CN109793763A - 一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种减脂提取物，具体涉及一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物。本发明利用茯苓中的有效成分易溶于醇的特点，通过两次低温提取，将茯苓粉碎成粉后，在40℃温水浸泡过夜，过滤，滤上物置于70%的醇溶液中70℃提取2小时，再次过滤，收集滤下物，旋蒸浓缩，真空干燥，得浅褐色干浸膏。最终获得的茯苓提取物是制成乳膏剂通过体表涂抹的方式减少皮下脂肪的定位减肥，实现抹哪里减哪里的特殊效果，且无刺激性、过敏性，无任何毒副作用，安全有效。

Description

一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物

技术领域

本发明涉及一种减脂提取物，具体涉及一种茯苓(Wolfiporia extensa)提取物，该提取物可实现减少皮下脂肪。

背景技术

随着人们生活水平的日益提高，肥胖症的发病率呈上升趋势,已成为糖尿病、冠心病、高血压、高脂血症等现代文明病的重要祸端之一。控制饮食作为快速减体重的主要手段，这必将导致各种营养的摄入量急剧减少，甚至不能满足基础代谢所需要的热能，同时伴有严重脱水，血管负担加重，体内蛋白质、无机盐和维生素损失，低血糖，尿酮体出现等症状，这对控制饮食者的健康产生了不良影响。

目前市场上已有的减肥药主要分为内服和外用两大类，但均有一定的局限性。内服减肥药通常难以避免肝脏首过效应、药物在胃肠道的破坏等副作用，有报道指出，口服西布曲明可能会出现心肌损伤、心力衰竭、失眠、厌食等副作用；左旋肉碱减肥药可能会导致精神障碍；口服奥利司他可能出现多种胃肠道反应，如带便性胃肠排气。目前国外还在使用的减肥药包括奥利司他和芬特明单独使用或与托吡酯和氯卡色林组合，芬特明与托吡酯复合胶囊剂Qsymia有致畸性，氯卡色林可能会增加心血管疾病和抑郁症发病风险。外用减肥药的给药方式有肚脐贴剂、肚脐温灸、腹部涂抹、腹部热敷、中药按摩腰带振动按摩与药物挥发渗透结合五种，给药部位集中于腹部及肚脐，无法实现局部定点减脂减肥。

除了上述减肥药物，市场上还有大量瘦身保健品及瘦身化妆品，也都存在不同程度的不足之处。瘦身保健品主要为瘦身减肥茶，长期服用瘦身减肥茶可能会出现腹泻等胃肠道不良反应，还有可能会出现厌食反应。市面上瘦身化妆品种类较多，其主要有效成分主要分为咖啡因、辣椒素、茴香、海藻提取物、可可提取物以及葡萄籽提取物六类，且国内瘦身保健品及瘦身化妆品均缺乏大样本人体实验验证其有效性，而全身可用的经皮给药外用减肥药物未见公开。

茯苓，为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。茯苓粉或提取物多内服，用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠。现尚未见将茯苓提取物外用于减少皮下脂肪的报道。

发明内容

鉴于上述不足，研发一种安全有效、便利可靠、外用涂抹的减肥膏迫在眉睫，本发明研发的茯苓提取物减肥乳膏剂是体表涂抹的外用药，直击皮下脂肪，不入内脏器官，不会对人体的生理机能造成影响，且能实现局部定点减脂减肥。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案，本发明各组分的用量也是经过发明人进行大量摸索总结得出的，使用该方法制备出的茯苓提取物具有很好的减少皮下脂肪效果。一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物，该提取物中的有效成分包含从任何提取溶剂中提取的茯苓有效成分。

进一步的，所述任何提取溶剂包括有机溶剂和无机溶剂。

进一步的，所述提取物是通过甲醇提取浓缩得到。

进一步的，该提取物是在0～200℃下提取。

进一步的，该提取物是在0～80℃下提取。

一种减少皮下脂肪的茯苓提取物的制备方法包括：

(1)原料预处理：将茯苓方丁粉碎成粉，于40℃蒸馏水中浸泡过夜；

(2)首次提取：将浸泡的茯苓粉滤干后加入70％的甲醇在70℃下机械下搅拌提取2h，抽滤，分别得滤液和滤饼备用；

(3)二次提取：滤饼置于70％的甲醇在70℃下机械下搅拌提取2h，抽滤，将两次滤液合并后静置过夜，最后在50℃下进行单效浓缩，真空干燥，得浅褐色干浸膏。

一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物的制备方法包括：取茯苓置于10倍量40℃水中浸泡2h，煎煮2h，滤过，收集煎煮液；滤渣中再加入8倍量的水，煎煮2h，滤过，合并煎煮液后静置过夜，最后在50℃下进行单效浓缩，真空干燥，得浅褐色干浸膏。

一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物的用途，可制备成乳膏剂以及制药上可接受的赋形剂。

一种减少皮下脂肪的方法，所述方法为将茯苓提取物制备成的乳膏剂以及制药上可接受的赋形剂以外用的方式涂抹至皮肤表面。

一种用于减少皮下脂肪的乳膏剂由以下制备方法制得：

(1)膏基的制备：取硬脂酸75Kg、单硬脂酸甘油酯5Kg、十六烷醇5Kg、丁二醇50L、液体石蜡5L，并置于90℃恒温搅拌，溶解，随后再加入500L水、10L浓度为10％的NaOH、2Kg尼泊金、4L氮酮和1L香精，制得膏基；

