CN114129468B - 一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物及其应用 - Google Patents
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于日化产品领域，公开了一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物及其应用。该包括枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、黄芩多糖和南沙参多糖中的至少三种；通过上述五种多糖中的至少三种组分的协同作用，不仅可以减少肥大细胞个数，还可以升高抗菌肽；升高丝聚合蛋白；降低单核细胞趋化蛋白‑1和白细胞介素‑6从而达到改善皮肤免疫，抗炎美白的功效；还可以作为信息分子广泛参与细胞间配体与受体的相互识别，细胞间信号转导等生理过程，降低白细胞介素‑6表达因子的mRNA平均相对扩增倍数，可以很好的参与表皮细胞的分化及皮肤屏障的形成，从而具有巩固皮肤屏障功能；可用于制备化妆品。
Description
技术领域
本发明属于日化产品领域，具体涉及一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物及其应用。
背景技术
目前，市场上化妆品的种类繁多，功效各异，包括保湿化妆品、美白化妆品、祛痘化妆品等，但效果单一，保湿滋润度不够，不能防止皮肤老化，改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障；并且，有些美白化妆水添加含铅化合物、氢醌等违禁添加物，虽然短期内能使皮肤变白，但是长期使用会造成重金属积累，肌肤变得敏感，对皮肤造成刺激，使面部皮肤局部色素沉着，肤色暗黄。
皮肤保湿能力的好坏，能够反应出皮肤屏障功能的正常与否。皮肤保湿能力降低导致皮肤屏障功能下降，皮肤屏障功能下降又进一步降低皮肤保湿能力，造成恶性循环。所以保湿是皮肤护理的基础，也是关键。
因此，基于化妆品开发市场的需求，研制一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障的多糖组合物对于美白、保湿产品的研发也具有非常重要的意义。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种多糖组合物。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的多糖组合物的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供一种产品。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种多糖组合物，包括：枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、黄芩多糖和南沙参多糖中的至少三种。
优选地，所述多糖组合物包括：枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、黄芩多糖和南沙参多糖中的三种。
优选地，所述多糖组合物包括：(1)～(5)中任一种；
(1)枸杞多糖、玫瑰多糖和云芝多糖；
(2)黄芩多糖、南沙参多糖和云芝多糖；
(3)南沙参多糖、枸杞多糖和玫瑰多糖；
(4)黄芩多糖、云芝多糖和玫瑰多糖；
(5)黄芩多糖、枸杞多糖和南沙参多糖。
优选地，所述多糖组合物，以质量份计，包括：(6)～(10)中任一种；
(6)枸杞多糖0.5～1.5份、玫瑰多糖0.5～1.5份和云芝多糖0.5～1.5份；
(7)黄芩多糖0.5～1.5份、南沙参多糖0.5～1.5份和云芝多糖0.5～1.5份；
(8)南沙参多糖0.5～1.5份、枸杞多糖0.5～1.5份和玫瑰多糖0.5～1.5份；
(9)黄芩多糖0.5～1.5份、云芝多糖0.5～1.5份和玫瑰多糖0.5～1.5份；
(10)黄芩多糖0.5～1.5份、枸杞多糖0.5～1.5份和南沙参多糖0.5～1.5份。
优选地，所述多糖组合物，以质量份计，包括：(11)～(15)中任一种；
(11)枸杞多糖1份、玫瑰多糖1份和云芝多糖1份；
(12)黄芩多糖1份、南沙参多糖1份和云芝多糖1份；
(13)南沙参多糖1份、枸杞多糖1份和玫瑰多糖1份；
(14)黄芩多糖1份、云芝多糖1份和玫瑰多糖1份；
(15)黄芩多糖1份、枸杞多糖1份和南沙参多糖1份。
所述南沙参多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖和黄芩多糖可以市购获得，也可以分别以南沙参、枸杞、玫瑰、云芝和黄芩为原料提取得到。
优选地，所述玫瑰为玫瑰花苞。
优选地，所述提取的方式为醇提法和超声提取中的至少一种；进一步为醇提法。
优选地，所述南沙参多糖的制备方法为：1)对南沙参进行脱脂处理；2)将经脱脂处理后的南沙参进行多糖提取，得到粗多糖提取液；3)将粗多糖提取液进行固液分离，得到南沙参多糖水溶液，干燥，得到南沙参多糖。
优选地，所述南沙参多糖的制备方法为：取晒干之后的南沙参，除去有虫或变质部位，粉碎，取粉碎后的南沙参与体积分数为95％的乙醇溶液按料液比1：10(g:mL)混合，静置过夜，过夜后过滤得固体，加入纯化水(南沙参与纯化水的料液比为1：7.5(g:mL))，置于90℃恒温加热3h，用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到南沙参多糖水溶液，烘干，得到南沙参多糖。
优选地，所述枸杞多糖的制备方法为：1)对枸杞进行脱脂处理；2)将经脱脂处理后的枸杞进行多糖提取，得到粗多糖提取液；3)将粗多糖提取液进行固液分离，得到枸杞多糖水溶液，干燥，得到枸杞多糖。
