S4将下层的沉淀溶于去离子水中，并注入DEAE Sepharose Fast Flow，所述DEAESepharose Fast Flow填料先用0.5mol/ml的盐酸浸泡1小时，洗去填料中的杂质物，用4～5倍体积的蒸馏水洗脱至中性，调整流速为5ml/min，蒸馏水平衡2h，用蒸馏水溶解1g的粗多糖，加热，斡旋，12000rpm离心，取上清液上样，调整流速为15ml/min的蒸馏水进行洗脱，三组溶剂洗脱，三倍柱体积的水、0.2M NaCl、0.5M NaCl、2.0M NaCl洗，苯酚硫酸法进行追踪检测，酶标仪490nm进行检测，根据峰形，分别收集，浓缩，3500Da透析袋透析，冷冻干燥，
S5将馏分(1mg/mL)应用于SephadexG-200柱上进行纯化，HPGPC测定多糖分子量和纯度，收集特定分子量的目的金柚幼果多糖，所述目的金柚幼果多糖的分子量图谱数据为RT-34.356min，lgMp-5.4，lgMw-5.6，lgMn-5.3，Mp-271395，Mw-383912，Mn-220069。
进一步地，所述维生素和矿物质预混料的前处理步骤为：
将金柚幼果多糖加入温度为55～65℃的饮用水中搅拌均匀，得胶体溶液，冷却，接着将胶体溶液加入到维生素和矿物质预混料中搅拌均匀，所述金柚幼果多糖为权利要求2制得。
进一步地，所述胶体溶液的添加重量是维生素和矿物质预混料总重量的8～15％。
进一步地，所述胶体溶液的添加重量是维生素和矿物质预混料总重量的10～12％。
进一步地，所述添加剂还包括茶黄素。
进一步地，所述添加剂中金柚幼果多糖与茶黄素的质量比为1:(0.1～0.4)。
进一步地，所述添加剂中金柚幼果多糖与茶黄素的质量比为1:0.2。
另外，本发明还提供了所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料的制备方法，包括以下步骤：
将所用原料粉碎过筛；先取白鱼粉、豆粕、面粉混合，搅拌均匀后加入啤酒酵母、维生素和矿物质预混料、氯化胆碱、维生素C磷酸酯、磷酸二氢钙和添加剂，搅拌均匀后加入鱼油、大豆油和大豆卵磷脂，搅拌均匀，得混合料；接着加入水充分混合，所述水的添加量是混合料总质量的30％，制成颗粒料，晾干，即得。
本发明提供的金柚幼果多糖金柚幼果提取物作为石斑鱼饲料添加剂的应用；金柚幼果提取物作为饲料添加剂，能增强石斑鱼免疫力、抑制脂质积累、提高抗氧化能力和具有保肝护肝的作用。
具体地，金柚幼果提取物是添加到珍珠龙胆石斑鱼基础饲料中，根据生长性能，其适宜添加量是基础饲料质量的0.04～0.08％。添加量过高会影响珍珠龙胆石斑鱼的肝细胞结构、抗氧化能力、脂代谢和免疫功能，添加量过低则达不到效果。
本发明人主要是研究金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼的免疫力、抗氧化和保肝作用，目前对于这方面的研究已有很多成果，同时也阐明金柚幼果多糖对鱼类肝脏可能的保护机制，发明人采用超声辅助酶法提取出金柚幼果多糖，并对其结构进行表征，在动物水平建立由高脂饲料诱导的脂肪肝模型，也探讨出了金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼肝脏病理组织形态、抗氧化活性、脂质积累和免疫功能的影响。为了进一步验证金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼的保护作用，发明人在细胞水平建立珍珠龙胆石斑鱼原代肝细胞脂肪变性模型，加入金柚幼果多糖干预后，检测肝细胞的增殖、凋亡、抗氧化、脂质积累、免疫炎症情况，探讨出金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼肝细胞脂肪沉积的保护作用及分子机制。
本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料是在已有的研究成果进行进一步的研究和创新。发明人在实践过程发现，对珍珠龙胆石斑鱼进行饲料投喂时，饲料中的维生素和矿物质预混料内的维生素遇水容易流失，导致珍珠龙胆石斑鱼的维生素吸收不足，对珍珠龙胆石斑鱼的生长发育影响较大。