(2)取13Kg茯苓提取物+500Kg膏基，90℃混合乳化，分装，装箱，打包，得用于减少皮下脂肪的乳膏剂。

本发明的有益效果在于：

1、茯苓有效成分提取物作为单味中药提取有效成分的乳膏剂进行减肥，有效成分的使用效果比其他中药全药或复方有更显著的效果，西药单一成分目前没有乳膏剂外用搽剂。

2、茯苓提取物减肥乳膏剂抹那哪里，减哪里，不仅可以减肥，还能身体塑形，单独减肚子、减粗腿、瘦脸以及减眼袋，有效避免副作用极大的美容整形项目，如瘦脸针。

3、茯苓提取物减肥乳膏剂在减脂减肥上能溶解皮下脂肪、减少皮下脂肪，真正意义上的减脂减肥，并且对皮肤没有刺激性、过敏性，病理检测的各项指标显示没有毒副作用，实现了安全有效减肥的目的。

4、茯苓提取物减肥乳膏剂能实现真正的无痛苦、无毒副作用减肥，不需要大量运动减脂，不需要吃毒副作用极大的减肥药，在正常饮食的情况下轻松减肥。每天抹一次，轻松简单，易操作，可控性强。

5、茯苓是到目前为止没有副作用的一味中药，用茯苓提取有效成分，能有效地溶解皮下脂肪，随粪便排出但不伴有腹泻，不易反弹。茯苓提取物减肥乳膏剂为透皮给药，能有效避免肝脏的首过效应及胃肠道的破坏，提供可预定的和较长的作用时间，降低药物毒副作用，提高疗效，减少给药次数,可减轻副作用、在发生问题时能及时停止给药，可减少给药次数和剂量。本减肥乳膏剂添加的透皮剂为氮酮，相对于目前常见的透皮剂二甲基亚砜、薄荷醇、月桂醇、冰片等，有更高效的渗透能力，并且对皮肤均无任何刺激作用。本发明的乳膏制剂通过涂抹相应的部位，能实现局部瘦身，消除任何部位皮下脂肪。

具体实施方式

下面我们将结合具体实施方式对本发明作进一步的阐述。

实施例1

一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物

(1)原料预处理：将茯苓方丁粉碎成粉，于40℃蒸馏水中浸泡过夜；

(2)首次提取：将浸泡的茯苓粉滤干后加入70％的甲醇在70℃下机械下搅拌提取2h，抽滤，分别得滤液和滤饼备用；

(3)二次提取：滤饼置于70％的甲醇在70℃下机械下搅拌提取2h，抽滤，将两次滤液合并后静置过夜，最后在50℃下进行单效浓缩，真空干燥，得浅褐色干浸膏。

实施例2

一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物

取茯苓置于10倍量40℃水中浸泡2h，煎煮2h，滤过，收集煎煮液；滤渣中再加入8倍量的水，煎煮2h，滤过，合并煎煮液后静置过夜，最后在50℃下进行单效浓缩，真空干燥，得浅褐色干浸膏。

实施例3

一种用于减少皮下脂肪的乳膏剂，由以下方法制得：

(1)膏基的制备：取硬脂酸75Kg、单硬脂酸甘油酯5Kg、十六烷醇5Kg、丁二醇50L、液体石蜡5L，并置于90℃恒温搅拌，溶解，随后再加入500L水、10L浓度为10％的NaOH、2Kg尼泊金、4L氮酮和1L香精，制得膏基；

(2)取13Kg实施例1所制得的茯苓提取物和500Kg膏基，90℃混合乳化，分装，装箱，打包，得用于减少皮下脂肪的乳膏剂。

实施例4

一种用于减少皮下脂肪的乳膏剂：

制备方法同实施例3，只是茯苓提取物采用实施例2所制得的茯苓提取物。

对用于减少皮下脂肪的茯苓提取物乳膏制剂进行了如下皮肤过敏性试验、皮肤刺激性试验以及相应的药效学试验，详见如下：

一、皮肤过敏性试验

1实验目的

观察动物皮肤重复接触受试物后，机体免疫系统在皮肤上的反应，为临床用药安全提供依据。

2实验材料

2.1药品

WE减肥外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)，性状淡黄色膏，规格100g/瓶，批号170301；WE赋形剂(膏基)，性状白色膏，规格：100g/瓶，批号170201，由四川盛汇泽药业有限责任公司提供。

2.2试剂

致敏剂：2，4－二硝基氯苯，天津市光复精细化工研究所，规格：25g/瓶，批号：2012年3月06日。

丙酮：成都金山化学试剂有限公司，规格：500ml/瓶，批号：20150505。

致敏剂临用时，用丙酮配制成1％的致敏浓度和0.1％的激发浓度。

2.3动物

英国种白色豚鼠，体重250～300g，雌雄各半，由四川省实验动物专委会养殖场提供，实验动物生产许可证号:SCXK(川)2013-14。全价营养饲料：由四川省医学科学院实验动物中心提供，合格证:医动字第24105101号。实验在成都市食品药品检验研究院实验动物室观察及饲养，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2017-97。

