CN102964405B - 一种具有促进血管生成的王不留行黄酮苷的应用 - Google Patents
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Abstract
一种具有促进血管生成的王不留行黄酮苷的应用，属于中药应用技术领域。本发明首次发现王不留行黄酮苷具有促进血管生成的活性，可用于冠心病、心机梗死后等缺血性心脏病，脑梗塞后、血管闭塞性血栓性脉管炎，心血管接入术，伤口愈合中抑制斑痕形成等血管生成有关的疾病的预防与治疗。这种王不留行黄酮苷可应用于药物制剂、营养品、保健品、化妆品等用途。
Description
技术领域
一种具有促进血管生成的王不留行黄酮苷应用，属于中药应用技术领域。本发明涉及一种具有促进血管生成活性的王不留行黄酮苷，阐明其在医药，食品、化妆品方面的新用途。
背景技术
王不留行为石竹科植物麦蓝菜Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟种子。王不留行中主要含有三萜皂苷、黄酮苷、环肽、类脂和脂肪酸、单糖等成分[1、李帆，梁敬钰.王不留行的研究进展[J].海峡药学，2007，19(3)：1-5]。实验发现王不留行黄酮苷具有促进血管新生的作用，其结果为下式所示：
血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell)具有多种生理功能，参与机体的凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等生活活动。研究表明[2、Reinhart K，Bayer O，Brunkhorst F，et al.Markers ofendothelialdamage in organ dysfunction andsepsis[J].CritCare Med，2002，30(5)：302.]，内皮细胞的损伤及功能紊乱与多种疾病的发生密切相关，包括高血压、冠心病、糖尿病、慢性肾功能衰竭等。引起内皮细胞损伤是一个复杂的病理过程，参与的因素很多，如糖尿病、高血脂和高血压等多种疾病，氧化应激以及炎症反应等等。心血管介入术主要是机械刺激血管内皮，通过刺，戳，擦，挤伤导致损伤，当被导管继续损伤扩大而伴发急性血栓，导致血管内皮剥脱的严重内膜损伤[3、方宏，冯义柏.血管内皮细胞损伤与常见心血管疾病[J].心血管病学进展，2001，22(1)：34-36]。冠心病心肌缺血坏死的发生，与病变血管的闭塞直接相关[迟路湘.肝素与冠心病血管生成治疗认识进展[J].微循环学杂志，2002，12(1)：41-42.]。血管内皮细胞的损伤是多种血管性疾病的主要环节，保护血管内皮功能是防治血管性疾病的关键环节。因此，研究保护血管内皮功能的药物成为治疗血管性疾病的重要措施。针对内皮细胞损伤的不同环节进行的药物研究也在进行中，包括抑制黏附分子生成和释放、拮抗黏附分子作用的药物、作用于LOX-1受体的药物等等，都受到了研究人员的重视。在血管生成中，促进侧枝循环的建立是改善心肌缺血的另一重要途径，临床研究证实，增加侧枝血流量又可增加血流剪切力，刺激血管生长，可缓解和治疗心绞痛等缺血性心脏病。表皮生长因子(EGF)在促进内皮细胞增殖中表现为可刺激组织修复细胞增殖，趋化炎性细胞，表皮细胞和成纤维细胞向伤口聚集，加剧创面愈合，此生理效应可预防和治疗瘢痕修复。经过调研，未见我国学者对王不留行黄酮苷促进血管生成的相关文献报道(自CNKI、维普中国期刊网)，因此王不留行黄酮苷在促进血管生成的药理、药效等研究领域尚处于空白阶段。本研究发现王不留行黄酮苷具有促进内皮细胞生成的作用，为保护内皮细胞的相关疾病提供新的治疗方法与应用。
磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，主要用来检测细胞增殖情况。SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在540nm 波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。SRB染色后不会像MTT法那样很容易变色，细胞固定染色后在96孔板中可以放置较长时间，因而受测定时间的影响较小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时问点固定的96孔细胞培养板可在同一时间测定，测定的吸光值结果不会受到明显影响。吸光值与SRB浓度作图时，在OD单位1.5-2.0以下为线性，当超出线形范围时，最好稀释后重新读数。虽然SRB法比其他检测方法操作步骤繁琐，但是由于时间可以自己掌握，不受限制，因此适用于高通量筛选。
细胞划痕法是测定细胞的运动特性的方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。
