CN109793813A

CN109793813A - 益母草正丁醇提取物在制备具有促血管生成作用的药物中的用途

Info

Publication number: CN109793813A
Application number: CN201711147678.2A
Authority: CN
Inventors: 熊亮; 彭成; 何育霖; 戴鸥
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu First Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2019-05-24

Abstract

本发明公开了益母草正丁醇提取物在制备具有促血管生成作用或者修复血管损伤的药物中的用途。本发明益母草正丁醇提取物可以有效促进血管内皮细胞的增殖，修复血管损伤，促进血管生成，可以制备成为促血管生成药物，临床应用前景优良。

Description

益母草正丁醇提取物在制备具有促血管生成作用的药物中的用途

技术领域

本发明涉及益母草正丁醇提取物的用途。

背景技术

产后出血、冠心病、脑梗死等各种缺血性疾病严重危害人类健康，通过药物治疗是目前治疗的主要方法，通过药物促进缺血组织在原有微血管基础上形成新毛细血管，并与原有血管网相交汇，改善供血。因此，寻找促血管生成的药物成为现在治疗缺血性疾病的研究热点。

中药成分极其复杂，其有效作用成分大多还未弄清楚，导致了多年来中药无法打入国际市场。益母草做药用已有悠久的历史，其为唇形科益母草属植物Leonurus japonicus Houtt的新鲜或干燥地上部分,原名茺蔚,始载于,别名益母艾、苦草、坤草等,其味辛、微苦,性微寒,入心包、肝经,具有活血调瘀、调经利水的功能。随着人们对益母草认识的加深和现代科学技术的进步，越来越多的药理活性被发现，而关于益母草正丁醇部位促血管生成的研究未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了益母草正丁醇提取物的新用途。

本发明首先提供了益母草正丁醇提取物在制备具有促血管生成作用或者修复血管损伤的药物中的用途。

其中，所述的药物促进血管内皮细胞增殖的药物。

其中，所述的药物是用于治疗缺血性疾病的药物。

其中，所述的药物是用于治疗缺血性心脑血管疾病的药物。

其中，所述的药物是用于治疗冠心病、心绞痛、动脉硬化、脑血栓、脑缺血或产后出血的药物。

其中，所述的药物是由益母草正丁醇提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述的制剂包括但不限于注射剂、粉针剂、片剂、胶囊、软胶囊、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂、散剂、膏剂、油剂、栓剂、涂膜剂、凝胶剂。

本发明还提供了一种制备益母草正丁醇提取物的方法，包括如下步骤：

(1)取益母草，乙醇溶液提取；

(2)醇提液回收乙醇后的浸膏，再按系统溶剂法提取。

其中，步骤(1)中，所述的乙醇溶液为70％的乙醇溶液，提取2次，第一次使用10倍量的乙醇溶液，第二次使用8倍量的乙醇溶液，每次各1h；

步骤(2)中，所述系统溶剂法中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行提取，获得正丁醇提取部位，每种溶剂萃取10次。

本发明还提供了一种药物组合物，其特征在于：它是由前述方法制备的益母草正丁醇提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

斑马鱼被广泛应用于中药的不同提取部位的药效评价。中药有效部位新药是近期国内中药企业研发的热点之一，这主要是由于有效部位体现了中药的药效成分，符合西药的研发思路。利用斑马鱼来筛选药物就成为一个热点，因为斑马鱼具有与人类高度相似度额基因组，具有与步入动物相似的心血管、造血、神经及代谢等系统们大量高度一致的活性代谢产物，并呈现出与人类十分相似的生理学特征。一些已知的药物在斑马鱼上也出现了相似的治疗效果。本发明实验证实，本发明益母草正丁醇提取物应用于斑马鱼，可以有效促进血管生成。

本发明益母草正丁醇提取物可以有效促进血管内皮细胞的增殖，修复血管损伤，促进血管生成，可以制备成为促血管生成药物，临床应用前景优良。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为益母草正丁醇部位对Huvecs细胞存活率(A)及斑马鱼血管指数(B)的影响结果；