发明人一直致力于研究减少珍珠龙胆石斑鱼饲料中维生素遇水流失率的问题，但是不想另外添加其他保护剂，引入太多其他物质也不利于珍珠龙胆石斑鱼的生长发育。发明人首次提出将从金柚幼果提取出来的多糖对维生素和矿物质预混料进行包裹处理，发现可以其降低维生素和矿物质预混料中维生素的流失率问题，但是降低效果不明显，而且尝试了多种从金柚幼果中提取的结构不同的多糖，其效果也明显。经过大量的摸索试验，发明人终于筛选出一种可以明显降低维生素和矿物质预混料中的维生素遇水流失的问题，大大的保证珍珠龙胆石斑鱼饲料的维生素含量。
进一步地，发明人在研究提高杂交石斑鱼保肝、抗氧化和提供免疫力的研究中，茶黄素具有预防和治疗脂肪肝，抗氧化和提高免疫力的作用，可以作为水产饲料的添加剂，将其与本发明提取的金柚幼果进行联合使用时，意外的发现，当与茶黄素联合使用时发现可以提高杂交石斑鱼的耐温性，可以进一步地提高珍珠龙胆石斑鱼的生长适应性，提高存活率。
与现有技术相比，本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料具有以下优势：
(1)本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料不仅可以提高珍珠龙胆石斑鱼的抗氧化能力、免疫力，还可以抑制珍珠龙胆石斑鱼的脂质积累和改善肝脏结构和肝脏病理损伤程度，而且无毒副作用、对环境友好。
(2)本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料投放到水体中维生素流失率低，可以很好的保持饲料中的维生素含量，保证珍珠龙胆石斑鱼维生素的吸收，更有利于石斑鱼的生长繁殖。
附图说明：
图1为金柚幼果多糖(YZW-A)的DEAE-52洗脱图图；
图2为金柚幼果多糖(YZW-A)的凝胶纯化图谱；
图3为金柚幼果多糖(YZW-A)的分子量图谱；
图4为金柚幼果多糖(YZW-A)的红外图谱；
图5为饲喂添加金柚幼果多糖(YZW-A)饲料8周的珍珠龙胆石斑鱼肝组织的变化(HE染色，400×)。(A)饲喂0mg/kg YZW-A的肝组织(YZW-A)；(B)饲喂200mg/kg YZW-A的肝组织(YZW-A-200)；(C)饲喂400mg/kgYZW-A的肝组织(YZW-A-400)；(D)饲喂800mg/kg YZW-A的肝组织(YZW-A-800)；(E)饲喂1600mg/kg YZW-A的肝组织(YZW-A-1600)。；
图6为饲喂添加YZW-A饲料8周的虎珍珠龙胆石斑鱼肝脏组织化学的变化(油红O染色，400×)。
图7为金柚幼果多糖(YZW-A)对珍珠龙胆石斑鱼原代肝细胞存活率、抗氧化酶、ROS含量和转氨酶的影响。(A)存活率(B)抗氧化酶(C)ROS含量(D)转氨酶含量。
图8为金柚幼果多糖(YZW-A)对20％LE诱导的肝细胞形态变化的影响。细胞爬片进行HE染色后，在倒置显微镜下观察细胞形态(200×)。(A)对照组：细胞中不加LE和YZW-A处理。(B)模型组：细胞中只加入20％LE(2ml/L)处理72h。(C)自然恢复组：细胞中先加入20％LE(2ml/L)处理48h，换液后再加入新鲜的完全培养基孵育24h。(D)YZW-A(75μg/ml)+20％LE(2ml/L)；(E)YZW-A(150μg/ml)+20％LE(2ml/L)；(F)YZW-A(300μg/ml)+20％LE(2ml/L)。
图9为金柚幼果多糖(YZW-A)降低LE诱导的细胞凋亡。Q1：死亡细胞；Q2：晚凋和坏死细胞；Q3：活细胞；Q4：早凋细胞。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明中所涉及的材料和试剂，均可通过市售或本领域常规技术手段获得，例如，所述维生素和矿物质预混料购于广东海因特生物技术集团有限公司。
实施例1、金柚幼果多糖的制备与结构分析
一、金柚幼果多糖的制备方法：
S1金柚幼果干燥后制成粉末，按照料液比为1:30加入去离子水，用果胶酶和纤维素酶(2％w/v，pH6.0，50℃)发酵1.5-3h；
S2对步骤S1获取的产物灭酶后，通过超声波破壁萃取；
