CN115869207A - 一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物及其在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，由金枪鱼胶原蛋白肽，橄榄油，卵磷脂，环糊精改性透明质酸和聚乙二醇组成；本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，能够有效增强皮肤细胞的抵抗能力，防止微生物滋生，增强皮肤的抗氧化能力，保持皮肤的湿润，防止皮肤出油。本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物中还添加了卵磷脂，能够有效促进皮肤再生，防止皮肤粗糙，防止皮肤皱纹的形成，对皮肤具有长期保湿控油效果。
Description
技术领域
本发明涉及金枪鱼胶原蛋白肽和化妆品技术领域，具体说是一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物及其在化妆品中的应用。
背景技术
保湿和控油一直是化妆品领域关注的关键问题。高质量的化妆品必须具备出色的保湿能力，同时控制皮肤表面油脂的生成。现有的化妆品主要通过添加透明质酸、玻尿酸等添加剂达到保湿效果，但是现有的透明质酸、玻尿酸的生产成本高，产率低，导致终端化妆品价格昂贵。另外，透明质酸和玻尿酸均无控油效果，制作化妆品时需要添加其他控油产品，但是现有的控油产品较少，效果差，并且不适合敏感肌肤的人群。因此，研究兼具保湿与控油效果的化妆品，具有广阔的市场前景。
金枪鱼中含有丰富的多肽类物质，这类多肽类化合物能够被人体皮肤吸收，增强皮肤的免疫功能，抑制皮肤的炎症反应，因此，金枪鱼多肽类化合物可以用于制备化妆品。但是目前的金枪鱼多肽类化合物的制备过程复杂，得到的多肽类化合物纯度低，成分复杂，与其他的添加剂组分混合后容易出现不互溶、分层等现象，影响化妆品的使用。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物及其在化妆品中的应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，以重量份计，由以下原料组成：金枪鱼胶原蛋白肽0.1～0.5份，橄榄油3～10份，卵磷脂0.5～2.5份，环糊精改性透明质酸5～10份和聚乙二醇10～20份；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将氨基环糊精、透明质酸和有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至25～35℃，搅拌反应24～48小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述氨基环糊精、透明质酸、有机溶剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量体积比为1～2g∶5～8g∶80～100ml∶1～1.5g；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；
所述金枪鱼胶原蛋白肽按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将100份金枪鱼粉加入到300～500份CaCl2水溶液中浸泡0.5～1小时，加入0.5～1份乳酸菌发酵液，在20～40℃发酵0.5～1小时，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为1～5％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到100～200份水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至40～60℃，加入碳酸钠调节pH至6～8，加入1～2份复合蛋白酶酶解10～18小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至95～100℃，恒温20～30分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/6～1/4，加入100～200份乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/15～1/20，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶2～5∶2～4∶1～3组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为SephadexLH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1～5∶20。
优选的，步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液和填料的质量比为1∶10～15。
优选的，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
本发明还包括一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的制备方法，包括以下步骤：
以重量份计，将橄榄油3～10份，卵磷脂0.5～2.5份和聚乙二醇10～20份加入到匀质机中在10000-12000rpm下高速剪切，然后向其中加入金枪鱼胶原蛋白肽0.1～0.5份，环糊精改性透明质酸5～10份在300～400rpm下高速搅拌混匀，得到金枪鱼胶原蛋白肽的组合物；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将氨基环糊精、透明质酸和有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至25～35℃，搅拌反应24～48小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述氨基环糊精、透明质酸、有机溶剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量体积比为1～2g∶5～8g∶80～100ml∶1～1.5g；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；
