CN109806231A - 一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体提供了一种白藜芦醇‑固体脂质纳米粒的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用,其中白藜芦醇‑固体脂质纳米粒是利用乳化蒸发‑低温固化法得到,用于抑制LPS刺激的RAW264.7释放NO的产生,以及细胞中炎症因子TNF‑α,IL‑1β,IL‑6的产生。本发明以白藜芦醇为模型药物,制备方法简单,条件温和,且该纳米粒能够抑制LPS刺激的RAW264.7释放NO以及炎症因子TNF‑α,IL‑1β,IL‑6,并且在有效的抗炎浓度内没有细胞毒性,有效提高了白藜芦醇纳米药物在细胞水平治疗炎症的疗效,为开发新的天然抗炎药物纳米新剂型提供新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料和药物学交叉技术领域,具体为一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法和应用。
背景技术
炎症是机体对各种致炎因子所产生的防御反应,是最常见的病理过程。炎症发生的局部会产生一系列的复杂变化,临床上主要表现有红、肿、热、痛等功能障碍,同时炎症可引起全身反应,包括发热、嗜睡、肌肉蛋白质降解加速、凝血因子合成增多和末梢血白细胞数目的改变等。当机体受到致炎因子入侵时,会激活体内的单核细胞、巨噬细胞等合成和释放多种内源性生物活性物质,如前列腺素、一氧化氮、血管活性胺等,导致血管通透性增加,炎症细胞趋化,从而诱导炎症的发生。炎症本身是把双刃剑,一方面是机体最重要的保护性反应,当机体受到外界刺激时,炎症本身能够局限并消灭有害刺激,促进修复。但在某些情况下,炎症反应对机体也具有不同程度的危害,严重的炎症反应甚至可危及患者的生命。当机体免疫力下降或病原体数量多、毒力强的情况下,炎症反应会导致全身性的炎症反应综合征、脓毒血症、败血症等,更甚者引起多系统器官功能衰竭。控制过度炎症引起的损伤是近年来临床和基础医学研究的热点之一。
已知多种因素都可以引起炎症的发生,其中内毒素(endotoxin,ET)或细菌脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)是最常见的致炎因子,LPS可刺激体内单核巨噬细胞合成和释放多种炎性介质,导致机体一系列炎症级联反应,诱导炎症反应发生。LPS在革兰氏阴性菌感染的发病机理中发挥非常重要的作用,LPS可刺激机体细胞的形态和功能发生变化,从而导致机体细胞因子失控性表达。
白藜芦醇(Resveratrol,Res)是一种天然的非黄酮类多酚化合物,化学名为3,4,5-三羟基-反式-二苯乙烯,具有可利用的生物学活性。白藜芦分子式C14H12O3,相对分子质量228.25。白藜芦醇呈白色针状晶体,熔点256-257℃,261℃升华,难溶于水,易溶于极性溶剂如甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等。白藜芦醇主要广泛存在于藜芦、虎杖、葡萄、花生等多种食物和植物中。迄今为止的研究表明白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗自由基、心血管保护、免疫调节等多种生物学功能,具有极高的药学研究价值。其中,白藜芦醇的抗炎作用引起了人们的广泛兴趣。但由于白藜芦醇难溶于水,化学性质不稳定,使其在胃肠道的溶出和吸收差,口服具有肝脏首过效应,半衰期短,生物利用度低等缺点导致其应用受到限制。寻找有效途径提高白藜芦醇的生物利用度至关重要。基于纳米材料所发展的纳米复合制剂为炎症的治疗提供一种新的方法固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles,SLNs)是新型亚微粒胶体给药系统,主要适于包裹脂溶性药物,用作静脉注射或局部给药,还可作为靶向定位和控释作用的载体。SLNs作为药物传递系统载体,具有生物相容性好、可生物降解、载药能力强物理化学存储稳定、对靶器官有特异趋向性、成本低和利于大规模生产等优点,因此是极有发展前途的新型载药系统。因此,有必要开发一种含有白藜芦醇的固体脂质纳米粒,以提高白藜芦醇在生物体内的利用率。