优选地，所述枸杞多糖的制备方法为：取晒干之后的枸杞，除去有虫或变质部位，粉碎，取粉碎后的枸杞与体积分数为95％的乙醇溶液按料液比1：10(g:mL)混合，静置过夜，过夜后过滤得固体，加入纯化水(枸杞与纯化水的料液比为1：7.5(g:mL))，置于90℃恒温加热3h，用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到枸杞多糖水溶液，烘干，得到枸杞多糖。
优选地，所述玫瑰多糖的制备方法为：1)对玫瑰进行脱脂处理；2)将经脱脂处理后的玫瑰进行多糖提取，得到粗多糖提取液；3)将粗多糖提取液进行固液分离，得到玫瑰多糖水溶液，干燥，得到玫瑰多糖。
优选地，所述玫瑰多糖的制备方法为：取晒干之后的玫瑰花苞，除去有虫或变质部位，粉碎，取粉碎后的玫瑰与体积分数为95％的乙醇溶液按料液比1：10(g:mL)混合，静置过夜，过夜后过滤得固体，加入纯化水(玫瑰与纯化水的料液比为1：7.5(g:mL))，置于90℃恒温加热3h，用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到玫瑰多糖水溶液，烘干，得到玫瑰多糖。
优选地，所述云芝多糖的制备方法为：1)对云芝进行脱脂处理；2)将经脱脂处理后的云芝进行多糖提取，得到粗多糖提取液；3)将粗多糖提取液进行固液分离，得到云芝多糖水溶液，干燥，得到云芝多糖。
优选地，所述云芝多糖的制备方法为：取晒干之后的云芝，除去有虫或变质部位，粉碎，取粉碎后的云芝与体积分数为95％的乙醇溶液按料液比1：10(g:mL)混合，静置过夜，过夜后过滤得固体，加入纯化水(云芝与纯化水的料液比为1：7.5(g:mL))，置于90℃恒温加热3h，用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到云芝多糖水溶液，烘干，得到云芝多糖。
优选地，所述黄芩多糖的制备方法为：1)对黄芩进行脱脂处理；2)将经脱脂处理后的黄芩进行多糖提取，得到粗多糖提取液；3)将粗多糖提取液进行固液分离，得到黄芩多糖水溶液，干燥，得到黄芩多糖。
优选地，所述黄芩多糖的制备方法为：取晒干之后的黄芩，除去有虫或变质部位，粉碎，取粉碎后的黄芩与体积分数为95％的乙醇溶液按料液比1：10(g:mL)混合，静置过夜，过夜后过滤得固体，加入纯化水(黄芩与纯化水的料液比为1：7.5(g:mL))，置于90℃恒温加热3h，用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到黄芩多糖水溶液，烘干，得到黄芩多糖。
在本发明的多糖组合物中，
南沙参，桔梗科，其功效主要有调节免疫、抗氧化、清除自由基，可以增强皮肤抵抗力、美白、减轻日光造成的胶原蛋白崩解。南沙参以木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸为主的多聚体，具有清除羟基自由基，降低脂褐质含量的能力和较好的保湿能力。
枸杞的主要功效有抗氧化、保湿、抗氧化、延衰。因此，可使皮肤保湿、美白，延缓人体衰老。
玫瑰的功效主要有抗氧化、延衰、清除自由基。因此，可使皮肤保湿、美白，延缓人体衰老。
云芝的功效主要有有健脾利湿，清热解毒。因此，可使皮肤保湿、美白，延缓人体衰老，使皮肤弹性增加，柔软细嫩。
黄芩的功效主要有泻实火，除湿热，止血。因此，可使皮肤保持湿、美白，延缓人体衰老。
本发明的多糖组合物通过南沙参多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖和黄芩多糖中至少三种组分的协同作用，改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障来提升皮肤的美白、保湿效果。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的多糖组合物的应用。
优选地，本发明第一方面的多糖组合物在(a1)～(a7)中任一种的应用；
(a1)制备化妆品；
(a2)制备降低表皮厚度的产品；
(a3)制备提高抗菌肽表达量的产品；
(a4)制备降低单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达量的产品；
(a5)制备提高丝聚合蛋白(FLG)表达量的产品；
(a6)制备降低白介素-6(IL-6)表达量的产品；
(a7)制备降低肥大细胞数量的产品。
优选地，所述抗菌肽为Cathelicidin抗菌肽(CAMP)。
本发明所述的化妆品是按照一定剂型要求制成的制剂，主要是指通过涂抹于皮肤表面或者通过其他方式作用于生物体以使皮肤获得改善皮肤免疫、巩固皮肤屏障功能的效果。所述的化妆品可以为凝胶、洁面乳、化妆水、精华液、面霜、乳液和润肤露等，但不局限于此。
本发明的第三个方面，提供一种产品，包含本发明第一方面的多糖组合物。
优选地，一种化妆品，包含本发明第一方面的多糖组合物及辅料。
所述辅料为防腐剂、螯合剂、香精、保湿剂、着色剂、乳化剂、抗氧化剂和皮肤调理剂中的至少一种。
所述的化妆品可以为凝胶、洁面乳、化妆水、精华液、面霜、乳液和润肤露等，但不局限于此。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种多糖组合物，包括枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、黄芩多糖和南沙参多糖中的至少三种；通过南沙参多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖和黄芩多糖中至少三种组分的协同作用，不仅可以减少肥大细胞个数，还可以升高抗菌肽(CAMP)；升高丝聚合蛋白(FLG)；降低单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-6(IL-6)从而达到改善皮肤免疫，抗炎美白的功效；还可以作为信息分子广泛参与细胞间配体与受体的相互识别，细胞间信号转导等生理过程，降低白细胞介素-6(IL-6)表达因子的mRNA平均相对扩增倍数，可以很好的参与表皮细胞的分化及皮肤屏障的形成，从而具有巩固皮肤屏障功能；可用于制备化妆品。
