CN109799304A - 一种尿液样本中多种沙坦类降压药的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿液样本中多种沙坦类降压药的检测方法，所述检测方法采用液相色谱仪‑质谱仪联用对尿液中沙坦类降压药进行检测，所述检测方法包括：尿液样本前处理，液相色谱仪‑质谱仪参数优化，尿液样本检测；本发明提供的检测方法克服了现有技术中的检测方法无法实现同时检测尿液样本中多种沙坦类药物的缺陷，为尿液样本中多种沙坦类药物的检测提供了简便的检测方法。本发明提供的检测方法操作简便、精准度高，可同时判断尿液中是否存在多种沙坦类降压药。
Description
技术领域
本发明涉及尿液样本检测领域，尤其涉及涉及一种尿液样本中多种沙坦类降压药的检测方法。
背景技术
沙坦类降压药是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂的简称。血管紧张素Ⅱ有很强的生理活性，包括：1、直接收缩血管平滑肌；2、刺激肾上腺皮质球状带分泌醛固酮，醛固酮又使水钠潴留增加；3、维护交感神经活性。沙坦类能阻断各种途径产生的所有紧张素Ⅱ与其特殊受体的结合，从而减弱或者阻断其升压作用。
沙坦类药物对心、脑和肾脏都有良好的器官保护作用，已有一系列大规模临床试验证明，合并有心力衰竭、糖尿病、肾脏疾病和左心室肥厚的患者服用本药时，不但能降低血压，还能使上述并发症得到有效防治。这类药物疗效肯定、不良反应少，被认为是所有降压药中最安全的，能被绝大多数各种年龄和不同血压水平的高血压患者所接受。
沙坦类降压药和其他主要降压药物都可联合应用，而且两种或更多的不同种类降压药物互相配合符合降压药物的应用原则，值得提倡。
但沙坦类降压药物的检测一直存在着检测比较繁琐的问题，目前的检测方法是一次只能检测一种降压药物，导致检测量大、检测繁琐的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种尿液样本中多种沙坦类药物的检测方法，采用的技术方案如下：
本发明提供一种尿液样本中多种沙坦类降压药的检测方法，所述检测方法采用液相色谱仪-质谱仪联用对尿液中沙坦类降压药进行检测，所述检测方法包括：尿液样本前处理，液相色谱仪-质谱仪参数优化，尿液样本检测；
所样本前处理过程如下：将尿液样本与有机酸溶液混合，后转移至含有蛋白质沉淀剂的离心管中，离心，获取尿液样本上清液。
具体地，所述有机酸溶液为质量浓度为1-5%的甲酸水溶液，所述蛋白质沉淀剂为有机醇，所述有机酸溶液体积与所述尿液样本体积比不小于3。
优选地，所述有机酸溶液为2%的甲酸水溶液，所述有机醇为甲醇。
具体地，所述离心条件如下：转速范围为10000-15000转/分钟，离心时间3-10分钟，离心温度2-8℃。
具体地，所述液相色谱仪-质谱仪参数优化条件如下：
质谱仪参数优化条件如下：
检测方式：多反应监测MRM；
扫描方式：正离子扫描；
离子喷雾电压：4000-5500 V；
气帘气：10-40 Psi；
雾化气：50-60 Psi；
辅助气：50-60 Psi；
离子源温度：500-600℃；
碰撞气种类：N2；
碰撞气压力：8-12MPa；
液相色谱仪参数优化条件如下：
流动相：流动相A为有机酸水溶液，流动相B为甲酸甲醇溶液；
洗脱条件：梯度洗脱；
流速：0.8-1.0 mL/min；
进样量：1-10 μL；
优选地，所述质谱仪参数优化条件如下：
检测方式：多反应监测MRM；
扫描方式：正离子扫描；
离子喷雾电压：5500 V；
气帘气：20 Psi；
雾化气：55 Psi；
辅助气：55 Psi；
离子源温度：550℃；
碰撞气种类：N2；
碰撞气压力：10 MPa；
所述液相色谱仪参数优化条件如下：
流动相：流动相A为质量浓度为0.05-1%的甲酸水溶液；流动相B为甲酸甲醇溶液；
所述梯度洗脱包括如下三个阶段：
第一阶段，起始流动相比例：流动相A：流动相B的比例范围为90:10至99:1；
第二阶段，流动相比例：流动相A：流动相B的比例范围为25:75至15:85；
第三阶段，流动相比例：流动相A：流动相B的比例范围为90:10至99:1，至结束；
流速：0.8-1.0 mL/min；
进样量：1-10 μL；
优选地，所述梯度洗脱条件如下：
起始流动相比例，流动相A:流动相B=99:1；
步骤①：流动相A:流动相B=99:1，保持时间不小于0.5min；
步骤②：在时间不小于5min内，使得流动相比例由流动相A:流动相B=99:1匀速上升至流动相A:流动相B=20:80；
步骤③：流动相A:流动相B=20:80，保持时间不小于5.0 min；
步骤④：2min内，使得流动相比例由流动相A:流动相B=20:80匀速下降至流动相A:流动相B=99:1；
步骤⑤：流动相A:流动相B=99:1，保持时间不小于0.5min。