S3超声破壁萃取后，对萃取液进行离心和浓缩，采用三氯乙酸脱蛋白，用四倍体积的乙醇在4℃条件下沉淀过夜分层，取沉淀；
S4将下层的沉淀溶于去离子水中，并注入DEAE Sepharose Fast Flow，所述DEAESepharose Fast Flow填料先用0.5mol/ml的盐酸浸泡1小时，洗去填料中的杂质物，用4-5倍体积的蒸馏水洗脱至中性，调整流速为5ml/min，蒸馏水平衡2h，用蒸馏水溶解1g的粗多糖，加热，斡旋，12000rpm离心，取上清液上样，调整流速为15ml/min的蒸馏水进行洗脱，三组溶剂洗脱，三倍柱体积的水、0.2M NaCl、0.5M NaCl、2.0M NaCl洗脱，苯酚硫酸法进行追踪检测，酶标仪490nm进行检测，根据峰形，分别收集，浓缩，3500Da透析袋透析，冷冻干燥，
S5将馏分(1mg/mL)应用于SephadexG-200柱上进行纯化，HPGPC测定多糖分子量和纯度，收集特定分子量的目的金柚幼果多糖，所述目的金柚幼果多糖的分子量图谱数据为RT-34.356min，lgMp-5.4，lgMw-5.6，lgMn-5.3，Mp-271395，Mw-383912，Mn-220069。
二、金柚幼果多糖的结构分析检测结果：
(1)经过步骤S4中DEAE-52纤维素柱层析，其洗脱图如图1所示，图中最左边的凸起峰为本发明收集峰。
(2)收集多糖经Sephadex G-200凝胶柱层进行分离纯化，其凝胶纯化图谱如图2所示，图中2-3管为本发明的目标金柚幼果多糖。
(3)通过HPGPC测定多糖分子量和纯度，色谱柱：BRT105-104-10串联凝胶柱(8×300mm)；流动相：0.05M NaCl溶液；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样量：20μl；检测器：示差检测器RI-502。
得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。
lgMp-RT校正曲线方程为：y＝-0.1764x+11.494R2＝0.9944；
lgMw-RT校正曲线方程为：y＝-0.1898x+12.105R2＝0.9919；
lgMn-RT校正曲线方程为：y＝-0.1709x+11.214R2＝0.9935；
Sample ID RT(min) lgMp lgMw lgMn Mp Mw Mn
34.356 5.4 5.6 5.3 271395 383912 220069
具体分子量图谱如图3所示。
(4)本发明金柚幼果多糖(YZW-A)的红外结果。吸收带在3600-3200cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3426cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2935cm-1处有一个吸收峰，该峰是多糖的C-H伸缩振动。1733cm-1归属于C＝O的伸缩振动引起的吸收峰。在1625cm-1有一个吸收峰，归属于N-H的变角振动。1415cm-1归属于C-O的伸缩振动引起的吸收峰。1243cm-1归属于O-H变角振动引起的吸收峰。在1022cm-1处有吸收峰为O-H变角振动引起的。如图4所示。
(5)发明人将收集纯化后的金柚幼果多糖委托给博睿糖生物技术有限公司进行结构分析和检测，通过红外光谱、HPGPC、红外光谱、甲基化、GC-MS和NMR等手段分析确定多糖的结构组成,结果表明：多糖得率为9.12％±0.33％，YZW-A存在C-O、N-H、O-H、-OH、C＝O及C-H结构，由鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖和半乳糖醛酸组成，其平均分子量为383,912Da，甲基化、GC-MS以及NMR等分析结果表明,主链骨架主要由1,3,6-linked Galp(18.52％)and1,5-linked Araf(14.16％)组成，侧链分支点位于→2,4)-α-L-Rhap-(1→的O-4连接在主链上，支链为阿拉伯半乳糖聚糖组成，链接为：