3方法与结果

3.1给药途径

选择与临床给药途径相一致的皮肤给药途径。

3.2供试品皮肤刺激性考查

取英国种豚鼠4只，分为2组，分别将WE减肥外用制剂及WE赋形剂涂抹于豚鼠背部的脱毛区，约3×3(cm)，给药剂量见表1，用油纸、纱布覆盖，胶布封闭、固定，保持6小时，连续三天，每次给药结束，用微温水洗尽受试物。

表1 WE减肥外用制剂皮肤刺激性考查

末次给药结束后0、24、48、72小时，观察豚鼠背部脱毛区的皮肤刺激反应。结果皮肤均未见红斑、水肿等刺激反应。

结论：WE减肥外用制剂及WE赋形剂对豚鼠皮肤均无刺激作用，可以进行皮肤过敏试验。

3.3实验方法

取英国种豚鼠30只，随机分为药物组、阴性对照组和阳性对照组，每组10只，分笼饲养。于给予受试物前24小时脱去豚鼠背部左侧覆毛，约3×3(cm)。药物组、阴性对照组和阳性对照组按表2方案将受试物涂抹于左侧去毛区，用油纸、纱布覆盖，胶布封闭、固定，保持6小时致敏给药。于第一次致敏给药后第7天和第14天以同法各重复一次，共给药三次。每次给药结束，用微温水轻轻洗去受试物。

末次致敏后14天，各组动物右侧去毛，按表2以所示将受试物涂抹于右侧去毛区进行激发接触，保持6小时。给药结束后，用微温水轻轻洗去受试物，于0、24、48、72小时观察皮肤过敏反应情况。对观察结果按表3进行评分，按表4评价致敏强度。评价结果见表5。

表2 WE减肥外用制剂皮肤过敏试验给药方案

表3皮肤过敏反应程度的评分标准

以动物72小时内皮肤过敏反应的最高分作为该动物的皮肤过敏反应分(红斑最高分+水肿最高分)，按下式计算各组动物的皮肤过敏平均反应分：

表4皮肤致敏性评价标准

3.4实验结果

表5 WE减肥外用制剂皮肤过敏试验结果

表5结果显示，WE减肥外用制剂及阴性对照组动物在激发接触后0、24、48、72小时未见豚鼠哮喘、站立不稳、休克，皮肤红斑、水肿等过敏反应，致敏率为0。各组动物活动，摄食正常,对体重无影响(见表6)。阳性对照组动物在激发接触6小时后即出现不同程度的红斑、水肿等过敏反应症状，致敏率100％。显示WE减肥外用制剂不引起豚鼠皮肤过敏反应。

表6.WE减肥外用制剂皮肤过敏试验对动物体重的影响

注：与阴性对照组比较差异不显著(P>0.05)

4结论

WE减肥外用制剂皮肤过敏试验，未见动物出现过敏反应，致敏发生率为0。动物活动，摄食及体重均未见异常。WE减肥外用制剂不引起皮肤过敏反应。

二、皮肤刺激性试验

1实验目的

观察动物完整皮肤及破损皮肤接触受试物WE减肥外用制剂后，所产生的局部刺激反应情况，为成人使用安全提供依据。

2实验材料

2.1药品

WE减肥外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)，性状淡黄色膏，规格100g/瓶，批号170301；WE赋形剂(膏基)，性状白色膏，规格：100g/瓶，批号170201，由四川盛汇泽药业有限责任公司提供。

2.2动物

日本大耳白实验家兔，体重2.10～2.40Kg，雌雄各半，由四川省实验动物专委会养殖场提供，实验动物生产许可证号:SCXK(川)2013-14。全价营养饲料：由四川省医学科学院实验动物中心供应部,合格证:川医动字第24105101。实验在成都市食品药品检验研究院实验动物室观察及饲养，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2017-103。

3方法和结果

3.1给药途径

选择与临床使用途径相一致的皮肤给药途径。

3.2给药方案见表7。

表7 WE减肥外用制剂皮肤刺激试验给药方案

3.3试验方法

选用成年健康日本大耳白实验家兔12只，体重2.10～2.40Kg，给药前24小时动物背部脊柱两侧剪毛，然后用电动理发器脱毛，脱毛区域约15×10(cm)。脱毛后的动物随机分组，即完整皮肤和破损皮肤组，每组6只，雌雄各半。完整皮肤动物的皮肤不作处理，破损皮肤组动物的皮肤用0号砂纸擦皮肤至出现密集出血点，渗血为度。

每只动物左侧皮肤给予WE减肥外用制剂，右侧给予作WE赋形剂为阴性对照，各组按表7将相应的受试物左涂抹于左、右两侧脱毛区，用纱布覆盖，胶布固定。每日给药1次，每次给药6小时，共给药14天。每次给药结束，用微温水轻轻洗去动物皮肤表面残留的药物，观察结果。给药期间及给药结束恢复期，每日观察动物皮肤刺激情况，作记录。观察期满，处死动物，取给药局部皮肤标本，用10％中性甲醛溶液固定，作病理组织学检查。