所述金枪鱼胶原蛋白肽按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将100份金枪鱼粉加入到300～500份CaCl2水溶液中浸泡0.5～1小时，加入0.5～1份乳酸菌发酵液，在20～40℃发酵0.5～1小时，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为1～5％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到100～200份水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至40～60℃，加入碳酸钠调节pH至6～8，加入1～2份复合蛋白酶酶解10～18小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至95～100℃，恒温20～30分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/6～1/4，加入100～200份乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/15～1/20，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶2～5∶2～4∶1～3组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为SephadexLH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1～5∶20。
本发明包括一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，用于制备化妆品的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，能够有效增强皮肤细胞的抵抗能力，防止微生物滋生，增强皮肤的抗氧化能力，保持皮肤的湿润，防止皮肤出油。本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物中还添加了卵磷脂，能够有效促进皮肤再生，防止皮肤粗糙，防止皮肤皱纹的形成。
本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，其中的环糊精改性透明质酸组分，通过环糊精对透明质酸起到很好的包覆作用，在和金枪鱼胶原蛋白肽混合后，能够将金枪鱼胶原蛋白肽均匀分布在环糊精改性透明质酸的分子网格内，避免金枪鱼胶原蛋白肽的团聚，提高基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物对皮肤的长期保湿控油效果。
附图说明
图1为各组斑马鱼的尾鳍面积变化结果示意图(每组选取8条斑马鱼用于尾鳍面积分析，与空白对照组相比，####P＜0.0001；与NaCl模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001)；
图2为各组斑马鱼水通道蛋白基因aqp1a1表达示意图(与空白对照组相比，##P＜0.01，###P＜0.001；与NaCl模型组相比，**P＜0.01，***P＜0.001)；
图3为各组斑马鱼水通道蛋白基因aqp3a表达示意图(与空白对照组相比，##P＜0.01，###P＜0.001；与NaCl模型组相比，**P＜0.01，***P＜0.001)；
图4为各组斑马鱼srd5a1基因表达示意图(与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)；
图5为各组斑马鱼srd5a2a基因表达示意图(与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)；
图6为各组斑马鱼srd5a2b基因表达示意图(与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)；
具体实施方式
本发明的目的是提供一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物及其在化妆品中的应用，通过以下技术方案实现：
一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，以重量份计，由以下原料组成：金枪鱼胶原蛋白肽0.1～0.5份，橄榄油3～10份，卵磷脂0.5～2.5份，环糊精改性透明质酸5～10份和聚乙二醇10～20份；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将氨基环糊精、透明质酸和有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至25～35℃，搅拌反应24～48小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述氨基环糊精、透明质酸、有机溶剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量体积比为1～2g∶5～8g∶80～100ml∶1～1.5g；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；
所述金枪鱼胶原蛋白肽按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将100份金枪鱼粉加入到300～500份CaCl2水溶液中浸泡0.5～1小时，加入0.5～1份乳酸菌发酵液，在20～40℃发酵0.5～1小时，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为1～5％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到100～200份水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至40～60℃，加入碳酸钠调节pH至6～8，加入1～2份复合蛋白酶酶解10～18小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至95～100℃，恒温20～30分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/6～1/4，加入100～200份乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/15～1/20，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶2～5∶2～4∶1～3组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为SephadexLH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1～5∶20。
本发明所述环糊精改性透明质酸的反应路线为：
优选的，步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液和填料的质量比为1∶10～15。
优选的，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
本发明还包括一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的制备方法，包括以下步骤：