5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→6)-β-D-Galp-(1→。
具体结构式为：
Figure BDA0003010012980000081
试验例一、金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响试验
1、试验方法：
在高脂饲料中添加金柚幼果多糖(记为YZW-A)饲喂珍珠龙胆石斑鱼，设置5个梯度，添加浓度分别为0、0.02％、0.04％、0.08％、0.16％，试验养殖期为8周，具体饲料配方如表1所示。
表1 含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料组成及营养水平(克/千克)
Figure BDA0003010012980000091
制备方法：
将所用原料粉碎过筛；先取鱼粉、豆粕、面粉混合，搅拌均匀后加入啤酒酵母、维生素和矿物质预混料、氯化胆碱、维生素C磷酸酯、磷酸二氢钙和添加剂，搅拌均匀后加入鱼油、豆油和大豆卵磷脂，搅拌均匀，得混合料，接着加入水充分混合，所述水的添加量是混合料总质量的30％，制成颗粒料，晾干，即得。
所述维生素和矿物质预混料前处理步骤为：
将金柚幼果多糖加入温度为55～65℃的饮用水中搅拌均匀，得胶体溶液，冷却，接着将胶体溶液加入到维生素和矿物质预混料中搅拌均匀，即得；所述金柚幼果多糖为实施例1制得，所述胶体溶液的添加重量是维生素和矿物质预混料总重量的12％。
2、试验结果：
试验结果如表2和表3所示。
表2 饲料中添加金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能和饲料利用的影响
Figure BDA0003010012980000101
由表2可知，与对照组相比，添加相对较低剂量(分别为200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg和1600mg/kg)YZW-A的饲料可提高珍珠龙胆石斑鱼的生长性能，而添加较高剂量(1600mg/kg)YZW-A的饲料会使珍珠龙胆石斑鱼的生长性能下降。此外，200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg和1600mg/kg组YZW-A对改善珍珠龙胆石斑鱼饲料效率有显著的效果。
表3 饲料中添加金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼形态学参数的影响
Figure BDA0003010012980000102
由表3可知，YZW-A-200、YZW-A-400、YZW-A-800和YZW-A-1600组中的肝体比(HSI)显著的低于YZW-A-0组(P<0.05)。YZW-A-0组脏体比(VSI)和肥满度(CF)显著的高于其他实验组。说明本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料对鱼的形态学参数(如HSI、VSI)有显著影响，可以改善鱼类的脂质沉积。
试验例二、金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼肝脏形态结构和组织化学的影响1、试验方法：
在高脂饲料中添加金柚幼果多糖(记为YZW-A)饲喂珍珠龙胆石斑鱼，设置5个梯度，添加浓度分别为0、0.02％、0.04％、0.08％、0.16％，试验养殖期为8周，具体饲料配方如表1所示。养殖珍珠龙胆石斑鱼8周后，取肝脏组织做HE染色和油红O染色。
2、试验结果：
试验结果如图5和图6所示。具体为：饲喂YZW-A-200、YZW-A-400和YZW-A-800组饲料的鱼肝细胞形态正常，细胞核呈卵圆形，核仁突出。而在YZW-A-0和YZW-A-1600组肝细胞出现大量的空泡化，细胞核肥大，部分核仁解体和肝细胞结构损伤。肝脏油红O染色结果的脂滴含量进一步证明了以上结果。与YZW-A-0组相比，饲喂添加YZW-A剂量达到800mg/kg的饲料的珍珠龙胆石斑鱼，肝脏脂滴含量显著的减少，但当添加量更高(达到1600mg/kg)时，肝脏中的脂滴含量又增加了。说明本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料可降低肝脏中脂滴的含量。