优选地，所述液相色谱仪的型号为Agilent 1100、Agilent 1200、Agilent 1260、Agilent 1290、岛津 LC-20A和岛津 LC-30A中的一种；所述液相色仪采用的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18、Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18和Agilent ZORBAX SB-C18中的一种。
具体地，所述液相色谱柱的柱温范围为25-50℃。
优选地，所述质谱仪的型号为API 4000、API 3200、API 5000、QTRAP 4500、QTRAP5500和QTRAP 6500中的一种，其中，所述质谱仪使用的离子源为电喷雾离子源。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明提供的检测方法克服了现有技术中的检测方法无法实现同时检测尿液样本中多种沙坦类药物的缺陷，为尿液样本中多种沙坦类药物的检测提供了简便的检测方法。本发明的检测方法简便、精准度高，可同时判断尿液中是否存在多种沙坦类降压药。
附图说明
图1为实施例1中6种沙坦类降压药的总体色谱图。
图2为实施例1中阿替沙坦及空白样品对比的色谱图。
图3为实施例1中坎地沙坦及空白样品对比的色谱图。
图4为实施例1中依贝沙坦及空白样品对比的色谱图。
图5为实施例1中洛沙坦及空白样品对比的色谱图。
图6为实施例1中奥美沙坦及空白样品对比的色谱图。
图7为实施例1中替米沙坦及空白样品对比的色谱图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施例及实施例附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
实施例1提供了一种尿液样本中6种沙坦类降压药的检测方法，检测方法如下：
（1）尿液样本前处理
标准溶液制备：在超声波条件下，使用甲醇将阿替沙坦/坎地沙坦/依贝沙坦/洛沙坦/奥美沙坦/替米沙坦6种药物分别溶解至药物浓度为2.5 mg/mL，后用甲醇稀释至0.5 μg/mL，作为标准溶液。
空白对照制备：取甲醇10 μL加入到190 μL空白尿液样本中，涡旋1min，配制成空白对照样本，取空白样品100 μL，加入200 μL 2%甲酸水溶液，涡旋1 min后加入800 μL甲醇，再涡旋约1 min，然后在离心速度为13000 rpm和离心温度为4℃的离心条件下离心为5min，后取200 μL上清液，作为空白样本进样。
尿液样本制备：取标准溶液10 μL加入到190 μL空白尿液样本中，涡旋1min，配制成空白对照样本，取空白样品100 μL，加入200 μL 2%甲酸水溶液，涡旋1 min后加入800 μL甲醇，再涡旋约1 min，然后在离心速度为13000 rpm和离心温度为4℃的离心条件下离心为5 min，后取200 μL上清液，作为尿液样本进样
（2）液相色谱仪-质谱仪参数优化
液相色谱仪为岛津 LC-20A；
液相色谱仪参数优化条件为：
液相色谱柱型号：ZORBAX SB-Aq 4.6*150mm,3.5μm,Agilent；
流动相：流动相A为质量浓度0.1%甲酸水溶液；流动相B为质量浓度0.1%甲酸甲醇水溶液。
梯度洗脱条件：
起始流动相比例：流动相A:流动相B=99:1；
步骤①：0~2.5min，流动相A:流动相B=99:1；
步骤②：2.5~10.0min，流动相比例由流动相A:流动相B=99:1匀速上升至流动相A:流动相B=30:80；
步骤③：10.0~16.5min，流动相A:流动相B=20:80；
步骤④：16.5~17.0min，流动相比例A:B=20:80匀速下降至A:B=99:1；
步骤⑤：17.0~20.0 min，流动相A:流动相B=99:1；
柱温：35 ℃；
流速：1.0 mL/min；
进样量：2μL；
质谱仪为API 4000；
质谱仪优化参数条件为如表1所示：
表1
上表中，对于各术语的解释说明如下：
CAD——碰撞活化解离气（N2）；CUR——气帘气；Gas1——雾化气；Gas2——辅助气；IS——离子喷雾电压；TEM——离子源温度。
沙坦类降压药参数如表2所示：
表2
上表中，对于各术语的解释说明如下：
Q1——母离子；Q3——子离子；Dwell time——驻留时间；DP——去簇电压；EP——射入电压；CE——碰撞能量；CXP——碰撞室射出电压；
（3）尿液样本检测
将（1）种制备的尿液样本行液相色谱仪-质谱仪联用检测，得到色谱图，如图1所示；
将（1）中的制备的6种沙坦类降压药的标准溶液进行液相色谱仪-质谱仪联用检测，得到6种降压药的色谱图，如图2-7所示。
对比图1-图7，从图中可以看出，保留时间为10.15 min的峰为奥美沙坦的峰，保留时间为11.03 min的峰为替米沙坦的峰，保留时间为11.33 min的峰为洛沙坦的峰，保留时间为11.34 min的峰为依贝沙坦的峰，保留时间为11.79 min的峰为坎地沙坦的峰，保留时间为11.87 min的峰为阿替沙坦的峰，空白样品中均无干扰。
