CN102908342B - 一种用于防治草鱼出血病的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于防治草鱼出血病的药物。本发明提供一种用于防治草鱼出血病的药物，其特征在于，包含表没食子儿茶素没食子酸酯。该药物能够很好的防止由于病毒性草鱼出血病导致的草鱼死亡，大大提高草鱼在养殖、运输过程中的存活率。

Description

一种用于防治草鱼出血病的药物
技术领域
本发明涉及一种用于防治草鱼出血病的药物，尤其涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)作为制备防治病毒性草鱼出血病药物的应用。
背景技术
草鱼(Grass carp，Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖品种，其养殖量约为总养殖量的23％，每年因疾病造成的病害减产要占年度草鱼总养殖量的30％以上。在草鱼的所有病原中，以草鱼呼肠孤病毒(Grass carpreovirus，GCRV)危害最大，导致的减产规模最大，其感染导致的草鱼出血病是一种高传染性、高致死性的病毒性疾病，是我国淡水水产养殖中最为突出的问题之一。
草鱼出血病的主要症状是上下颌、眼眶、鳍条、鳃及鳃盖充血，眼球突出；剥去病鱼的皮肤，可见肌肉有点状或块状充血、出血；肠道周围脂肪、肠系膜、胆囊、脾、肝呈现出血点或血丝症状。草鱼病毒性出血病广泛流行于湖北、广西、广东、江苏、河南、河北、江西、福建、浙江、上海等省市的草鱼养殖区。其具有较长的发病季节，主要流行于每年六月中下旬至九月底，高峰在八月，在水温25至30℃时最为流行。
有报道，用草鱼出血病组织浆灭活疫苗或草鱼出血病细胞培养灭活疫苗通过注射或浸泡途径对草鱼进行免疫，是预防病毒性草鱼出血病发生最为有效的方法之一(杨先乐，1986)。但目前尚无针对病毒性草鱼出血病的防治的有效药物。
表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶中含量最高的一种儿茶素，其化学式为C22H18O11，分子量为458.4。
表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)的提取方法在现有的技术中已经公开，如陈团生等在“绿茶910EGCG的提取工艺”(福建农林大学学报，2012年第41卷1期)公布的以绿茶910为原料，采用咖啡碱沉淀-溶剂萃取法对茶叶表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)进行提取的工艺流程，陈秋韵等在“表没食子儿茶素没食子酸酯的提取分离工艺研究”(食品工业科技，2011年第10期)中公布的采用无水乙醇对茶叶进行浸提EGCG的工艺，王传金等在“聚酰胺色谱法分离制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯”(应用化学，2007年第24卷4期)中公布的高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯提取工艺流程等。本发明涉及的表没食子儿茶素没食子酸酯各种纯度的产品已经商品化在市场上均容易获得，如美国的SIGMA公司、无锡太阳绿宝科技有限公司、南京景竹生物科技有限公司等均有销售。
表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)具有很强的预防肿瘤及抑瘤作用，有报道表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)能明显抑制胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、直肠癌等癌细胞的生长增殖。目前尚未见有关EGCG应用于病毒性草鱼出血病防治的专利及相关研究。
发明内容
本发明的目的是要解决病毒性草鱼出血病的防治的难题，开发一种无毒性能有效防治病毒性草鱼出血病的药物。
本发明发明人在试验中发现了EGCG能够有效抑制草鱼呼肠孤病毒感染草鱼，并通过进一步试验证实了EGCG能够阻断草鱼呼肠孤病毒感染草鱼。
本发明公开了利用茶多酚中核心成分EGCG有效阻断草鱼呼肠孤病毒感染草鱼，抑制草鱼呼肠孤病毒增殖，从而实现EGCG抗草鱼呼肠孤病毒的用途。
本发明提供一种用于防治草鱼出血病的药物，包含表没食子儿茶素没食子酸酯。
表没食子儿茶素没食子酸酯为粉末状。
本发明还提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯作为制备防治病毒性草鱼出血病药物的应用。
使用时表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度范围为5至50μg／mL。
表没食子儿茶素没食子酸酯为绿茶提取物茶多酚中含有的表没食子儿茶素没食子酸酯。
附图说明
图1是标准品EGCG的色谱图；
图2是绿茶粗提物茶多酚的色谱图。
具体实施方式