附图说明
图1是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠背部皮肤后表皮皮肤图。
图2是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠背部皮肤后PASI评分结果图。
图3是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠背部皮肤后表皮厚度结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图4是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠耳部皮肤后表皮厚度结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图5是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠后抗菌肽(CAMP)含量结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图6是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠后单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图7是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠后丝聚合蛋白(FLG)含量结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图8是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠后白介素-6(IL-6)含量结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图9是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠后白介素-6(IL-6)mRNA结果图。
图10是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠后背部皮肤采用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)染色后的结果图：其中，A是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠后背部皮肤采用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)染色后的直观图；B是动物实验1中不同多糖组合物处理小鼠后背部皮肤采用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)染色后肥大细胞的统计结果图。
图11是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠背部皮肤后表皮皮肤图。
图12是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠背部皮肤后PASI评分结果图。
图13是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠背部皮肤后表皮厚度结果图：其中，A是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠背部皮肤后染色图；B是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠背部皮肤后表皮厚度统计结果图；####表示“与空白组相比，p＜0.05”；****表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图14是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠后抗菌肽(CAMP)含量结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图15是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠后单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图16是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠后丝聚合蛋白(FLG)含量结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图17是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠后白介素-6(IL-6)含量结果图：其中，###表示“与空白组相比，p＜0.05”；***表示“与模型组相比，p＜0.05”。
图18是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠后背部皮肤采用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)染色后的结果图：其中，A是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠后背部皮肤采用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)染色后的直观图；B是动物实验2中不同多糖组合物处理小鼠后背部皮肤采用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)染色后肥大细胞的统计结果图；####表示“与空白组相比，p＜0.05”；****表示“与模型组相比，p＜0.05”。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本实施例中未注明的实验方法，均为常规实验方法。本实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料，所述水可以为去离子水、纯化水或蒸馏水。