3.4观察方法、时间及标准

每日每次给药结束，用微温水洗去受试物，去除受试物后1小时及再次给药前；末次给药去除受试物后1、24、48、72小时至7天观察及记录红斑、水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间。观察结果按表8评分，记录各时日的评分值及恢复情况和时间。停药一周后，取给药局部皮肤送成都里来生物医学实验中心做病理组织学检查。

表8皮肤刺激反应评分标准

3.5结果评价

结果评价按表9标准进行，受试物对完整皮肤和破损皮肤的刺激强度，恢复情况和时间，并与对照物赋形剂进行比较。试验肉眼观察评分见表10。

表9皮肤刺激性强度评价标准

表10 WE减肥外用制剂皮肤刺激试验皮肤刺激评分

注：平均刺激强度指每一组全部动物的皮肤刺激强度之和除以动物数。

表10结果显示，对家兔完整皮肤多次给药，在给药14天及去除受试物后1、24、48、72h至14天的观察期间，WE减肥外用制剂及WE赋形剂对皮肤均无刺激作用。

对家兔破损皮肤多次给药，在给药14天及去除受试物后1、24、48、72h至7天的观察期间，WE减肥外用制剂皮肤状况与WE赋形剂对皮肤作用情况一致，为破损皮肤正常恢复，药物无明显刺激作用。

去除受试物后7天取家兔皮肤做病理组织学检查，结果：

完整皮肤给药组:组织结构基本正常，皮肤的表皮和真皮结构完好，分界清楚，基底膜完整，表皮细胞未见水肿，坏死、脱落。真皮乳头层及网织层结构清楚，血管未见充血、扩张，水肿、充血。表皮基底层、棘层、颗粒层、透明层及角质层结构完整，未见溃疡形成。

完整皮肤空白基质组(赋形剂)：组织结构基本正常，皮肤的表皮和真皮结构完好，分界清楚，基底膜完整，表皮细胞未见水肿，坏死、脱落。真皮乳头层及网织层结构清楚，血管未见充血、扩张，水肿、充血。表皮基底层、棘层、颗粒层、透明层及角质层结构完整，未见溃疡形成

破损皮肤给药组:组织结构基本正常，皮肤的表皮和真皮结构完好，分界清楚，基底膜完整，表皮细胞未见水肿，坏死、脱落。真皮乳头层及网织层结构清楚，血管未见充血、扩张，水肿、充血。表皮基底层、棘层、颗粒层、透明层及角质层结构完整，未见溃疡形成。

破损皮肤空白基质组(赋形剂)：组织结构基本正常，皮肤的表皮和真皮结构完好，分界清楚，基底膜完整，表皮细胞未见水肿，坏死、脱落。真皮乳头层及网织层结构清楚，血管未见充血、扩张，水肿、充血。表皮基底层、棘层、颗粒层、透明层及角质层结构完整，未见溃疡形成。

4结论

WE减肥外用制剂，即实施例3所制得的乳膏剂对家兔完整皮肤及破损皮肤均无刺激作用。光镜下病理组织学检查，受试药物对家兔完整皮肤给药无明显刺激性作用，对家兔破损皮肤无明显刺激性作用。

三、药效学试验：

1实验目的

对WE外用制剂进行减肥药效学研究，考查其外用减肥效果，同时考查WE外用制剂连续给药2个月毒性情况，为成人皮肤涂抹使用提供参考。

2实验材料

2.1受试物

WE外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)，四川盛汇泽药业有限公司提供，性状淡黄色膏；规格100g/瓶，批号170301、170601。

赋形剂为膏基，性状白色，规格100g/瓶，批号170201、170410。密封，2-8℃冷藏保存。

用法用量：外用。一日一次，单用于腹部一次5g，同时用于腹、背，一次10g，同时用于腹、背、腿，一次15g。

2.2动物

SPF级SD大鼠，健康合格(试验时使用的动物的数量、性别、体重见各试验项下)，由成都达硕实验动物有限公司生产，许可证号SCXK(川)2015-030，或由四川省中医药科学院·四川省人民医院实验动物研究所生产，实验动物生产许可证号SCXK(川)2013-15。

实验动物在成都市食品药品检验研究院SPF动物室观察及饲养，实验动物使用许可证号:SYXK(川)2017-103。

大鼠正常生长饲料：全价鼠灭菌维持饲料，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(川)2014-028。

肥胖模型高脂饲料：配方按大鼠生长饲料中加入15％猪油、15％蔗糖、适量酪蛋白、磷酸氢钙、石粉，由四川省中医药科学院·四川省人民医院实验动物研究所特别加工生产。

2.3仪器

电子秤PB1501-S，d＝0.1g(METTLER TOEDO，Switzerland)。

电子天平CP225D，d＝0.1mg(METTLER TOEDO，Switzerland)。

7100AutomaticAnalyzer(Hitachi).

HC-9886全自动电解质分析仪(深圳市航创医疗设备有限公司)

BC-5000Vet型全自动五分群血液分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)

Centrifuge 5810R(Germany).