发明内容
本发明的目的是为了针对现有技术的不足,提供一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法,以及该白藜芦醇-固体脂质纳米粒作为抗炎药物的应用,本发明以白藜芦醇作为模型药物,采用乳化蒸发-低温固化法制备白藜芦醇-固体脂质纳米粒,利用脂多糖LPS处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞建立炎症模型,提高了白藜芦醇纳米药物在细胞水平治疗炎症的疗效,为开发新的天然抗炎药物纳米新剂型提供新的方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种具有抗炎效果的白藜芦醇-固体脂质纳米粒的应用,具体是在制备抗炎药物中的应用。
优选的,抗炎药物在抑制RAW264.7细胞中NO的产生以及抑制TNF-α,IL-1β,IL-6的水平的作用。
本发明还保护上述白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法,包括以下步骤:
S1、将白藜芦醇、硬脂酸和卵磷脂按照3:4:2的质量比溶于有机溶剂中,得到有机相;
S2、将表面活性剂溶于水中,得到水相;
S3、将有机相注入搅拌中的入73~77℃中的水相中,浓缩得到半透明体系,然后将半透明体系与0~2℃的水按照1:2的体积比混合,边搅拌边混合,得到白藜芦醇-固体脂质纳米粒的胶体悬浊液;
S4、将S3得到的得到白藜芦醇-固体脂质纳米粒的胶体悬浊液多次离心,将离心产物于-80℃下进行冷冻干燥得到白藜芦醇-固体脂质纳米粒。
优选的,S1的有机溶剂为乙醇和丙酮按照1:1的体积比混合制得,所述S1中白藜芦醇和有机溶剂的体积比为15:1。
优选的,S2中表面活性剂为Myrj52,所述表面活性剂与水的加入比例为25mL:3mg。
优选的,S3中的搅拌速度为900~1100rpm。
优选的,S4中的离心过程为:将白藜芦醇-固体脂质纳米粒的胶体悬浊液在18000~22000rpm的离心速率下离心1.8~2.2h,然后去除上清液,加入去离子水再次得到悬浊液,并将悬浊液再次离心,离心后去除上清液得到离心产物。
优选的,S4中的冷冻干燥时间为18~36h。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
本发明以白藜芦醇作为模型药物,采用乳化蒸发-低温固化法制备白藜芦醇-固体脂质纳米粒,制备方法简单,条件温和,该纳米粒能够抑制LPS刺激的RAW264.7释放NO以及炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6,并且在有效的抗炎浓度内没有细胞毒性;同时利用脂多糖LPS处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞建立炎症模型,提高了白藜芦醇纳米药物在细胞水平治疗炎症的疗效,为开发新的天然抗炎药物纳米新剂型提供新的方法。
附图说明
图1是本发明实施例1的白藜芦醇-固体脂质纳米粒的TEM照片;
图2是本发明实施例1白藜芦醇-固体脂质纳米粒的粒径分布图;
图3是本发明实施例1白藜芦醇-固体脂质纳米粒的Zeta图;
图4是白藜芦醇、白藜芦醇-固体脂质纳米粒和固体脂质纳米粒的紫外图谱;
图5是白藜芦醇、白藜芦醇-固体脂质纳米粒和固体脂质纳米粒的红外图谱;
图6是白藜芦醇、白藜芦醇-固体脂质纳米粒和固体脂质纳米粒的XRD图谱;
图7A是本发明培养的贴壁1天后的未经LPS刺激的RAW264.7细胞,图7B为经LPS刺激24h后的RAW264.7细胞;