本实施例中的南沙参多糖的制备方法如下：取南沙参打粉，称取20g加入蓝口瓶，并加入200mL体积分数为95％的乙醇溶液，密闭静置过夜；将过夜后的南沙参乙醇混合物过滤，向南沙参过滤物中加入150mL纯化水，并置于90℃恒温水浴锅恒温加热3h；将南沙参纯化水混合物用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到南沙参多糖水溶液，并将溶液浓缩至50mL左右，将南沙参多糖溶液摇匀，用移液枪取2mL溶液于离心管中，将离心管置于70℃烘箱中烘干，最终得到南沙参多糖。
本实施例中的枸杞多糖的制备方法如下：取枸杞打粉，称取20g加入蓝口瓶，并加入200mL体积分数为95％的乙醇溶液，密闭静置过夜；将过夜后的枸杞乙醇混合物过滤，向枸杞过滤物中加入150mL纯化水，并置于90℃恒温水浴锅恒温加热3h；将枸杞纯化水混合物用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到枸杞多糖水溶液，并将溶液浓缩至50mL左右，将枸杞多糖溶液摇匀，用移液枪取2mL溶液于离心管中，将离心管置于70℃烘箱中烘干，最终得到枸杞多糖。
本实施例中的玫瑰多糖的制备方法如下：取玫瑰打粉，称取20g加入蓝口瓶，并加入200mL体积分数为95％的乙醇溶液，密闭静置过夜；将过夜后的玫瑰乙醇混合物过滤，向玫瑰过滤物中加入150mL纯化水，并置于90℃恒温水浴锅恒温加热3h；将玫瑰纯化水混合物用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到玫瑰多糖水溶液，并将溶液浓缩至50mL左右，将玫瑰多糖溶液摇匀，用移液枪取2mL溶液于离心管中，将离心管置于70℃烘箱中烘干，最终得到玫瑰多糖。
本实施例中的云芝多糖的制备方法如下：取云芝打粉，称取20g加入蓝口瓶，并加入200mL体积分数为95％的乙醇溶液，密闭静置过夜；将过夜后的云芝乙醇混合物过滤，向云芝过滤物中加入150mL纯化水，并置于90℃恒温水浴锅恒温加热3h；将云芝纯化水混合物用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到云芝多糖水溶液，并将溶液浓缩至50mL左右，将云芝多糖溶液摇匀，用移液枪取2mL溶液于离心管中，将离心管置于70℃烘箱中烘干，最终得到云芝多糖。
本实施例中的黄芩多糖的制备方法如下：取黄芩打粉，称取20g加入蓝口瓶，并加入200mL体积分数为95％的乙醇溶液，密闭静置过夜；将过夜后的黄芩乙醇混合物过滤，向黄芩过滤物中加入150mL纯化水，并置于90℃恒温水浴锅恒温加热3h；将黄芩纯化水混合物用300目滤袋过滤得悬浊液，静置2h后将悬浊液用双层中速定性离心纸过滤，得到黄芩多糖水溶液，并将溶液浓缩至50mL左右，将黄芩多糖溶液摇匀，用移液枪取2mL溶液于离心管中，将离心管置于70℃烘箱中烘干，最终得到黄芩多糖。
实施例1一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物(复配1组)
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物，包括以下质量份的组分：枸杞多糖1份、玫瑰多糖1份、云芝多糖1份。
实施例2一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物(复配2组)
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物，包括以下质量份的组分：黄芩多糖1份、南沙参多糖1份、云芝多糖1份。
实施例3一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物(复配3组)
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物，包括以下质量份的组分：南沙参多糖1份、枸杞多糖1份、玫瑰多糖1份。
实施例4一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物(复配4组)
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物，包括以下质量份的组分：云芝多糖1份、玫瑰多糖1份、黄芩多糖1份。
实施例5一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物(复配5组)
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物，包括以下质量份的组分：枸杞多糖1份、南沙参多糖1份、黄芩多糖1份。
对比例1一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖物质
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖物质，包括以下质量份的组分：玫瑰多糖1份。
对比例2一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖物质
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖物质，包括以下质量份的组分：云芝多糖1份。