以重量份计，将橄榄油3～10份，卵磷脂0.5～2.5份和聚乙二醇10～20份加入到匀质机中在10000-12000rpm下高速剪切，然后向其中加入金枪鱼胶原蛋白肽0.1～0.5份，环糊精改性透明质酸5～10份在300～400rpm下高速搅拌混匀，得到金枪鱼胶原蛋白肽的组合物；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将氨基环糊精、透明质酸和有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至25～35℃，搅拌反应24～48小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述氨基环糊精、透明质酸、有机溶剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量体积比为1～2g∶5～8g∶80～100ml∶1～1.5g；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；
所述金枪鱼胶原蛋白肽按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将100份金枪鱼粉加入到300～500份CaCl2水溶液中浸泡0.5～1小时，加入0.5～1份乳酸菌发酵液，在20～40℃发酵0.5～1小时，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为1～5％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到100～200份水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至40～60℃，加入碳酸钠调节pH至6～8，加入1～2份复合蛋白酶酶解10～18小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至95～100℃，恒温20～30分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/6～1/4，加入100～200份乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/15～1/20，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶2～5∶2～4∶1～3组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为SephadexLH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1～5∶20。
本发明还包括一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的应用，用于制备化妆品，化妆品的剂型可以是乳液、膏霜、面膜或水乳剂。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
本发明的乳酸菌发酵液由广东益可维生物技术有限公司生产。
碱性蛋白酶(酶活：80万U/g)和胰蛋白酶(酶活：6万U/g)购自上海华上翔洋生物技术有限公司，中性蛋白酶(酶活：10万U/g)购自辽宁华星生物科技有限公司，木瓜蛋白酶(酶活：200万U/g)购自南宁天绿生物制品有限公司。
实施例1
一种金枪鱼胶原蛋白肽，按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将1000g金枪鱼粉加入到3000g CaCl2水溶液中浸泡0.5小时，加入5g乳酸菌发酵液，在20℃发酵0.5小时，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为1％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到1000g水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至40℃，加入碳酸钠调节pH至6，加入10g复合蛋白酶酶解10小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至95℃，恒温20分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/6，加入1000g乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/15，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶2∶2∶1组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为SephadexLH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽34.6g；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1∶20。
实施例2
一种金枪鱼胶原蛋白肽，按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将1000g金枪鱼粉加入到5000g CaCl2水溶液中浸泡1小时，加入10g乳酸菌发酵液，在40℃发酵1小时，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为5％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到2000g水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至60℃，加入碳酸钠调节pH至8，加入20g复合蛋白酶酶解18小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至100℃，恒温30分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/4，加入2000g乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/20，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶5∶4∶3组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为SephadexLH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽34.8；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1∶4。
实施例3