全自动脱水机(LEICAASP300S，德国)；

石蜡包埋机(LeicaArcadia H、Arcadia c，德国)；

摊片机(LEICAHI 1210，德国)；

烘片机(LEICAHI 1220，德国)；

染色工作站(全自动染色机LEICAAUTOSFAINER XL、全自动封片机LEICACV5030，德国)；

半自动转轮式切片机(HEICAHI 1210，德国)；

生物显微镜(BX43型，JAPAN OLYMPUS)；

图像分析软件(OLYMPUS CELLSENS ENTRY，JAPAN OLYMPUS)。

2.4试剂

2.4.1生化、血液学检测试剂

生化复合校准品(CFAS)，5ml，批号0417021，有效期至20180430；生化质控物(AMCC)，水平1 5ml，批号0717041，有效期至20180704；生化质控物(AMCC)，水平2 5ml，批号0717031，有效期至20170704。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒，R160ml×3，R245ml×1,批号0617031，有效期至20190619。

天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒，R160ml×3，R245ml×1,批号0617021，有效期至20190619。

碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒，R160ml×3，R245ml×1,批号0317011，有效期至20180913。

总蛋白(TP)测定试剂盒[Doumas法]，R 60ml×4，批号0517021，有效期至20181126。

白蛋白(Alb)测定试剂盒[BCG法]，R 60ml×4，批号0417021，有效期至20181012。

总胆红素(TBil)测定试剂盒[氧化法]，R160ml×3，R245ml×1,批号0816211，有效期至20180819。

葡萄糖(Glu)测定试剂盒[HK法]，R160ml×3，R245ml×1,批号0317011，有效期至20190313。

尿素(Urea)测定试剂盒[UV-GLDH法]，R160ml×3，R245ml×1,批号0816061，有效期至20180225。

肌酐(Crea)测定试剂盒[肌氨酸氧化酶法]，R160ml×3，R260ml×1,批号0517031，有效期至20190516。

总胆固醇(TC)测定试剂盒[COD-CE-PAP法]，R160ml×3，R245ml×1,批号0717031，有效期至20190107。

甘油三酯(TG)测定试剂盒[GPO-PAP法]，R160ml×3，R245ml×1,批号0617021，有效期至20181206。

肌酸激酶(CK)测定试剂盒[基于IFCC(2002)配方]，R160ml×3，R245ml×1,批号0417021，有效期至20190401。

以上生化检测试剂均由四川迈克生物科技股份有限公司生产。

电解质试剂盒[血清钾(K)、血清钠(Na)、血清氯(Cl)]，离子选择电极法，A标准液20160411，有效期18个月；B标准液20150513，有效期18个月；R反应液20160215，有效期18个月。均由深圳市航创医疗设备有限公司生产。

溶血剂90ml，批号2016022301，有效期至20180222；300ml，批号20160612401，有效期至20180123；稀释剂5.5L，批号20160228，有效期至20180227，均由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产。

2.4.2试剂

组织标本固定液：甲醛溶液，规格500mL/瓶，批号20160603，广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产。

脱水试剂：无水乙醇(AR级)，规格2500mL/瓶，批号20161016，成都金山化学试剂有限公司生产。

透明试剂：二甲苯(AR级)，规格500mL/瓶，批号20160110，天津市科密欧化学试剂有限公司生产。

苏木素染液(BA-4041，AR级)：规格1000mL/瓶，批号716113，珠海贝索生物技术有限公司生产。

伊红染液(醇溶性，BA-4022，AR级)，规格1000mL/瓶，批号716112，珠海贝索生物技术有限公司生产。

盐酸一乙醇分化液：盐酸(AR级)，批号20160118，规格500ml/瓶，成都市科龙化工试剂厂生产；无水乙醇(AR级)，规格2500mL/瓶，批号20161016，成都金山化学试剂有限公司生产。

封片试剂：中性树胶，规格250mL/瓶，批号03806054，Leica Biosystems Pty Ltd.

3减肥药效学研究

3.1第一次减肥药效学试验

3.1.1剂量设计

实施例3组给动物皮肤每次给予WE外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)2g，每天给予2次；模型对照组给动物皮肤每次给予赋形剂2g，每天给予2次。

3.1.2动物造模及分组

取购得的雄性大鼠35只(体重180-220g，由成都达硕实验动物有限公司提供)，分为正常对照组与肥胖模型组，正常对照组10只，每笼5只动物，给予大鼠正常生长饲料；肥胖模型组25只，每笼5只动物，给予肥胖模型高脂饲料喂养。每日观察动物生长情况，每周称重。

当肥胖模型组与正常对照组动物体重有显著性差异后，表明造模成功，将肥胖模型组动物随机分成模型对照组、实施例3组，每组仅取11只。正常对照组动物保持不变。

3.1.3动物给药

将模型对照组、实施例3组大鼠下腹部被毛剔除干净，约4×4cm大小，便于涂抹赋形剂膏基或WE外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)。正常对照组动物不做处理，不给予任何药物。