基质胶(Matrigel)又名EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)提取物、基底膜基质，是从小鼠EHS肿瘤中提取的可溶的、无菌的基底膜蛋白。Matrigel在4℃为液态，37℃凝固为固态，适用于将细胞或其它物质混合于其中进行皮下注射。该填塞实验广泛地应用于评估血管生长因子实验，以及肿瘤细胞诱导血管形成的实验。由于Matrigel中不包含任何组织成分，避免了组织中可能含有的促进和抑制血管新生物质对实验因子的影响。
发明内容
所述黄酮苷对内皮细胞增殖的影响，将HMEC-1(人脐静脉内皮细胞)经培养箱培养24h，加入不同浓度的黄酮苷作用48h，经SRB法染色，用酶标仪在波长A540测得OD值。每组设置4个复孔，每批样品重复3次。
所述黄酮苷对细胞迁移的影响，将HMEC-1经培养箱合纵孵育24h，待细胞贴壁后用移液塑料枪头于每孔中心位置化一条1mm款宽的灼伤带，并加入含不同黄酮苷浓度的培养基培养。然后在100×显微镜下与同一视野进行拍照。
所述黄酮苷对小鼠模型中血管生成的影响，将0.5ml Matrigel皮下注射于小鼠腹部右侧，按4mg/(kg·d)的剂量灌胃给予黄酮苷，连续14d。实验分为阴性对照组，实验组。对照组给以等体积0.9％生理盐水，观察方法和时间同实验组。种植14d后，颈椎脱臼处死小鼠，手术剖开腹部皮肤，取出Matrigel种植体。
附图说明
图1王不留行黄酮苷促进HMEC-1增殖。在王不留行黄酮苷浓度为0.76μg/ml时，HMEC-1细胞进入对数增长期。
图2王不留行黄酮苷对HMEC-1迁移的作用A对照组，0h；B王不留行黄酮苷(5μg/ml)，0h；C对照组，24h；D王不留行黄酮苷(5μg/ml)，24h；E对照，48h；F王不留行黄酮苷(5μg/ml)，48h。
图3王不留行黄酮苷对Matrigel胶血管生成的作用G对照；H黄酮苷，4mg/(kg·d)。
具体实施方式
实施例1：SRB法测黄酮苷对内皮细胞增殖的影响
取对数生长期HMEC-1细胞，按每孔8000-10000个细胞接种于96孔板中，放置于37℃、50ml/L CO2的培养箱中培养24h，加入不同浓度的黄酮苷作用48h，以不加药组为阴性对照组，每组同时设4个复孔，每批样品重复3次试验。加药后培养至72h测板，用MK3型酶标仪在波长A540处测定每孔A值。计算增殖率(％)(见图1)。
实施例2：细胞划痕法测黄酮苷对内皮细胞迁移的影响
用划线灼伤法研究细胞迁移，将常规培养的HMEC-消化悬浮，以每孔8×104(5×104)个细胞加到24孔 板中，置37℃、50ml/L CO2及饱和湿度的培养箱中孵育24h，待细胞贴壁后用移液塑料枪头于每孔中心位置划一条1mm宽的灼伤带，然后用PBS洗去脱落细胞，并加入含不同药物浓度的细胞培养基以及对照组。然后在100×显微镜下拍照，此刻为0h细胞迁移图，接着在24h，48h分别于同一视野处拍(所得图片用IPWin60C软件图象软件进行处理，测量灼伤带距离，见下表：
表1王不留行黄酮苷对HMEC-1迁移距离的作用(μm)
与对照组比较，*P＜0.05
实验表明王不留行黄酮苷浓度为5μg/ml，与对照相比，在24h和48h能够显著的促进HMEC-1迁移。
实施例3：Matrigel plug模型检测黄酮苷对新生血管的影响
Matrigel在4℃溶解，取Matrigel 350μl和DMEM 150μl，皮下注射于C57BL/6小鼠腹部右侧区域。种植14d后，颈椎脱臼处死小鼠，手术剖开腹部皮肤，取出Matrigel种植体，生理盐水清洗3遍。给药于Matrigel种植后，灌胃注入黄酮苷，1次/d，连续14天。实验分为阴性对照组，实验组4mg/(kg·d)。对照组给以等体积0.9％生理盐水，观察方法和时间同实验组。对照组Matrigel均匀透明，给药组Matrigel有明显血管长入(见图3)。王不留行黄酮苷可明显促进Matrigel胶血管生成。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式和所有对工艺参数的改进和变动都同样属于本发明的权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.王不留行黄酮苷在制备用于促进血管生成的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的王不留行黄酮苷在制备用于促进血管生成的药物中的应用，其特征在于：所述王不留行黄酮苷是用于制备防止和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病或过程的药物：缺血性心脏病，与血管生成有关疾病或过程。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述缺血性心脏病为冠心病、心肌梗死。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述与血管生成有关的疾病或过程为脑梗塞后、血管闭塞性血栓性脉管炎，心血管接入术，伤口愈合中抑制斑痕形成。
5.王不留行黄酮苷在制备用于促进血管生成的营养品、保健品、化妆品中的应用。
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