一种金枪鱼胶原蛋白肽，按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将1000g金枪鱼粉加入到4500g CaCl2水溶液中浸泡40分钟，加入6g乳酸菌发酵液，在25℃发酵40分钟，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为4％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到1200g水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至45℃，加入碳酸钠调节pH至6.5，加入12g复合蛋白酶酶解12小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至96℃，恒温24分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/5，加入1200g乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/18，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶4∶3∶2组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为SephadexLH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽38.4g；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为3∶20。
实施例4
一种金枪鱼胶原蛋白肽，按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将1000g金枪鱼粉加入到4000gCaCl2水溶液中浸泡45分钟，加入8g乳酸菌发酵液，在30℃发酵45分钟，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为3％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到1500g水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至50℃，加入碳酸钠调节pH至7，加入15g复合蛋白酶酶解15小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至98℃，恒温25分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/5，加入1500g乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/18，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶3∶3∶2组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为SephadexLH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽38.8g；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1∶5。
将实施例1～4所得金枪鱼胶原蛋白肽混合均匀，作为制备下述实施例中组合物的原料。
实施例5
一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，由以下组分组成：金枪鱼胶原蛋白肽1g，橄榄油30g，卵磷脂5g，环糊精改性透明质酸50g和聚乙二醇100g；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将10g氨基环糊精、50g透明质酸和800ml有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入10g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至25℃，搅拌反应24小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
实施例6
一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，由以下原料组成：金枪鱼胶原蛋白肽5g，橄榄油100g，卵磷脂25g，环糊精改性透明质酸100g和聚乙二醇200g；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将30g氨基环糊精、120g透明质酸和1.5L有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入22.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至35℃，搅拌反应48小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述有机溶剂为二甲亚砜。
实施例7
一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，由以下原料组成：金枪鱼胶原蛋白肽2g，橄榄油40g，卵磷脂10g，环糊精改性透明质酸60g和聚乙二醇120g；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将18g氨基环糊精、90g透明质酸和1200ml有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入18g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至30℃，搅拌反应30小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
实施例8
一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，由以下原料组成：金枪鱼胶原蛋白肽4g，橄榄油60g，卵磷脂20g，环糊精改性透明质酸80g和聚乙二醇150g；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将30g氨基环糊精、120g透明质酸和1800ml有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入28g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至32℃，搅拌反应36小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
实施例9
实施例5所述的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将橄榄油30g，卵磷脂5g和聚乙二醇100g加入到匀质机中在10000rpm下高速剪切，然后向其中加入金枪鱼胶原蛋白肽1g，环糊精改性透明质酸50g在300rpm下高速搅拌混匀，得到金枪鱼胶原蛋白肽的组合物。