本发明涉及的表没食子儿茶素没食子酸酯可直接制成粉末状药物剂型，根据病毒性草鱼出血病爆发趋势的特点进行全塘泼洒用药，也可应用于草鱼周转运输过程中浸泡防治病毒性草鱼出血病。或将以表没食子儿茶素没食子酸酯为主要成分的绿茶粗提物茶多酚制备成药物应用于病毒性草鱼出血病毒的防治。
下面是本发明的部分药理药效学试验及结果，本发明药理部分所用95％纯度的EGCG购自美国SIGMA公司，绿茶粗提物茶多酚为原材料市场购得，采用草鱼的肾脏细胞系(CIK)用于体外药理药效学部分试验
EGCG体外抗草鱼呼肠孤病毒的研究
1、不同EGCG浓度对草鱼呼肠孤病毒的体外抑制效应
取对数生长期的草鱼肾脏细胞，用完全培养基培养在6孔板中，27℃隔夜培养，次日分组，治疗A组加入EGCG(终浓度分别为1、5、10、20、40μg／mL)；对照C组不做任何处理。处理12h后加入等量的草鱼呼肠孤病毒上清，感染24小时后吸取上清，提取病毒的RNA并逆转录成cDNA，再利用荧光定量技术进行病毒定量检测。
实验结果：相对于对照C组加入EGCG终浓度分别为1、5、10、20、40μg／mL的各组对病毒的抑制率分别为12.8％、77％、97％、98％、99％。
2、不同茶多酚浓度对草鱼呼肠孤病毒的体外抑制效应
治疗B组加入绿茶粗提物茶多酚(终浓度分别为10、50、100、200、400μg／mL)；对照C组不做任何处理。处理12h后加入等量的草鱼呼肠孤病毒上清，感染24小时后吸取上清，提取病毒的RNA并逆转录成cDNA，再利用荧光定量技术进行病毒定量检测。
实验结果：相对于C组加入绿茶粗提物茶多酚终浓度分别为10、50、100、200、400μg/mL的各组对病毒的抑制率分别为5.9％、49％、58％、88％、90％左右。
3、实验中绿茶粗提物茶多酚中EGCG含量的检测
检测方法为：高效液相色谱法(HPLC)
色谱柱：C18柱(5μm，150mm×4.5mm)
流动相：甲醇：水：冰醋酸＝25：74：1(V／V／V)
检测波长：270nm
流速：1mL／min
进样量：10μL
实验结果：
标准品EGCG的色谱图如图1所示，计算得出标准曲线y＝6.345x+13.30R2＝0.998。
绿茶粗提物茶多酚的色谱图如图2所示，结合标准曲线计算绿茶粗提物茶多酚中EGCG的含量为60.9％
EGCG体内抗草鱼呼肠孤病毒的研究：
1、绿茶粗提物茶多酚对草鱼呼肠孤病毒体内抑制的试验
设置5个实验组，每组20条1龄草鱼，加入绿茶粗提物茶多酚(终浓度分别为5、10、20、30g／m3)；对照组不做任何处理。感染等剂量的草鱼呼肠孤病毒，27℃暂养10天，分别对试验草鱼提取病毒的RNA并逆转录成cDNA，再利用荧光定量技术进行病毒定量检测。
实验结果：相对于对照组加入绿茶粗提物茶多酚终浓度分别为5、10、20、30g／m3的各组对病毒的抑制率分别为51％、59％、70％、86％左右。
2、绿茶粗提物茶多酚对草鱼安全性评价试验
设置5个实验组，每组10条1龄草鱼，加入绿茶粗提物茶多酚(终浓度分别为0、5、10、20、30g/m3)
实验结果如表1所示，各药物浓度组下草鱼均未有死亡，绿茶粗提物茶多酚对草鱼具有安全性。
Figure GSB0000118458970000051
表1
本发明所具有的有益效果：本发明将EGCG应用于病毒性草鱼出血病的防治，具有很好的防治作用，而且无药物残留，无害环保。
实施案例一
在病毒性草鱼出血病爆发季节，选择EGCG含量在60％以上的茶多酚，在晴天上午9点左右进行草鱼养殖塘口全塘泼洒，连续两天，以后根据本地区病毒性草鱼出血病爆发情况进行同样操作。
本发明采用的各种原料药均为市售产品。
实施案例二
在草鱼苗种转运过程，选择EGCG含量在60％以上的茶多酚，进行高浓度浸泡。
本发明采用的各种原料药均为市售产品。
实施案例三
在草鱼的饲养过程中，选择含有EGCG的茶多酚，拌料投喂。
本发明采用的各种原料药均为市售产品。
实际操作表明，实施例一二三中将表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)作为防治病毒性草鱼出血病的药物或制备防治病毒性草鱼出血病的药物，能够很好的防止由于病毒性草鱼出血病导致的草鱼死亡，大大提高草鱼的存活率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (3)

1.表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治病毒性草鱼出血病药物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，使用时表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度范围为5至50μg／mL。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述表没食子儿茶素没食子酸酯为绿茶提取物茶多酚中含有的表没食子儿茶素没食子酸酯。
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