图8是白藜芦醇、白藜芦醇-固体脂质纳米和固体脂质纳米粒对RAW264.7细胞活力的影响图;
图9是MTT法检测不同浓度的白藜芦醇,白藜芦醇-固体脂质纳米粒对经LPS刺激的RAW264.7活力的影响图;
图10是激光共聚焦检测RAW264.7细胞对白藜芦醇,白藜芦醇-固体脂质纳米粒的吞噬效率图;
图11是白藜芦醇,白藜芦醇-固体脂质纳米粒抑制细胞炎症模型中的NO生成图;
图12为白藜芦醇-固体脂质纳米粒对RAW264.7细胞中炎症因子TNF-α水平的影响图;
图13为白藜芦醇-固体脂质纳米粒抑制RAW264.7细胞中炎症因子IL-6的产生图;
图14为白藜芦醇-固体脂质纳米粒抑制RAW264.7细胞中炎症因子IL-1β的产生图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式和附图对本发明进行详细描述。本发明的范围并不受限于该具体实施方式。本发明所用试剂和原料均市售可得或按文献方法制备。本发明中各物质对应的缩写词为:白藜芦醇-固体脂质纳米粒(Resveratrol-SLNs/Res-SLNs),白藜芦醇(Resveratrol/Res),固体脂质纳米粒(SLNs)。
实施例1
本实施例以LPS刺激小鼠RAW264.7细胞建立炎症细胞模型,硝酸还原酶法检测白藜芦醇-固体脂质纳米粒(Resveratrol-SLNs/Res-SLNs)对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞培养基上清液中NO含量,ELISA检测白藜芦醇-固体脂质纳米粒对RAW264.7巨噬细胞细胞炎症因子的影响。
其中,白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备过程为:取150mg的白藜芦醇(Res)、200mg的硬脂酸、100mg的卵磷脂,超声溶于5mL乙醇和5mL丙酮的混合溶剂中,构成有机相,转入具塞梨形瓶中。另取250mg的Myrj52溶于高纯水30mL中,构成水相。将有机相以6#针头注入1000rpm搅拌的(75±2)℃的水相,继续搅拌0.5h,使有机溶剂完全蒸发并使体系浓缩至5ml,得到半透明体系,将所得的半透明体系快速混于另一0~2℃的1000rpm搅拌的10mL的水中,继续搅拌2h,即得Resveratrol-SLNs的胶体悬混液。收取三口烧瓶中的反应产物,于20000rpm离心2h后,去除上清液后重新溶于去离子水中,然后再次于20000rpm下离心2h,去除上清液得到离心产物,将离心产物重新溶于去离子水中,于-40℃预冻过夜后后再经冻干机冻干24小时,得到白藜芦醇-固体脂质纳米粒(Resveratrol-SLNs)固体粉末。
其中,LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型的建立过程为:
RAW264.7细胞于完全DMEM高糖培养基中培养至对数生长期,以含1mmol/L EDTA0.25%胰蛋白酶溶液消化,用完DMEM高糖培养洗涤离心(1000r/min,5min,25℃),并调整细胞密度为1×105/mL,接种于96孔细胞培养板,每孔定容200μL。37℃、5%CO2培养箱培养24h后,加入LPS(终浓度1μg/mL)观察RAW264.7细胞的形态。
采用MTT法测定白藜芦醇和白藜芦醇-固体脂质纳米粒对巨噬细胞增殖的影响,以2.0×l04个/孔的浓度接种于96孔板中,每孔体积100μL。培养24h后细胞贴壁生长后,每组3孔重复。分别加入不同浓度(浓度分别为0.5μM,1μM,5μM,10μM)的单独药物和纳米复合制剂,培养24h后,每孔加入MTT溶液20μL,孵育4h后弃去上清液,每孔加入DMSO 150μL终止反应。将培养板水平振荡10min,使甲臢充分溶解,在酶标仪上于490nm波长测定光密度OD值。