实施例10
实施例6所述的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将橄榄油100g，卵磷脂25g和聚乙二醇200g加入到匀质机中在12000rpm下高速剪切，然后向其中加入金枪鱼胶原蛋白肽5g，环糊精改性透明质酸100g在400rpm下高速搅拌混匀，得到金枪鱼胶原蛋白肽的组合物。
实施例11
实施例7所述的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将橄榄油40g，卵磷脂10g和聚乙二醇120g加入到匀质机中在11000rpm下高速剪切，然后向其中加入金枪鱼胶原蛋白肽2g，环糊精改性透明质酸60g在380rpm下高速搅拌混匀，得到金枪鱼胶原蛋白肽的组合物。
实施例12
实施例8所述的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将橄榄油60g，卵磷脂20g和聚乙二醇150g加入到匀质机中在11000rpm下高速剪切，然后向其中加入金枪鱼胶原蛋白肽4g，环糊精改性透明质酸80g在350rpm下高速搅拌混匀，得到金枪鱼胶原蛋白肽的组合物。
对金枪鱼胶原蛋白肽的安全作用剂量进行探索研究
以斑马鱼为模型，评价金枪鱼胶原蛋白肽的安全作用剂量。
选取出生2天的野生AB系斑马鱼胚胎，置于1mg/ml的链霉蛋白酶溶液中3分钟，脱去斑马鱼胚胎外层卵膜，向其中加入金枪鱼胶原蛋白肽-水溶液，浓度依次为125、250、500、1000、1500、2000和4000μg/mL，每个浓度3重复，每个重复20个胚胎，置于28℃恒温培养箱中培养20小时，观察并记录斑马鱼死亡数、畸形情况。结果显示，在金枪鱼胶原蛋白肽样品浓度达到4000μg/mL时，也没有引起斑马鱼的畸形和死亡，说明金枪鱼胶原蛋白胶的安全性能良好。
对本发明实施例5～8的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物进行保湿功效评价。
选取出生2dpf的野生AB系斑马鱼胚胎，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，置于1mg/ml的链霉蛋白酶溶液中约3min，脱去斑马鱼胚胎外层卵膜，将脱膜处理的斑马鱼随机分成空白对照组、NaCl模型组，玻尿酸阳性对照组和实验组，每组10条鱼。空白对照组加入斑马鱼养鱼水，玻尿酸阳性对照组加入浓度600μg/mL的玻尿酸溶液，实验组分别加入实施例5～8所得的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物(浓度600μg/mL)，与此同时，除空白对照组外，其余各组再加入质量浓度1％的氯化钠溶液，将上述各组置于28℃恒温培养箱中培养20小时。
将上述步骤对斑马鱼分组与处理后，各组随机挑选8～10条，在显微镜下观察拍照。利用Image-Pro Plus软件计算斑马鱼的尾鳍面积变化，利用GraphPad Prism软件进行差异统计分析，当数据满足方差齐性时，采用方差分析和Dunnett′s检验；当数据不满足方差齐性时，采用Brown-Forsythe and Welch方差分析和Dunnett T3检验，统计结果用mean±SEM表示，P＜0.05表明差异具有统计学意义，并通过下列公式计算样金枪鱼胶原蛋白肽对斑马鱼的保湿功效：
式中：
分别表示金枪鱼胶原蛋白肽组、模型组和空白对照组的斑马鱼尾鳍面积平均值。
对各组斑马鱼的尾鳍面积进行统计结果如图1所示，与氯化钠模型组斑马鱼的尾鳍面积显著减小，与氯化钠模型组相比，本发明的金枪鱼胶原蛋白肽的组合物均可使斑马鱼尾鳍面积显著增加(P＜0.05)；计算其保湿效果功效如表1所示，可以看出在相同的浓度下，本申请的金枪鱼胶原蛋白肽组合物的保湿功效能够达到与玻尿酸阳性对照组相当，甚至更优异的效果。
表1保湿功效评价
水通道蛋白基因表达量分析
每组随机挑选20个正常的斑马鱼胚胎，按保湿功效评价所述进行分组处理后，使用养鱼水对其进行清洗，在低温条件下对鱼体进行组织匀浆后，使用RNA提取试剂盒提取各组斑马鱼的总RNA，之后反转录为cDNA。以cDNA为模板，β-actin为内参基因，利用RT-qPCR技术，检测水通道蛋白基因(aqpla1和aqp3)的相对表达量，并通过GraphPad Prism软件进行统计学分析，P＜0.05表明差异具有统计学意义。
对水通道蛋白相关基因表达量的检测结果如图2和图3所示，与空白对照组相比，NaCl模型组斑马鱼的aqp1a1和aqp3a基因表达显著上调(P＜0.01)；与NaCl模型组相比，玻尿酸阳性对照组、金枪鱼胶原蛋白肽组合物均可使水通道蛋白相关基因aqp1a1和aqp3a的表达显著下调(P＜0.01)。
以上结果表明，在1％NaCl溶液中，斑马鱼因处于高渗环境会发生皮肤缺水，尾鳍皱缩，尾部面积显著减小，并导致水通道蛋白基因表达显著上调；加入金枪鱼胶原蛋白肽可以改善高渗环境，减少斑马鱼皮肤缺水，明显缓解1％NaCl造成的斑马鱼尾鳍面积减小，并可明显逆转NaCl溶液高渗培养诱导的水通道蛋白基因表达升高，提示金枪鱼胶原蛋白肽组合物具有明显的保湿功效。
控油效果评价
将正常发育至6月龄的斑马鱼随机分为空白对照组、单宁酸阳性对照组、金枪鱼胶原蛋白肽组合物组，每组3条。其中，空白对照组加入养鱼水，阳性对照组加入终浓度为8μg/mL的单宁酸溶液，金枪鱼胶原蛋白肽组合物组加入实施例5～8所得的浓度8μg/mL的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，置于28℃的恒温培养箱中连续培养7d，每24h更换一次相应的培养液。
7天后，解剖雄鱼取出精巢，将其匀浆后提取RNA，反转录为cDNA。选取表达相对稳定的RPL13a为内参基因，以cDNA为模板，利用RT-qPCR技术对5α-还原酶基因srd5al、srd5a2a、srd5a2b表达量进行检测，每组3重复，参照下列公式，计算各基因的相对表达量，统计分析评价金枪鱼胶原蛋白肽的控油功效。
ΔCt待测＝Ct待测-Ct内参(待测)，ΔCt对照＝Ct对照-Ct内参(对照)；
ΔΔCt＝ΔCt待测-ΔCt对照，相对表达量＝2-ΔΔCt；
式中：Ct待测为待测组目的基因平均Ct值，Ct内参(待测)为待测组内参基因平均Ct值，Ct对照为对照组目的基因平均Ct值，Ct内参(对照)为对照组内参基因平均Ct值。
利用上述公式计算得到目的基因的相对表达量，以GraphPad Prism 8.3软件进行统计分析，采用Brown-Forsythe and Welch方差分析，统计结果用mean±SEM表示，P＜0.05表明差异具有统计学意义。