试验例三、金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼肝脏凋亡、抗氧化、免疫相关及AMPK通路的RNA表达情况的影响
在探究饲料中添加金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼肝脏凋亡、抗氧化、免疫相关及AMPK通路的RNA表达情况的影响试验中，发明人研究了不同浓度(添加浓度分别为0、0.02％、0.04％、0.08％、0.16％)的YZW-A是否抑制H2O2诱导肝脏损伤时的凋亡、抗氧化、炎症和AMPK通路途径。研究发现：模型组的凋亡基因(caspase-3、caspase-8和caspase-9)和炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)与对照组相比明显上调，编码抗氧化酶(CAT、GSH-Px和GR)的基因表达下调(P<0.05)。与AMPK通路有关(AMPKα和AMPKβ)(P<0.05)。这些结果表明，H2O2可引起氧化应激，降低AMPK的活性，并引发炎症反应，导致抗氧化活性降低，并触发内源性和外源性凋亡途径。相反，在YZW-A治疗后，caspase-3、caspase-8、caspase-9、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达均显著下调，而CAT、GSH-Px、GR、AMPKα和AMPKβ的表达均显著上调(P<0.05)，特别是在400-800mg/kg的剂量下，与体外实验结果一致。说明本发明提供的金柚幼果多糖可以激活AMPK通路，减少肝细胞凋亡，增强抗氧化作用，提高免疫力，减轻珍珠龙胆石斑鱼氧化应激引起的肝损伤。
试验例四、金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼免疫功能的影响
1、试验方法：
为了进一步研究金柚幼果多糖提升珍珠龙胆石斑鱼免疫功能的机制，分离培养了珍珠龙胆石斑鱼原代肝细胞，建立肝细胞脂肪变性模型，然后再用金柚幼果多糖(YZW-A)进行干预，深入探讨YZW-A降低石斑鱼脂肪沉积的代谢机制。用CCK-8法检测了不同浓度(添加浓度分别为0、0.02％、0.04％、0.08％、0.16％)金柚幼果多糖(YZW-A)对细胞增殖的影响。
2、试验结果：
2.1、与对照组相比，LE诱导的模型组细胞活力显著降低(P<0.05)，而恢复组与模型组相比细胞活力显著提高(P<0.05)。YZW-A处理后的细胞活力也有所提高。特别是，100和200μg/mLYZW-A组的细胞活力显著高于恢复组(P<0.05)。这些结果表明，YZW-A减轻了LE诱导的细胞活力降低。
2.2、脂质积累会引发氧化应激，并损害脂肪肝的氧化防御系统。第一防线防御抗氧化酶GSH-Px、CAT和SOD对对抗ROS驱动的氧化应激发挥了最重要的作用。
如图7所示，与对照组相比：
2.2.1、模型组细胞ROS含量显著升高，GSH-Px、CAT和SOD活性显著降低(P<0.05)。肝细胞富含AST和ALT酶，它们被用作细胞毒性的指标，因为这些酶水平的增加可能表明肝细胞损伤。
2.2.2、模型组的AST和ALT水平相对于对照组显著升高(P<0.05)。YZW-A治疗诱导的AST和ALT水平下降，用200μg/mLYZW-A治疗诱导的水平最低。
试验例五、金柚幼果多糖对珍珠龙胆石斑鱼鱼肝细胞形态的影响
1、试验方法：
在高脂饲料中添加金柚幼果多糖(记为YZW-A)饲喂珍珠龙胆石斑鱼，设置5个梯度，添加浓度分别为0、0.02％、0.04％、0.08％、0.16％，试验养殖期为8周，具体饲料配方如表1所示。养殖珍珠龙胆石斑鱼8周后。
1.1、采用H&E染色观察珍珠龙胆石斑鱼鱼肝细胞形态的变化。
1.2、用V-APC/7AAD对珍珠龙胆石斑鱼鱼肝细胞进行双染，然后用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