对比例3一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖物质
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖物质，包括以下质量份的组分：枸杞多糖1份。
对比例4一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物，包括以下质量份的组分：玫瑰多糖1份、云芝多糖1份。
对比例5一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物，包括以下质量份的组分：枸杞多糖1份、云芝多糖1份。
对比例6一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物，包括以下质量份的组分：枸杞多糖1份、玫瑰多糖1份。
应用实施例
一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的乳液，包括以下组分：角鲨烷3.9g、Montanov S 2.1g、甘油2.4g、尼泊金乙酯0.03g、实施例1中的多糖组合物1.2g、蒸馏水加至30g。
效果实施例1
分别取实施例1～5、对比例1～6的多糖组合物/物质溶于丙二醇，得到具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的制剂(制剂中枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、南沙参多糖、黄芩多糖的浓度均为0.5％(w/v))。
1.动物实验1
选取一批形态正常、体重相近的BALB/c小鼠(动物批号：SCXK(粤)2016-0041)。BALB/c小鼠在实验前适应性饲养7天；小鼠背部利用九合水硫化钠脱毛2cm*4cm，小鼠脱毛时为D0；分别进行如下处理，每种处理重复10次：
空白组：正常饲养，D8开始，在背部脱毛处涂抹100μL丙二醇，在右耳部(内外)涂抹25μL丙二醇，每天1次，共9天。
模型组：D3开始，在背部脱毛处涂抹0.15％(w/v)DNFB(用体积比为3:1的丙酮橄榄油配制)100μL，右耳部(内外)涂抹0.15％(w/v)DNFB(用体积比为3:1丙酮橄榄油配制)25μL，D7再涂一次，共两次；D10开始激发，背部涂抹0.2％DNFB 100μL，D13再涂一次，共两次，制成特应性皮炎模型；D8开始，在背部脱毛处涂抹100μL丙二醇，在右耳部(内外)涂抹25μL丙二醇，每天1次，共9天。
阳性组：D3开始，在背部脱毛处涂抹0.15％DNFB(用体积比为3:1丙酮橄榄油配制)100μL，右耳部(内外)涂抹0.15％DNFB(w/v)(用体积比为3:1丙酮橄榄油配制)25μL，D7再涂一次，共两次；D10开始激发，背部涂抹0.2％DNFB(w/v)100μL，D13再涂一次，共两次，制成特应性皮炎模型；D8开始，在背部脱毛处涂抹100μL 0.5％(w/v)泼尼松龙乳膏(广州铎洋生物科技有限公司)，在右耳部(内外)涂抹25μL 0.5％泼尼松龙乳膏，每天1次，共9天。
给药组：D3开始，在背部脱毛处涂抹0.15％(w/v)DNFB(用体积比为3:1丙酮橄榄油配制)100μL，右耳部(内外)涂抹0.15％(w/v)DNFB(用体积比为3:1丙酮橄榄油配制)25μL，D7再涂一次，共两次；D10开始激发，背部涂抹0.2％(w/v)DNFB 100μL，D13再涂一次，共两次，制成特应性皮炎模型；D8开始，在背部脱毛处涂抹100μL具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的制剂(实施例1～5(复配1～复配5)、对比例1～6)，在右耳部(内外)涂抹25μL0.5％(w/v)具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的制剂，每天1次，共9天。
D16给药结束，处死老鼠前眼球取血，于室温下静置2h，1000g室温离心5min，取血清保存于-80℃环境中；颈部脱臼处死小鼠，于实验部位的背部皮肤取1cm2分成2份，一份用4％多聚甲醛固定，另一份置于-80℃冰箱保存；分别取其左耳和右耳(非测试耳和测试耳)，分别打出8mm直径圆耳片分别称重记录重量后再用4％多聚甲醛固定。分别对抑制率、小鼠背部皮肤状况；PASI评分；小鼠背部皮肤表皮层厚度；小鼠耳部皮肤表皮层厚度；抗菌肽(CAMP)；MCP-1；FLG；白细胞介素-6(IL-6)；由甲苯胺蓝染色的肥大细胞个数；白细胞介素-6(IL-6)表达因子的mRNA平均相对扩增倍数进行检测(方法参见文献：Anti-allergiceffects of novel sulfated polysaccharide sacran on mouse model of 2,4-Dinitro-1-fluorobenzene-induced atopic dermatitis,International Journal ofBiological Macromolecules,Volume 108,March 2018,Pages 112-118)。
抑制率的计算公式为：抑制率＝(WDNFB-W给药)/(WDNFB-W空白)*100％，其中，WDNFB为模型组小鼠8mm直径圆耳片重量；W给药为给药组小鼠8mm直径圆耳片重量；W空白为空白组小鼠8mm直径圆耳片重量。结果如表1所示：实施例提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以抑制小鼠耳朵肿胀，抑制率排序为：复配4>复配5>阳性>复配3>复配1>复配2，表明：实施例提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以抑制特应性皮炎。
表1不同实施例提供的多糖组合物对抑制率的影响
| 排序-递减 | 组别 | 抑制率(I，％) |