通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞RAW264.7对白藜芦醇和纳米复合制剂的吞噬情况。将白藜芦醇和白藜芦醇-固体脂质纳米粒配置成一定浓度的悬液,取1mL材料溶液和100μL的FITC4℃避光过夜混合,次日取出,用PBS洗涤三次,避光备用。将传代三次后的RAW264.7细胞胰酶消化,配成悬液,将2mL含RAW264.7细胞悬液(约1.0×105个细胞)接种于激光共聚焦专用培养皿中,在37℃,5%CO2及饱和湿度的培养条件下培养24h,使细胞贴壁。将上述配置的悬液按终浓度5μM加入37℃培养条件下已预铺细胞的激光共聚焦专用培养皿中,激光共聚焦显微镜考察共孵育2h后RAW264.7细胞对单独药物和纳米复合制剂的吞噬情况。
通过硝酸还原酶法检测白藜芦醇和白藜芦醇-固体脂质纳米粒对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞培养基上清液中NO含量,取对数生长期的培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%FBS的DMEM培养基制成104个/ml单细胞悬液,以每孔1ml均匀接种于24孔板中,置37℃,5%CO2培养箱培养。待细胞24h贴壁良好后,丢掉旧培养基,用含10%FBS的DMEM培养基配成LPS和白藜芦醇和白藜芦醇-固体脂质纳米粒的相应混合液,使LPS终浓度分别为1μg/ml,药物终浓度为5μM,每个浓度设3个复孔。白藜芦醇和白藜芦醇-固体脂质纳米粒先和细胞预孵育2h,再加入LPS和药物共同孵育24h后,提取细胞培养基待用。
通过ELISA检测白藜芦醇-固体脂质纳米粒对RAW264.7巨噬细胞细胞炎症因子的影响,具体步骤为:(1)收集培养液:收集各组细胞培养液,4℃下500rpm离心10min,取上清;(2)取板条取出所需板条,不用的板条放入密封袋放回4℃保存;(3)加标准品在酶标板上设标准孔12个,浓度依次由高到低,每孔加标准品50μL,每个浓度做两个平行标准孔;(4)加样加样前使溶液充分混匀,分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL,然后再加待测样品10μL,轻轻晃动混匀;(5)温育严格按照说明书要求,按规定的温度和时间进行。用封板膜将ELISA板面密封后置于37℃恒温水浴箱内温育30min;(6)洗涤小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干或将微孔板在吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,应尽量避免漏液溢液现象,静置30秒后弃去,每次洗板的液体残留量不宜过多。如此重复5次,在吸水纸上拍干;(7)加酶每孔加入酶标试剂50μL,空白孔除外;(8)温育操作同(5);(9)洗涤操作同(6);(10)显色每孔先加入显色剂A 50μL,再加入显色剂B 50μL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15min,期间打开酶标仪机器开始预热;(11)终止每孔加终止液50μL,终止反应(此时蓝色立即转为黄色);(12)测定以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后0-5min内完成。
我们将实施例1得到的白藜芦醇-固体脂质纳米进行TEM测试、粒径分布以及Zeta电位测试、紫外测试、红外检测、XRD表征及包封率和载药量的测定,图1是白藜芦醇-固体脂质纳米的TEM照片,通过图1可以看出,采用乳化蒸发-低温固化的方法制备的白藜芦醇-固体脂质纳米颗粒呈球形或者类球形,外观比较平整,纳米载药球之间无粘连,粒径较为均一,平均粒径在40nm左右。
图2和图3是白藜芦醇-固体脂质纳米的粒径分布图和Zeta电位图,从图2看出,纳米粒的水合粒径为90nm,且所测得的粒径分布峰较窄,多分散性指数为0.25,从图3可以看出,白藜芦醇-固体脂质纳米表面带负电,Zeta电位值为-25.6mV,而Zeta电位值的绝对值越高,则粒子间的静电斥力越大,体系越不容易发生聚集,说明样品的储存稳定性较好。