2、试验结果：
试验结果如图8和图9所示。
采用H&E染色观察珍珠龙胆石斑鱼鱼肝细胞形态，具体为：模型组的凋亡特征，包括核凝聚(固缩)、核碎裂(Karyorrhexis)和膜泡，比对照组更明显。然而，上述特征在恢复组中略有减少，在YZW-A处理组中基本归一化，特别是在100和200μg/mLYZW-A处理组中。这些形态学改变表明，YZW-A对LE-诱导的肝细胞凋亡有治疗作用。
试验例六、金柚幼果多糖对脂质代谢、炎症、凋亡抗氧化相关基因的影响
检测金柚幼果多糖(YZW-A)对脂质代谢、炎症、凋亡抗氧化相关基因的影响。为了研究AMPK在LE引起的肝脂肪变性中的作用，确定了AMPK的所有三个亚基(α，β和γ)及其下游细胞因子的mRNA表达。在恢复组中，模型组的LE诱导的AMPKγmRNA表达降低明显改善(P<0.05)。YZW-A处理组的AMPKα，AMPKβ和AMPKγ表达高于恢复组，但以400μg/mL YZW-A处理的组中AMPKγ除外(P<0.05)。AMPKγ表达的改变与PPARα及其下游细胞因子CPT1的表达非常吻合，而与转录因子SERBP-1c及其下游细胞因子FAS和SCD1的表达负相关。有趣的是，与对照组相比，在模型组中，化合物C(AMPK抑制剂)预处理显着降低了PPARα的表达，但显着提高了SERBP-1c和SCD1的表达(P<0.05)。与恢复组相比，YZW-A处理诱导脂肪基因SERBP-1c，SCD1和FAS的表达显着下降(仅在200μg/mL YZW-A中表现)(P<0.05)。脂肪分解基因PPARα和CPT1增强，尽管程度不同。此外，在用LE预处理肝细胞中，消除了200μg/mL YZW-A诱导的PPARα的上调以及SERBP-1c和SCD1的下调。综上所述，说明本发明提供的金柚幼果多糖增强了脂质分解代谢并被抑制通过激活AMPKα和AMPKβ进行脂质合成代谢，从而减轻LE引起的肝脂肪变性。
试验例七、含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料维生素的溶失率检测
取实施例4制得的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料浸入水中，在浸泡时间达30min、60min时分别取出，烘干后测定饲料中维生素A和维生素C的溶失率，以直接添加市售的维生素和矿物质预混料制得的作为对照组。
Figure BDA0003010012980000141
由表4可知，本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料可以降低维生素和矿物质预混料中维生素A和维生素C的流失率，大大的保证杂交石斑鱼饲料的维生素含量。
一、含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料的制备：
所述含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料配方如表5所述：
表5 含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料配方
Figure BDA0003010012980000142
Figure BDA0003010012980000151
试验例八、珍珠龙胆石斑鱼的耐温性影响
1、试验方法：
采用实施例6制备的饲料进行投喂珍珠龙胆石斑鱼，参考邵彦翔发表的“石斑鱼对温度胁迫的耐受性研究”的方法测定珍珠龙胆石斑鱼的高温半致死温度和低温半致死温度。并以论文中的珍珠龙胆石斑鱼作为对照组。
2、试验结果
试验结果如表6所示。
表6 珍珠龙胆石斑鱼的耐温性试验
高温半致死温度(℃) 低温半致死温度(℃)
对照组 39℃ 11℃
实施例6组 42℃ 7℃
由表6可知，采用本发明提供的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料投喂可以提高珍珠龙胆石斑鱼对温度胁迫的耐受力，更有利于珍珠龙胆石斑鱼的生长和繁殖。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，其特征在于，包括以下成分及其重量份数：