图2为益母草正丁醇部位对斑马鱼体节间血管生成的促进作用的荧光显微成像图。

具体实施方式

实施例1益母草正丁醇提取物的制备方法

(1)称取益母草药材250g，粉碎，加70％V/V乙醇加热回流提取两次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次各1h。将两次提取液合并，过滤，滤液减压回收溶剂，得粗浸膏28.0g；

(2)取粗浸膏，加水约350mL，超声混悬，转移至1000mL分液漏斗中，用石油醚萃取8次，每次350mL，再采用乙酸乙酯萃取10次，每次350mL，得乙酸乙酯部位。剩余水部位用正丁醇萃取10次，每次350mL，减压回收正丁醇，得正丁醇提取物6.4g。

通过以下试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1益母草正丁醇部位体外促血管生成试验

(1)实验材料：

①药物及制备

供试药物，益母草，采自四川省西昌市冕宁县，由成都中医药大学中药鉴定教研室任李敏教授鉴定为益母草L.japonicus的干燥块茎。益母草的正丁醇部位采用实施例1的方法制备。

受试化合物用DMSO配置成50mg/mL的贮备液，-10℃保存。

②细胞

人脐静脉血管内皮细胞Huvecs购于美国ATCC资源中心。

③试剂

试药使用前用二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma Aldrich公司)溶解为母液；苏尼替尼(sunitinib，北京百灵威科技有限公司，批号：LE70P63)。

④实验仪器

Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo公司)

恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；

AL104电子天平(瑞士Mettler Toled公司)；

水浴锅，低温冰箱等。

(2)实验方法：

①细胞培养和药物处理

Huvecs(人脐静脉血管内皮细胞)用含10％灭活新生牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM完全培养基培养。取对数生长期的Huvecs细胞株悬液以每孔3×10³个种植于96孔培养板中，每孔100μL，置于37℃，5％CO2，95％空气的培养箱中，24h后分别设定空白对照组、正丁醇部位给药组(药液中含有1.0μg/mL sunitinib和浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL的正丁醇部位试药，观察益母草正丁醇部位对sunitinib所致Huvecs细胞损伤的修复作用)、模型组(1.0μg/mL sunitinib)，每个浓度设三个复孔，继续孵育至48h后，弃上清液，每孔分别加入20μL的MTT，继续孵育4h，弃上清液，每孔加入DMSO 150μL，使紫色结晶物充分溶解后，选择酶标仪492nm处测得吸光度(OD)，记录结果。计算细胞存活率％＝(给药组平均OD值/空白对照组OD值)×100％。

②实验结果和评价：

1.0μg/mL的sunitinib对Huvecs细胞增殖有明显的抑制作用，而同时给药益母草正丁醇部位后，12.5、25、50μg/mL的正丁醇部位均对sunitinib诱导的Huvecs细胞损伤具有一定的保护作用，呈现明显的剂量依赖作用，与模型组相比具有显著性差异(P<0.01)，其中正丁醇部位50μg/mL对细胞的保护效果最好，细胞存活率可提高至86.56±4.05％。结果见图1。

试验例2益母草正丁醇部位促进斑马鱼血管生成试验

(1)实验材料：

①药物及制备

受试化合物用DMSO配置成50mg/mL的贮备液，-10℃保存。

②斑马鱼

转基因斑马鱼(flk1:EGFP)来源于成都中医药大学药学院斑马鱼实验平台培养繁殖。

③试剂

试药使用前用二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma Aldrich公司)溶解为母液；斑马鱼拍照时用固定液(4％甲基纤维素溶于培养液中)固定；苏尼替尼(sunitinib，北京百灵威科技有限公司，批号：LE70P63)。