| 1 | 复配4 | 132.4324 |
| 2 | 空白 | 100 |
| 3 | 复配5 | 73.51351 |
| 4 | 阳性 | 69.18919 |
| 5 | 复配3 | 68.10811 |
| 6 | 复配1 | 30.27027 |
| 7 | 复配2 | 21.62162 |
| 8 | 模型 | 0 |
D16小鼠背部皮肤状况如图1所示：实施例提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以抑制特应性皮炎，抑制效果如下：复配4>复配5>阳性>复配3>复配1>复配2。
从D8开始观察各组小鼠每天的皮损变化情况，依据PASI评分标准评分，观察各组小鼠每天的背部皮损变化情况，依据PASI评分标准给予小鼠皮损处红斑(erythema)、鳞屑(scales)和浸润增厚程度(thickness)给予0～4的积分：0，无；1，轻度；2，中度；3，重度；4，极重度，将三者积分相加得到总积分(0～12)，对各组小鼠积分取平均值后绘制趋势线，结果如图2所示：实施例提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以减弱小鼠皮损，具体效果如下：阳性>复配4>复配5>复配2>复配1>复配3。
小鼠背部皮肤表皮层厚度测量结果如图3所示：与模型组相比，实施例1～3提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以显著降低小鼠背部表皮层厚度，效果优于阳性组(泼尼松龙乳膏)；尤其，实施例1提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物相对模型组降低的厚度(0.81-0.38＝0.43cm)高于各组分(对比例1～3)相对模型组降低的厚度之和(0.13-0.07+0.2＝0.26cm)，表明实施例1提供的多糖组合物中各组分在降低背部皮肤表皮层厚度方面具有协同增效的作用。
小鼠耳部皮肤表皮层厚度测量结果如图4所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以降低小鼠耳部表皮层厚度，效果优于阳性组(泼尼松龙乳膏)；其中，实施例1～3提供的多糖组合物可以显著降低小鼠耳部表皮层厚度。
采用ELISA试剂盒(江苏酶标生物MB-6350A)检测血清中抗菌肽(CAMP)含量(具体方法参见说明书)，结果如图5所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以提高抗菌肽(CAMP)含量(其中，实施例1～3可以显著提高抗菌肽含量)，尤其，实施例1提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物相对模型组抗菌肽(CAMP)增加的含量(38.59-22.7＝15.89ng/mL)高于各组分(对比例1～3)相对模型组抗菌肽(CAMP)增加的含量之和及某组分(对比例1～3)和剩余组分(对比例4～6)相对模型组抗菌肽(CAMP)增加的含量之和，表明实施例1提供的多糖组合物中各组分在提高抗菌肽(CAMP)含量方面具有协同增效的作用。
采用ELISA试剂盒(江苏酶标生物MB-6161A)检测血清中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量(具体方法参见说明书)，结果如图6所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以显著降低单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量，尤其实施例1～3、5提供的多糖组合物的效果优于阳性组(泼尼松龙乳膏)。
采用ELISA试剂盒(江苏酶标生物MB-5912A)检测血清中丝聚合蛋白(FLG)含量(具体方法参见说明书)，结果如图7所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以提高丝聚合蛋白(FLG)含量，其中，实施例1、3～5提供的多糖组合物可以显著提高丝聚合蛋白(FLG)含量，尤其，实施例1提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物相对模型组丝聚合蛋白(FLG)增加的含量(10.27-5.52＝4.75ng/mL)高于各组分(对比例1～3)相对模型组丝聚合蛋白(FLG)增加的含量之和及某组分(对比例1～3)和剩余组分(对比例4～6)相对模型组丝聚合蛋白(FLG)增加的含量之和，表明实施例1提供的多糖组合物中各组分在提高丝聚合蛋白(FLG)含量方面具有协同增效的作用。
采用ELISA试剂盒(江苏酶标生物MB-2899A)检测血清中白介素-6(IL-6)含量，结果如图8所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以显著降低白介素-6(IL-6)含量，且效果优于阳性组(泼尼松龙乳膏)。
采用实时荧光定量PCR检测血清中白介素-6(IL-6)mRNA含量：使用总RNA 提取试剂盒(购自Servicebio货号：G3013)从小鼠皮肤组织中提取mRNA，测定RNA 含量、纯度符合要求；使用反转录试剂盒合成cDNA；以GADPH作为内参基因，IL-6引物由广州赛维尔生物科技有限公司合成(M-Il6-S：CCCCAATTTCCAATGCTCTCC，SEQ ID NO.1；M-Il6-A：CGCACTAGGTTTGCCGAGTA，SEQ ID NO.2)，根据2-ΔΔCt算法进行各组mRNA 表达量检测，结果如图9所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以降低白介素-6(IL-6)mRNA表达量，尤其，实施例2、4、5提供的多糖组合物的效果优于阳性组(泼尼松龙乳膏)。