图4是白藜芦醇,白藜芦醇-固体脂质纳米和固体脂质纳米粒(SLNs)的紫外图谱,图5是白藜芦醇,白藜芦醇-固体脂质纳米和固体脂质纳米粒的红外图谱,从图4可以看出,白藜芦醇在306nm处有特征吸收峰,固体脂质纳米粒在该波段无吸收,对白藜芦醇的特征吸收峰也不会产生干扰,白藜芦醇-固体脂质纳米粒在306nm处出现了明显的吸收峰,说明该复合材料中包载了白藜芦醇,且被包裹后化学结构并未发生改变。从图5可以看出,白藜芦醇在3300cm-1处是羟基的强吸收峰,在1447-1590cm-1处为苯环的特征吸收峰,在964cm-1处有很强的反式双键吸收峰,显示为反式白藜芦醇的特征化学键和分子结构。固体脂质纳米粒位于2920cm-1和2840cm-1可归属C-H的伸缩振动,在3300cm-1处是羟基的伸缩振动,Resveratrol-SLNs的红外图谱同时具有固体脂质纳米载体和白藜芦醇分子的特征峰,说明白藜芦醇被包裹到固体脂质纳米粒中。
图6是白藜芦醇、白藜芦醇-固体脂质纳米粒和固体脂质纳米粒的XRD图谱,从图6可以看出白藜芦醇药物粉末是以结晶形式存在,有多个明显的特征衍射峰。白藜芦醇-固体脂质纳米粒的图谱与固体脂质纳米粒相比大致相同,而与白藜芦醇相比,药物的特征衍射峰基本消失,这说明白藜芦醇在载体中的分散非常均匀,这种无定形的状态将有利于药物的缓释。
图7A是本发明培养的贴壁1天后的RAW264.7细胞,从图中看出,细胞贴壁紧固,细胞多为圆形,图7B为经LPS刺激24h后的细胞,细胞形态发生了改变,部分细胞体积明显增大,部分细胞伸出伪足、呈梭形,胞内颗粒增多。
图8是MTT法检测不同浓度的白藜芦醇、白藜芦醇-固体脂质纳米粒和固体脂质纳米粒对细胞生长的影响图,从图8看出,在0.5-5μM区间内,无论是单独药物组,还是白藜芦醇-固体脂质纳米粒处理组,RAW264.7细胞的增殖活力都没有受到明显的影响。而当白藜芦醇浓度增大到10μM的时候,细胞活力明显下降,单独药物处理组的细胞活力为60.4%,而白藜芦醇-固体脂质纳米粒处理组的细胞存活率为78.9%。
图9是MTT法检测不同浓度的白藜芦醇和白藜芦醇-固体脂质纳米粒对经LPS刺激后的Raw264.7细胞生长的影响图,从图9看出,1μg/mL的LPS和0.5,1,5μM的白藜芦醇均未对RAW264.7细胞生长造成显著影响。而当药物浓度达到10μM时,单独药物处理组的细胞活力为50.7%,而白藜芦醇-固体脂质纳米粒处理组的细胞存活率仅为61.7%。
图10是激光共聚焦检测RAW264.7细胞对白藜芦醇和白藜芦醇-固体脂质纳米粒的吞噬效率图,从图10看出,白藜芦醇和白藜芦醇-固体脂质纳米粒与RAW264.7细胞共培养2h后,白藜芦醇经固体脂质纳米粒包裹后,相比单独药物更容易被RAW264.7细胞所吞噬。
图11是白藜芦醇,白藜芦醇-固体脂质纳米粒抑制细胞炎症模型中的NO生成图,从图11看出,LPS1μg/ml作用细胞24h后,与对照组比,培养基中NO量从38.52±2.32μM增至65.5±2.56μM(P<0.01),说明此细胞炎症模型是成功的,可用于后续实验。LPS1μg/ml分别和5μM白藜芦醇,白藜芦醇-固体脂质纳米粒共同处理细胞24h后,无论是单独药物还是白藜芦醇-固体脂质纳米粒都能够明显抑制LPS诱导的NO合成释放,NO分泌量较LPS对照组相比分别降低了23.7%和37.7%。