④实验仪器

斑马鱼繁育与养殖系统(北京爱生科技公司)；

Axio Observer A1荧光倒置显微成像系统(德国Zeiss公司)；

M165-FC体式荧光显微成像系统(德国Leica公司)；

恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；

AL104电子天平(瑞士Mettler Toled公司)；

水浴锅，低温冰箱等。

(2)实验方法：

①斑马鱼饲养和繁育条件

斑马鱼饲养于全封闭循环系统，养殖和繁殖均参照zebrafish book标准，斑马鱼房内光照/黑暗比为14h/10h，室内温度26℃，水温28℃,pH 7.2-7.5，电导率500-550μs/cm，其各项水质指标均合要求。繁育前，将雌雄以1:1数量移入产卵盒，并用隔板将雌雄分开，次日清晨移去隔板雄鱼追逐雌鱼后30min便可收集胚胎。胚胎用培养液清洗干净移入无菌培养皿后，置于28.5℃恒温培养箱中。

②药物处理

选择发育正常的10hpf胚胎期斑马鱼(flk1-EGFP)，随机放入24孔板中，每孔10枚，每组50枚。设空白对照组、益母草正丁醇部位试药组(药液中含有1.5μg/mL sunitinib和50、25、12.5、6.25、3.125mg/L正丁醇部位试药)和模型组(1.5μg/mL sunitinib)，按组分别在孔内加入1500μL各工作液，并放入28.5℃恒温箱中培养。待斑马鱼胚胎发育至48hpf时，在体式荧光显微镜下观察斑马鱼体节间血管(ISVs)的生长情况，并利用成像系统拍摄照片。

③斑马鱼体节间血管指数(ISV index)的计算

统计斑马鱼体节间血管指数(ISV index)，包括完整血管数×1加不完整血管数×0.5(从卵黄囊之后的节间血管开始计算)。

④实验结果和评价：

从图2B可以看出空白对照组和含有1.5μg/ml sunitinib造模液的模型组相比，模型组较空白对照组斑马鱼节间血管血管指数明显降低(P<0.01)，可见造模成功。结果表明，与造模组对照，6.25μg/mL正丁醇部位试药剂量组对sunitinib所致斑马鱼体节间血管损伤具有一定修复作用，体节间血管指数上升(P<0.05)。12.5-50μg/mL正丁醇部位试药剂量组(图中所示Bu即为益母草正丁醇试药)对sunitinib所致斑马鱼体节间血管损伤具有明显修复作用，体节间血管指数显著上升(P<0.01)，且给药浓度越大斑马鱼体节间血管指数越大，呈剂量依赖性。当给药浓度为50μg/mL时，斑马鱼胚胎体节间血管指数接近于空白对照组，此时斑马鱼血管新生效果最佳，见图1和图2。

实验结果证明，本发明益母草正丁醇提取物可以有效促进血管内皮细胞的增殖，修复血管损伤，促进血管生成，可以制备成为促血管生成药物，临床应用前景优良。

Claims

1.益母草正丁醇提取物在制备具有促血管生成作用或者修复血管损伤的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物促进血管内皮细胞增殖的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是用于治疗缺血性疾病的药物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的药物是用于治疗缺血性心脑血管疾病的药物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物是用于治疗冠心病、心绞痛、动脉硬化、脑血栓、脑缺血或产后出血的药物。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的用途，其特征在于：所述的药物是由益母草正丁醇提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的制剂包括但不限于注射剂、粉针剂、片剂、胶囊、软胶囊、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂、散剂、膏剂、油剂、栓剂、涂膜剂、凝胶剂。

8.一种制备益母草正丁醇提取物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取益母草，乙醇溶液提取；

(2)醇提液回收乙醇后的浸膏，再按系统溶剂法提取。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的乙醇溶液为70％的乙醇溶液，提取2次，第一次使用10倍量的乙醇溶液，第二次使用8倍量的乙醇溶液，每次各1h；

10.一种药物组合物，其特征在于：它是由权利要求7或8所述方法制备的益母草正丁醇提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。