给药方法：模型对照组去毛皮肤给予赋形剂膏基，实施例3组动物去毛处给予即实施例3所制得的乳膏剂。

模型对照组每次取2g赋形剂膏基(实施例3所得膏基)于去毛皮肤上，反复轻揉涂抹均匀，每日上午、下午各一次。

实施例3组每次取2g即实施例3所制得的乳膏剂于去毛皮肤上，反复轻揉至涂抹均匀，每日上午、下午或一次。

正常对照组动物不给予任何药物。给药方案见下表11。

表11 WE外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)给药方案

各组动物在给药期间均喂养大鼠正常生长饲料，每笼120g饲料固定量喂养，避免由于不同组别动物进食量不同造成体重差别。

3.1.4结果检测

各组动物每周称一次体重，计算各组每周动物体重值及体重较上周体重变化值，做统计学处理。给药期满，各组动物取肾周围脂肪与睾丸周围脂肪称重，与体重相比，求脂/体比，做统计学处理。

动物给予高脂饲料造模体重变化情况见表12。

造模分组给药后，各组动物体重情况见表13。

给药后各组动物体重较前一周体重增长或减少情况见表14。

各组肾周围脂肪与睾丸周围脂肪的脂/体结果见表15。

表12给予高脂饲料喂养造模大鼠体重变化

注：表中与正常对照组比较，▲▲P<0.01

表12显示，给予高脂饲料4周，动物体重显著增加，与正常对照组动物体重比较，差异非常显著▲▲P<0.01，动物肥胖模型造模成功。

表13造模分组后给予药物各组大鼠体重情况

注：表中与正常对照组比较，▲▲▲P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05

表14造模分组后给予药物后各组大鼠每周体重增长或减少情况

注：表中与模型对照组比较，*P<0.05、**<0.01、***<0.001。

表13结果显示，给药4周后，实施例3组动物体重明显减轻，与模型对照组比较，差异显著*P<0.05，表明WE外用制剂腹部给药能使体重减轻，有减肥作用。

表14结果显示，在给药期间，与模型对照组比较，实施例3组动物体重增长量均减少，差异显著*P<0.05或极显著***<0.001，表明WE外用制剂腹部给药具有使体重增长量减少，体重减轻，具有减肥作用。

表15给予药物4周大鼠肾、睾丸周围脂肪量及其脂/体比值(g，)

注：表中与正常对照组比较，▲P<0.05、▲▲P<0.01。

表15结果显示，大鼠睾丸周围脂肪的脂体比，与正常对照组比较，模型对照组、实施例3组均显差异著▲P<0.05或非常显著▲▲P<0.01，进一步证明本次试验高脂饲料肥胖模型造模成功。

与模型对照组比较，实施例3组肾周围脂肪及脂/体比值、睾丸周围脂肪及脂/体比值，以及肾与睾丸周围总脂肪及脂/体比值，均无显著性差异(P>0.05)，表明WE外用制剂腹部给药减肥作用不是减少肾与睾丸周围脂肪组。

3.1.4小结

第一次试验肥胖模型造模成功。

大鼠腹部去毛给予WE外用制剂，动物体重减轻，体重长增量减少，表明本品具有减肥作用，但其减肥作用并不是减少肾与睾丸周围脂肪。推测本品并不能吸收入血通过全身代谢减少体内脂肪，可能是皮下吸收，减少皮下脂肪。

3.2第二次减肥药效学试验

3.2.1剂量设计

实施例3组动物皮肤每次给予WE外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)2g，每天给予2次；模型对照组给动物皮肤每次给予赋形剂(实施例3所得膏基)2g，每天给予2次。3.2.2动物造模及分组

取购得的雄性大鼠60只(体重180-200g，由四川省医药科学院·四川省人民医院实验动物研究所提供)，分为正常对照组与肥胖模型组，正常对照组12只动物，每笼6只动物，给予大鼠正常生长饲料；肥胖模型组48只，每笼6只动物，给予肥胖模型高脂饲料喂养。每日观察动物生长情况，每周称重。

当肥胖模型组与正常对照组动物体重有显著性差异后，表明造模成功，选择体重400g以上肥胖动物，随机分为模型对照组、实施例3组，每组12只。正常对照组动物保持不变。

3.2.3动物给药

将模型对照组、实施例3组大鼠下腹部、背下部及侧部被毛剔除干净，总共约8×4cm大小(动物下腹、背、侧一圈去毛曝露皮肤)，便于涂抹赋形剂膏基或WE外用制剂(药物即实施例3所制得的乳膏剂)。正常对照组动物不做处理，不给予任何药物。

给药方法：模型对照组给予赋形剂膏基、药物组动物给予WE外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)。模型对照组每次取2g赋形剂膏基于去毛皮肤上，反复轻揉涂抹均匀，每日上午、下午各一次；

实施例3组每次取2g WE外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)于去毛皮肤上，反复轻揉至涂抹均匀，每日上午、下午或一次；

正常对照组动物不给予任何药物。

给药方案如下。

模型对照组、实施例3组在给药的1-4周给予高脂饲料；在给药的5-8周，给予大鼠正常生长饲料喂养，且给予量均为23g/只。第9周给予正常生长饲料，但不给予WE外用制剂。正常对照组一直给予大鼠正常生长饲料喂养。

3.2.4结果检测

各组动物每周称一次体重，计算各组动物每周体重值及体重较上周体重变化值，不定期测定动物体长与腹围，做统计学处理。给药期满，各组动物取肾周围脂肪与睾丸周围脂肪称重，与体重相比，计算脂/体比值，同时对腹部相同部位打孔取相同大小皮肤(含皮下脂肪)称重，做统计学处理。