图12为白藜芦醇-固体脂质纳米粒抑制RAW264.7细胞中炎症因子TNF-α的产生图,图13为白藜芦醇-固体脂质纳米粒抑制RAW264.7细胞中炎症因子IL-6的产生图,图14为白藜芦醇-固体脂质纳米粒抑制RAW264.7细胞中炎症因子IL-1β的产生图,从图12、图13和图14看出,LPS可明显上调TNF-α的表达。白藜芦醇处理后TNF-α表达量明显降低,当Res浓度为1μM时,其抑制率为39.2%,当浓度为5μM时,抑制率为49.6%,白藜芦醇-固体脂质纳米粒处理组相对于单独的白藜芦醇能够更明显的降低炎症因子的产生,当Res-SLNs浓度为1μM时,其抑制率为54.3%,当浓度为5μM时,抑制率为83.9%;LPS可显著上调IL-6的表达。当白藜芦醇浓度为1μM时,其抑制率为21.2%,当浓度为5μM时,抑制率为44.5%,白藜芦醇-固体脂质纳米粒处理组相对于单独的白藜芦醇能够更明显的降低IL-6的产生,当白藜芦醇-固体脂质纳米粒浓度为1μM时,其抑制率为41.3%,当浓度为5μM时,抑制率为75.9%。LPS可显著上调IL-1β的表达。白藜芦醇能在一定程度降低IL-1β的表达。当Res浓度为1μM时,其抑制率为37.1%,当浓度为5μM时,抑制率为51.1%,白藜芦醇-固体脂质纳米粒处理组相对于单独的白藜芦醇能够更明显的降低IL-1β的产生,当Res-SLNs浓度为1μM时,其抑制率为62.6%,当浓度为5μM时,抑制率为77.6%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和补充,这些改进和补充应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的应用,其特征在于,所述白藜芦醇-固体脂质纳米粒在制备抗炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的应用,其特征在于,所述抗炎药物在抑制RAW264.7细胞中NO的产生以及抑制TNF-α,IL-1β,IL-6的水平的作用。
3.根据权利要求1所述的一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法,包括以下步骤:
S1、将白藜芦醇、硬脂酸和卯磷脂按照3:4:2的质量比溶于有机溶剂中,得到有机相;
S2、将表面活性剂溶于水中,得到水相;
S3、将有机相加入73~77℃中的水相中,边搅拌边加入,浓缩得到半透明体系,然后将半透明体系与0~2℃的水按照1:2的体积比混合,边搅拌边混合,得到白藜芦醇-固体脂质纳米粒的胶体悬浊液;
S4、将S3得到的得到白藜芦醇-固体脂质纳米粒的胶体悬浊液多次离心,将离心产物于-80℃下进行冷冻干燥得到白藜芦醇-固体脂质纳米粒。
4.根据权利要求3所述的一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法,其特征在于,所述S1的有机溶剂为乙醇和丙酮按照1:1的体积比混合制得,所述S1中白藜芦醇和有机溶剂的体积比为15:1。
5.根据权利要求3所述的一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法,其特征在于,所述S2中表面活性剂为Myrj52,所述表面活性剂与水的加入比例为25mL:3mg。
6.根据权利要求3所述的一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法,其特征在于,所述S3中的搅拌速度为900~1100rpm。
7.根据权利要求3所述的一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法,其特征在于,所述S4中的离心过程为:将白藜芦醇-固体脂质纳米粒的胶体悬浊液在18000-22000rpm的离心速率下离心1.8h~2.2h,然后去除上清液,加入去离子水再次得到悬浊液,并将悬浊液再次离心,离心后去除上清液得到离心产物。
8.根据权利要求3所述的一种白藜芦醇-固体脂质纳米粒的制备方法,其特征在于,所述S4中的冷冻干燥时间为18~36h。
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2019
- 2019-03-11 CN CN201910182104.1A patent/CN109806231A/zh active Pending
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