本发明提供的检测方法采取有机溶剂蛋白沉淀法对尿液样本进行前处理，经过优化质谱仪-液相色谱仪参数优化，从而对尿液中6种沙坦类降压药进行定性分析，通过谱图对比，可直接得出尿液样本中沙坦类降压药的种类。本发明提供的检测方法操作简便、精准度高，可同时判断尿液中是否存多种沙坦类降压药。
以上实施例对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种尿液样本中多种沙坦类降压药的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用液相色谱仪-质谱仪联用对尿液中沙坦类降压药进行检测，所述检测方法包括：尿液样本前处理，液相色谱仪-质谱仪参数优化，尿液样本检测；
所样本前处理过程如下：将尿液样本与有机酸溶液混合，后转移至含有蛋白质沉淀剂的离心管中，离心，获取尿液样本上清液。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有机酸溶液为质量浓度为1-5％的甲酸水溶液，所述蛋白质沉淀剂为有机醇，所述有机酸溶液体积与所述尿液样本体积比不小于3。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述有机酸溶液为2％的甲酸水溶液，所述有机醇为甲醇。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述离心条件如下：转速范围为10000-15000转/分钟，离心时间3-10分钟，离心温度2-8℃。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱仪-质谱仪参数优化条件如下：
质谱仪参数优化条件如下：
检测方式：多反应监测MRM；
扫描方式：正离子扫描；
离子喷雾电压：4000-5500V；
气帘气：10-40Psi；
雾化气：50-60Psi；
辅助气：50-60Psi；
离子源温度：500-600℃；
碰撞气种类：N2；
碰撞气压力：8-12MPa；
液相色谱仪参数优化条件如下：
流动相：流动相A为有机酸水溶液，流动相B为甲酸甲醇溶液；
洗脱条件：梯度洗脱；
流速：0.8-1.0mL/min；
进样量：1-10μL。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述质谱仪参数优化条件如下：
检测方式：多反应监测MRM；
扫描方式：正离子扫描；
离子喷雾电压：5500V；
气帘气：20Psi；
雾化气：55Psi；
辅助气：55Psi；
离子源温度：550℃；
碰撞气种类：N2；
碰撞气压力：10MPa；
所述液相色谱仪参数优化条件如下：
流动相：流动相A为质量浓度为0.05-1％的甲酸水溶液；流动相B为甲酸甲醇溶液；
所述梯度洗脱包括如下三个阶段：
第一阶段，起始流动相比例：流动相A：流动相B的比例范围为90:10至99:1；
第二阶段，流动相比例：流动相A：流动相B的比例范围为25:75至15:85；
第三阶段，流动相比例：流动相A：流动相B的比例范围为90:10至99:1，至结束；
流速：0.8-1.0mL/min；
进样量：1-10μL。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件如下：
起始流动相比例，流动相A:流动相B＝99:1；
步骤①：流动相A:流动相B＝99:1，保持时间不小于0.5min；
步骤②：在时间不小于5min内，使得流动相比例由流动相A:流动相B＝99:1匀速上升至流动相A:流动相B＝20:80；
步骤③：流动相A:流动相B＝20:80，保持时间不小于5.0min；
步骤④：在2min内，使得流动相比例由流动相A:流动相B＝20:80匀速下降至流动相A:流动相B＝99:1；
步骤⑤：流动相A:流动相B＝99:1，保持时间不小于0.5min。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱仪的型号为Agilent1100、Agilent 1200、Agilent 1260、Agilent 1290、岛津LC-20A和岛津LC-30A中的一种；所述液相色仪采用的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18、Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18和Agilent ZORBAX SB-C18中的一种。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱柱的柱温范围为25-60℃。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱仪的型号为API4000、API3200、API5000、QTRAP4500、QTRAP5500和QTRAP6500中的一种，所述质谱仪使用的离子源为电喷雾离子源。
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