各组斑马鱼5α-还原酶相关基因的表达如图4、图5和图6所示，与空白对照组相比，单宁酸、基于金枪鱼胶原蛋白肽组合物均可使srd5a1和srd5a2b基因的表达量显著下调(P＜0.05)；同时，单宁酸和基于金枪鱼胶原蛋白肽组合物也可显著下调srd5a2a基因的表达量(P＜0.01)。上述结果表明，在本发明基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的作用下，斑马鱼体内5α-还原酶相关基因的表达量显著下降，反映出5α-还原酶含量明显减少，限制了睾酮转化成二氢睾酮过程，继而产生皮脂的量也会明显减少，提示本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物具有明显的控油功效。
为了对本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的效果进行检测，选取20位油性皮肤志愿者，年龄为25～40岁，使用时间为7天，将本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽组合物分别涂抹在试验者的前额，进行比较和皮脂胶带分析，试验表明，本发明的基于金枪鱼胶原蛋白肽组合物涂抹上后感觉清爽，能够持续有效的减少皮脂分泌的能力。
Claims (5)
1.一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，其特征在于：以重量份计，由以下原料组成：金枪鱼胶原蛋白肽0.1～0.5份，橄榄油3～10份，卵磷脂0.5～2.5份，环糊精改性透明质酸5～10份和聚乙二醇10～20份；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将氨基环糊精、透明质酸和有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至25～35℃，搅拌反应24～48小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述氨基环糊精、透明质酸、有机溶剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量体积比为1～2g∶5～8g：80～100ml∶1～1.5g；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；
所述金枪鱼胶原蛋白肽按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将100份金枪鱼粉加入到300～500份CaCl2水溶液中浸泡0.5～1小时，加入0.5～1份乳酸菌发酵液，在20～40℃发酵0.5～1小时，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为1～5％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到100～200份水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至40～60℃，加入碳酸钠调节pH至6～8，加入1～2份复合蛋白酶酶解10～18小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至95～100℃，恒温20～30分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/6～1/4，加入100～200份乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/15～1/20，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1∶2～5∶2～4∶1～3组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为Sephadex LH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1～5∶20。
2.根据权利要求1所述的一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，其特征在于：步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液和填料的质量比为1∶10～15。
3.根据权利要求1所述的一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物，其特征在于：所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
4.权利要求1所述的一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
以重量份计，将橄榄油3～10份，卵磷脂0.5～2.5份和聚乙二醇10～20份加入到匀质机中在10000-12000rpm下高速剪切，然后向其中加入金枪鱼胶原蛋白肽0.1～0.5份，环糊精改性透明质酸5～10份在300～400rpm下高速搅拌混匀，得到金枪鱼胶原蛋白肽的组合物；
所述环糊精改性透明质酸按照以下步骤制备得到：
将氨基环糊精、透明质酸和有机溶剂加入反应釜中，在搅拌下向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，升温至25～35℃，搅拌反应24～48小时，用分子量3500的透析袋透析，冻干，得到环糊精改性透明质酸；
所述氨基环糊精、透明质酸、有机溶剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量体积比为1～2g∶5～8g∶80～100ml∶1～1.5g；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；
所述金枪鱼胶原蛋白肽按照以下步骤制备得到：
①以重量份计，将100份金枪鱼粉加入到300～500份CaCl2水溶液中浸泡0.5～1小时，加入0.5～1份乳酸菌发酵液，在20～40℃发酵0.5～1小时，过滤，水洗，得到金枪鱼粉发酵物；
所述CaCl2水溶液的质量浓度为1～5％；
②将步骤①所得金枪鱼粉发酵物加入到100～200份水中，搅拌均匀，得到匀浆液，升温至40～60℃，加入碳酸钠调节pH至6～8，加入1～2份复合蛋白酶酶解10～18小时，得到酶解液，将所得酶解液升温至95～100℃，恒温20～30分钟，离心，得到第一上清液，将第一上清液减压浓缩至原来体积的1/6～1/4，加入100～200份乙醇沉淀，离心，得到第二上清液；将第二上清液减压浓缩至原来体积的1/15～1/20，得到金枪鱼胶原蛋白肽溶液；
所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1：2～5∶2～4∶1～3组成；
③将步骤②所得金枪鱼胶原蛋白肽溶液用凝胶柱分离纯化，选择填料为Sephadex LH-20，流动相为乙醇水溶液，收集洗脱液，冻干得到金枪鱼胶原蛋白肽；
所述乙醇水溶液为乙醇和水的体积比为1～5∶20。
5.权利要求1所述的一种基于金枪鱼胶原蛋白肽的组合物的应用，其特征在于：用于制备化妆品。
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