(1)造模结果统计

动物给予高脂饲料造模体重变化情况见表16。

给予高脂饲料造模第3周、第4周动物身长、腹围值及Lee,s指数、腹围/体重比值见表17、表18。

Lee’s指数＝[体重(g)×1000]1/3/体长(cm)

表16给予高脂饲料造模期间大鼠体重变化(第二次试验)

注：表中与正常对照组比较，▲P<0.05、▲▲P<0.01、▲▲▲P<0.001。

表16显示，给予高脂饲料4周，高脂饲料组动物体重显著增加，与正常饲料组动物体重比较，差异显著▲P<0.05、非常显著▲▲P<0.01、或极显著▲▲▲P<0.001，动物肥胖模型造模成功。

表17给予高脂饲料造模3周大鼠Lee,s指数、腹围/体重比值(第二次试验)

注：表中与正常对照组比较，▲P<0.05、▲▲P<0.01、▲▲▲P<0.001。

表17结果显示，给予高脂饲料造模3周，动物腹围有不同程度的增长，与正常对照组比较有显著性差异，但考虑体重因素计算Lee,s指数、腹围/体重比值，未见显著差异。

表18给予高脂饲料造模4周大鼠Lee,s指数、腹围/体重比值(第二次试验)

注：表中与正常对照组比较，▲P<0.05、▲▲P<0.01、▲▲▲P<0.001。

表18结果显示，给予高脂饲料造模4周动物身长、腹围有不同程度的增长，与正常对照组比较，部分动物有显著性差异，但考虑体重因素的Lee,s指数、腹围/体重比值未见明显差异。

(2)给药期间结果统计

造模分组给药后，各组动物体重情况见表19；

给药后各组动物体重较前一周体重增长或减少情况见表20。

表19给予高脂饲料造模期间动物体重统计(g，)(第二次试验)

表19结果显示，与模型对照组比较，实施例3组动物在给药期间(第9周未给药)，体重无明显差异P>0.05。

表20造模成功分组给予药物期间动物体重变化统计(g，)(第二次试验)

表20结果，与模型对照组比较，实施例3组在给药第6周、7周体重增长减少或体重减少，分别为差异显著*P<0.05、差异非常显著**P<0.01；低剂量在给药第7周、8周体重减少，均差异显著*P<0.05，表明WE外用制剂具有使体重增长量减少，或减轻体重作用。

(3)给药期满结果统计

各组肾周围脂肪与睾丸周围脂肪的脂/体结果见表21、动物打孔皮肤重量统计结果比较见表22。

表21给予药物8周大鼠肾、睾丸周围脂肪量及其脂/体比值(g，)(第二次试验)

注：表中与正常对照组比较，▲▲P<0.01。

表21结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾周围脂肪增多，差异非常显著▲▲P<0.01，进一步证明本试验高脂饲料肥胖模型造模成功。

与模型对照组比较，实施例3组肾周围脂肪、脂/体比值、睾丸周围脂肪、脂/体比值，以及肾与睾丸周围总脂肪、脂体比值，均无显著性差异(P>0.05)，但实施例3组肾与睾丸周围总脂肪有减少趋势，可表明WE外用制剂皮肤给药减肥作用不是减少肾与睾丸周围脂肪。

表22各组动物打孔皮肤重量及皮下脂肪厚度统计结果

表22结果显示，动物腹部相同部位打孔取得的含皮下脂肪皮肤，与正常对照组比较，模型对照组皮肤重量增高，差异非常显著▲▲P<0.01，进一步证明肥胖模型造模成功；

与模型对照组比较，实施例3组皮肤减轻，差异非常显著**P<0.01，表明WE外用制剂具有减少用药部位皮下脂肪的作用。

3.2.4小结

本品第二次试验肥胖模型造模成功；大鼠皮肤给予WE外用制剂，给药6、7、8周体重长增量减少，表明本品具有减肥作用。经检测，药物组肾、睾丸周围脂肪减少不明显，腹部皮下脂肪减少明显，认为本品减肥作用主要作用于药物涂抹部位的皮下脂肪。

4毒理学考查

取药效学第二次试验动物，在处死取肾、睾丸脂肪及腹部皮肤时，取动物的血液进行检测，同时分离血清测定血清生化值，考查实施例3组生化与血液学指标是否有异常变化。检查指标如下：

肝功能

丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、白/球比值(A/G)、总胆红素(T-Bil)

肾功能

尿素(Urea)、肌酐(Crea)

血糖(Glu)

肌酸激酶(CK)

血脂总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)

血清电解质

钾离子浓度(K)、钠离子浓度(Na)、氯离子浓度(Cl)

血液学

红细胞数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞宽度变异系数(RDW-CV)、红细胞宽度标准差(RDW-SD)；白细胞数(WBC)、粒细胞绝对值(GRA)、淋巴细胞绝对值(LYM)、中间细胞绝对值(MID)、单核细胞(MON)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)。血小板数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)；凝血酶原时间(PT)。

4.1对大鼠血液学的影响表23。

表23 WE外用制剂皮肤给药2个月对大鼠血液学的影响

表23-续表

表23显示，给药2个月与正常对照组比较，模型组NEU、RDW-SD降低，差异显著▲P<0.05；实施例3组MCV、RDW-SD降低，差异显著▲P<0.05。各药物组与模型对照组比较，差异不显著P>0.05。