采用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)对小鼠背部皮肤进行染色，结果如图10所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以降低肥大细胞数量(其中实施例1、2提供的多糖组合物可以显著降低)，尤其，实施例1～3、5提供的多糖组合物的效果优于阳性组(泼尼松龙乳膏)。
2.动物实验2
选取一批形态正常、体重相近的雄性BALB/c小鼠(动物批号：SCXK(粤)2016-0041)。小鼠适应性喂养7天后，小鼠背部剃毛约2cm*2cm，2％硫化钠脱毛，使绒毛充分脱掉，背部充分裸露，小鼠脱毛为D0；分别进行如下处理，每种处理重复10次：
空白组：正常饲养，D1开始，空白组用水润湿的棉球浸润60s，水处理小鼠90min后，涂抹200μL丙二醇，一天2次，为期7天。
模型组：D1开始，小鼠用体积比为1:1的丙酮乙醚混合液棉球浸润30s，随后蒸馏水浸润30s，丙酮乙醚混合液处理小鼠90min后，涂抹200μL丙二醇，一天2次，为期7天。
阳性组：D1开始，小鼠用体积比为1:1的丙酮乙醚混合液棉球浸润30s，随后蒸馏水浸润30s，丙酮乙醚混合液处理小鼠90min后，涂抹200μL0.5(w/v)％的透明质酸，一天2次，为期7天。
给药组：D1开始，小鼠用体积比为1:1的丙酮乙醚混合液棉球浸润30s，随后蒸馏水浸润30s，丙酮乙醚混合液处理小鼠90min后，涂抹200μL具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的制剂(实施例1～5(复配1～复配5)、对比例1～6)，一天2次，为期7天。
D7给药结束，处死老鼠前眼球取血，于室温下静置2h，1000g室温离心5min，取血清保存于-80℃环境中；颈部脱臼处死小鼠，于实验部位的背部皮肤取1cm2分成2份，一份用4％多聚甲醛固定，另一份置于-80℃冰箱保存。分别对小鼠背部皮肤状况；PASI评分；小鼠背部皮肤表皮层厚度；抗菌肽(CAMP)；MCP-1；FLG；白细胞介素-6(IL-6)；由甲苯胺蓝染色的肥大细胞个数；白细胞介素-6(IL-6)表达因子的mRNA平均相对扩增倍数进行检测(方法参见文献：Itch-Associated Response Induced by Experimental Dry Skin in Mice,Japanese Journal of Pharmacology,Volume 88,Issue 3,2002,Pages 285-292)。
D7小鼠背部皮肤状况如图11所示：与模型组相比，实施例3～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以缓解皮肤干燥，脱皮等症状，效果优于阳性组。
从D7开始观察各组小鼠的皮损变化情况，依据PASI评分标准评分，结果如图12所示：实施例提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以减弱小鼠皮损，具体效果如下：阳性>复配4>复配5>复配2>复配1>复配3。
小鼠背部皮肤表皮层厚度测量结果如图13所示：与模型组相比，实施例2～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以显著降低小鼠背部表皮层厚度，效果优于阳性组。
采用ELISA试剂盒(江苏酶标生物MB-6350A)检测血清中抗菌肽(CAMP)含量(具体方法参见说明书)，结果如图14所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以提高抗菌肽(CAMP)含量，且效果优于阳性组；其中，实施例1～3提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以显著提高抗菌肽(CAMP)含量，尤其，实施例1提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物相对模型组抗菌肽(CAMP)增加的含量(43-18.51＝24.49ng/mL)高于各组分(对比例1～3)相对模型组抗菌肽(CAMP)增加的含量之和及某组分(对比例1～3)和剩余组分(对比例4～6)相对模型组抗菌肽(CAMP)增加的含量之和，表明实施例1提供的多糖组合物中各组分在提高抗菌肽(CAMP)含量方面具有协同增效的作用。
采用ELISA试剂盒(江苏酶标生物MB-6161A)检测血清中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量(具体方法参见说明书)，结果如图15所示：与模型组相比，实施例1提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以降低单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量，且效果优于阳性组；而实施例1提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物中各组分或者两两组分组成的组合物相对模型组均提高单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量，表明实施例1提供的多糖组合物中各组分在降低单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量方面取得了意料不到的技术效果。