白鱼粉45份、豆粕18份、面粉19.8～20份、啤酒酵母2份、鱼油5份、大豆油5份、大豆卵磷脂1份、氯化胆碱0.5份、维生素C磷酸酯0.5份、磷酸二氢钙1份、维生素和矿物质预混料2份和添加剂0.04～0.08份，所述添加剂为金柚幼果多糖。
2.如权利要求1所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，其特征在于，所述金柚幼果多糖的制备方法为：
S1金柚幼果干燥后制成粉末，按照料液比为1:30加入去离子水，用果胶酶和纤维素酶(2％w/v，pH6.0，50℃)发酵1.5-3h；
S2对步骤S1获取的产物灭酶后，通过超声波破壁萃取；
S3超声破壁萃取后，对萃取液进行离心和浓缩，采用三氯乙酸脱蛋白，用四倍体积的乙醇在4℃条件下沉淀过夜分层，取沉淀；
S4将下层的沉淀溶于去离子水中，并注入DEAE Sepharose Fast Flow，所述DEAESepharose Fast Flow填料先用0.5mol/ml的盐酸浸泡1小时，洗去填料中的杂质物，用4～5倍体积的蒸馏水洗脱至中性，调整流速为5ml/min，蒸馏水平衡2h，用蒸馏水溶解1g的粗多糖，加热，斡旋，12000rpm离心，取上清液上样，调整流速为15ml/min的蒸馏水进行洗脱，三组溶剂洗脱，三倍柱体积的水、0.2M NaCl、0.5M NaCl、2.0M NaCl洗，苯酚硫酸法进行追踪检测，酶标仪490nm进行检测，根据峰形，分别收集，浓缩，3500Da透析袋透析，冷冻干燥，
S5将馏分(1mg/mL)应用于SephadexG-200柱上进行纯化，HPGPC测定多糖分子量和纯度，收集特定分子量的目的金柚幼果多糖，所述目的金柚幼果多糖的分子量图谱数据为RT-34.356min，lgMp-5.4，lgMw-5.6，lgMn-5.3，Mp-271395，Mw-383912，Mn-220069。
3.如权利要求1或2所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，其特征在于，所述维生素和矿物质预混料的前处理步骤为：
将金柚幼果多糖加入温度为55～65℃的饮用水中搅拌均匀，得胶体溶液，冷却，接着将胶体溶液加入到维生素和矿物质预混料中搅拌均匀，所述金柚幼果多糖为权利要求2制得。
4.如权利要求3所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，其特征在于，所述胶体溶液的添加重量是维生素和矿物质预混料总重量的8～15％。
5.如权利要求4所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，其特征在于，所述胶体溶液的添加重量是维生素和矿物质预混料总重量的10～12％。
6.如权利要求1所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，其特征在于，所述添加剂还包括茶黄素。
7.如权利要求6所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，其特征在于，所述添加剂中金柚幼果多糖与茶黄素的质量比为1:(0.1～0.4)。
8.如权利要求7所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料，其特征在于，所述添加剂中金柚幼果多糖与茶黄素的质量比为1:0.2。
9.如权利要求1～8任一所述的含有金柚幼果多糖的石斑鱼饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所用原料粉碎过筛；先取白鱼粉、豆粕、面粉混合，搅拌均匀后加入啤酒酵母、维生素和矿物质预混料、氯化胆碱、维生素C磷酸酯、磷酸二氢钙和添加剂，搅拌均匀后加入鱼油、大豆油和大豆卵磷脂，搅拌均匀，得混合料；接着加入水充分混合，所述水的添加量是混合料总质量的30％，制成颗粒料，晾干，即得。
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