4.1对大鼠肝功能的影响表24。

表24 WE外用制剂皮肤给药2个月对大鼠肝功能的影响

表24显示，给药2个月与正常对照组比较，模型对照组、实施例3组ALP值降低，差异非常显著▲▲P<0.01。实施例3与模型对照组比较，差异不显著P>0.05。

4.3对大鼠肾功能的影响表15。

表25 WE外用制剂皮肤给药2个月对大鼠肾功能的影响

表25显示，给药2个月模型对照组、实施例3组与正常对照组比较，差异不显著P>0.05。实施例3组与模型对照组比较，差异不显著P>0.05。

4.4对大鼠血糖和肌酸激酶的影响见表16。

表26 WE外用制剂皮肤给药2个月对大鼠血糖和肌酸激酶的影响

表26显示，给药2个月模型对照组、实施例3组与正常对照组比较，差异不显著P>0.05。实施例3组与模型对照组比较，差异不显著P>0.05。

4.5对大鼠血脂的影响见表27。

表27 WE外用制剂皮肤给药2个月对大鼠血脂的影响

表27显示，给药2个月模型对照组、实施例3组与正常对照组比较，差异不显著P>0.05。实施例3组与模型对照组比较，差异不显著P>0.05。

4.6对大鼠血清电解质的影响见表28。

表28 WE外用制剂皮肤给药2个月对大鼠血清电解质的影响

表28显示，给药2个月模型对照组、实施例3组与正常对照组比较，差异不显著P>0.05。实施例3与模型对照组比较，差异不显著P>0.05。

4.7小结

WE外用制剂皮肤给药2个月，与正常对照组比较，模型对照组、实施例3组个别血液学与生化指标有显著性差异，可能是由于给予高脂饲料造成肥胖模型引起。

与模型对照组比较，实施例3组血液学、生化指标均无显著性差异，表明药物未引起明显毒性反应。

5结论

WE外用制剂(即实施例3所制得的乳膏剂)具有减肥作用，其减肥作用主要作用于给药部位的皮下脂肪，具有减少皮下脂肪作用。

大鼠按2g/次，一日二次皮肤给药2个月，未见明显毒性反应。

我们对实施例4所制得的用于减少皮下脂肪的乳膏剂也做了相应的皮肤过敏性试验、皮肤刺激性试验以及相应的药效学试验，其试验结果与实施例3所制得的用于减少皮下脂肪的乳膏剂的试验结果并无明显差别，故在此不作敷述。

Claims (10)

1.一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物，该提取物中的有效成分包含从任何提取溶剂中提取的茯苓有效成分。

2.根据权利要求1所述的茯苓提取物，所述任何提取溶剂包括有机溶剂和无机溶剂。

3.根据权利要求2所述的茯苓提取物，所述提取物是通过甲醇提取浓缩得到。

4.根据权利要求1所述的茯苓提取物，该提取物是在0~200℃下提取。

5.根据权利要求4所述的茯苓提取物，该提取物是在0~80℃下提取。

6.一种根据权利要求1~5任意所述的减少皮下脂肪的茯苓提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）原料预处理：将茯苓方丁粉碎成粉，于40℃蒸馏水中浸泡过夜；

（2）首次提取：将浸泡的茯苓粉滤干后加入70%的甲醇在70℃下机械下搅拌提取2h，抽滤，分别得滤液和滤饼备用；

（3）二次提取：滤饼置于70%的甲醇在70℃下机械下搅拌提取2h，抽滤，将两次滤液合并后静置过夜，最后在50℃下进行单效浓缩，真空干燥，得浅褐色干浸膏。

7.一种根据权利要求1~5任意所述的减少皮下脂肪的茯苓提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

取茯苓置于10倍量40℃水中浸泡2h，煎煮2h，滤过，收集煎煮液；滤渣中再加入8倍量的水，煎煮2h，滤过，合并煎煮液后静置过夜，最后在50℃下进行单效浓缩，真空干燥，得浅褐色干浸膏。

8.一种用于减少皮下脂肪的茯苓提取物的用途，所述提取物包括权利要求6或7所述的方法制备的提取物，可制备成乳膏剂以及制药上可接受的赋形剂。

9.一种减少皮下脂肪的方法，所述方法为将茯苓提取物制备成的乳膏剂以及制药上可接受的赋形剂以外用的方式涂抹至皮肤表面。

10.一种用于减少皮下脂肪的乳膏剂，所述乳膏剂中含有采用权利要求6或7中的方法制得的茯苓提取物，所述乳膏剂由以下制备方法制得：

（1）膏基的制备：取硬脂酸75Kg、单硬脂酸甘油酯5Kg、十六烷醇5Kg、丁二醇50L、液体石蜡5L，并置于90℃恒温搅拌，溶解，随后再加入500L水、10L浓度为10%的NaOH、2Kg尼泊金、4L氮酮和1L香精，制得膏基；

（2）取13Kg茯苓提取物+500Kg膏基，90℃混合乳化，分装，装箱，打包，得用于减少皮下脂肪的乳膏剂。