采用ELISA试剂盒(江苏酶标生物MB-5912A)检测血清中丝聚合蛋白(FLG)含量(具体方法参见说明书)，结果如图16所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以提高丝聚合蛋白(FLG)含量，其中，实施例1～3提供的多糖组合物可以显著提高丝聚合蛋白(FLG)含量，尤其，实施例1提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物相对模型组丝聚合蛋白(FLG)增加的含量(13.93-9.18＝4.75ng/mL)高于各组分(对比例1～3)相对模型组丝聚合蛋白(FLG)增加的含量之和及某组分(对比例1～3)和剩余组分(对比例4～6)相对模型组丝聚合蛋白(FLG)增加的含量之和，表明实施例1提供的多糖组合物中各组分在提高丝聚合蛋白(FLG)含量方面具有协同增效的作用。
采用ELISA试剂盒(江苏酶标生物MB-2899A)检测血清中白介素-6(IL-6)含量(具体方法参见说明书)，结果如图17所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以降低白介素-6(IL-6)含量，其中，实施例1～3提供的多糖组合物可以显著降低白介素-6(IL-6)含量，且效果优于阳性组。
采用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)对小鼠背部皮肤进行染色，结果如图18所示：与模型组相比，实施例1～5提供的具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物可以显著降低肥大细胞数量，且效果优于效果优于阳性组。
设DNFB动物实验(动物实验1)9个指标以及丙酮乙醚皮肤干燥实验(动物实验2)7个指标的权重相等，对两实验指标的结果分别进行排序，其中为MCP-1、IL-6、背部皮肤厚度、耳朵皮肤厚度和抑制率为升序，FLG、CAMP、皮肤评分和肥大细胞个数为降序，将各实验数据的排名相加得到总加权分，总加权分越低的植物多糖复配对小鼠的综合治疗效果越好。结果如表2所示。
根据总加权分以及Elisa实验说明多糖组合物复配1对皮肤症状的疗效好于多糖单体以及两种多糖单体组合物，最终确定复配1：枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖，效果最佳。
表2动物实验1及动物实验2结果汇总
效果实施例2
1.人体感官测试
本测试选用应用实施例制备得到的乳液；以及应用实施例的辅料(即应用实施例中乳液除实施例1中的多糖组合物的其他组分组合)作为对照品，验证本实施例中添加的多糖组合物的产品是否具有显著的保湿功效和改善皮肤的功能。
实验方法：实验前。挑选18名受试者年龄均在20～22周岁，皮肤类型均为混合耐受型皮肤，无过敏体质，试验部位没有接受过皮肤治疗，美容以及其他可能影响结果的测试。受试者双手前臂外侧做好测量区域标记，区域间隔1cm。作为手臂测试，在手臂前侧的两个5cm x 5cm的固定区域内，选取一个作样品区(应用实施例的乳液)，一个作对照样品区，每隔一小时测试一次皮肤角质层的水分含量；本实验的测试条件为温度20～22℃、湿度50～55％。
皮肤角质层水分含量数据如表3所示：皮肤角质层水分含量越高说明产品的补水效果越好：由表3数据可见，对照品的水分含量最低，说明其补水效果最差。应用实施例的水分含量显著高于对照品，证明其补水效果显著。因此，本发明应用实施例的乳液具有显著的保湿性能。
表3
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 无限极（中国）有限公司
<120> 一种具有改善皮肤免疫，巩固皮肤屏障功能的多糖组合物及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccccaatttc caatgctctc c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcactaggt ttgccgagta 20
Claims (9)
1.一种多糖组合物，由以下质量份的组分组成：黄芩多糖0.5～1.5份、玫瑰多糖0.5～1.5份和云芝多糖0.5～1.5份。
2.根据权利要求1所述的多糖组合物，其特征在于，
所述多糖组合物由以下质量份的组分组成：黄芩多糖 1份、玫瑰多糖1份和云芝多糖 1份。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的多糖组合物，其特征在于，
所述黄芩多糖、玫瑰多糖和云芝多糖分别以黄芩、玫瑰和云芝为原料提取得到。
4.根据权利要求3所述的多糖组合物，其特征在于，
所述黄芩多糖的制备方法为：1）对黄芩进行脱脂处理；2）将经脱脂处理后的黄芩进行多糖提取，得到粗多糖提取液；3）将粗多糖提取液进行固液分离，得到黄芩多糖水溶液，干燥，得到黄芩多糖；或
所述玫瑰多糖的制备方法为：1）对玫瑰进行脱脂处理；2）将经脱脂处理后的玫瑰进行多糖提取，得到粗多糖提取液；3）将粗多糖提取液进行固液分离，得到玫瑰多糖水溶液，干燥，得到玫瑰多糖；或
所述云芝多糖的制备方法为：1）对云芝进行脱脂处理；2）将经脱脂处理后的云芝进行多糖提取，得到粗多糖提取液；3）将粗多糖提取液进行固液分离，得到云芝多糖水溶液，干燥，得到云芝多糖。
5.权利要求1～4中任一项所述的多糖组合物在制备化妆品中的应用。
6.权利要求1～4中任一项所述的多糖组合物在制备具有抑制特应性皮炎和/或巩固皮肤屏障功能的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述产品通过（a1）～（a6）中任一种抑制特异性皮炎和/或巩固皮肤屏障；
（a1）降低表皮厚度；
（a2）提高抗菌肽表达量；
（a3）降低单核细胞趋化蛋白-1表达量；
（a4）提高丝聚合蛋白表达量；
（a5）降低白介素-6表达量；
（a6）降低肥大细胞数量。
8.一种产品，包含权利要求1～4中任一项所述的多糖组合物。
9.一种化妆品，包含权利要求1～4中任一项所述的多糖组合物及辅料；
所述辅料为防腐剂、螯合剂、香精、保湿剂、着色剂、乳化剂、抗氧化剂和皮肤调理剂中的至少一种。
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