CN109757375A - 一种降香黄檀的组培苗继代增殖培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降香黄檀的组培苗继代增殖培养基，属于植物育种领域，培养基的大量元素由NH₄NO₃、KH₂PO₄、KNO₃以及MgSO₄·7H₂O组成，有利于提高降香黄檀的增殖效率，包括增殖倍数的提高以及增殖苗高度的提高；在合适的大量元素配比下，营养成分符合降香黄檀组培苗增殖生长的需要，才能够均衡而平稳地供给降香黄檀组培苗的生长发育，并保证降香黄檀组培苗既有较高的增殖倍数又有较快的生长速度。

Description

一种降香黄檀的组培苗继代增殖培养基

技术领域

本发明属于植物育种领域，特别涉及降香黄檀的组培苗继代增殖培养基。

背景技术

降香黄檀(Dalbergia odorifera T.Chen)是蝶形花科(Papilionoideae)黄檀属植物，又名花梨木，为半落叶乔木树种，其木材极其珍贵，为国家二级保护植物，是我国国家标准5属8类34种红木之一。降香黄檀原产海南，适宜热带、亚热带等地生长，喜光，心材形成所需时间长，天然林通常需要50年左右才具有较高的经济价值，由于过度采伐利用，天然资源受到严重破坏，降香黄檀面临着绝迹的危险。为了满足市场对降香黄檀木材的需求，华南地区开展了降香黄檀用材林的建设。目前人工林的种苗主要采用种子苗，种子苗基因组杂合程度高，造林分化大，心材形成的质量不稳定，影响了种植户的积极性。

因此，如果从源头开始着手，先选择优树，然后以优树为母本进行无性繁殖，就能保证人工造林用苗木的质量。但是在降香黄檀组培快繁过程中，组培苗增殖倍数较低，生长速度较慢，组培苗的生产成本偏高，导致出售价格较高，不利于优良无性系的推广，满足不了市场对降香黄檀优良无性系苗的需要。针对现在存在的问题，我们对降香黄檀组培苗增殖培养基的大量元素配比进行了探究。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种降香黄檀的组培苗继代增殖培养基。

本发明所采取的技术方案是：

一种降香黄檀组培苗继代增殖培养基，该培养基包括大量元素、微量元素、有机成分、蔗糖、琼脂和植物激素；所述大量元素中NH₄NO₃的含量为正常MS的0.1～1倍、KH₂PO₄

的含量为正常MS的0.5～1.5倍、KNO₃的含量为正常MS的0.5～1倍、MgSO₄·7H₂O

的含量为正常MS的0.5～1.5倍。

进一步的，该培养基中NH₄NO₃的含量为正常MS的0.25～1倍、KH₂PO₄的含量为正常

MS的1～1.5倍、KNO₃的含量为正常MS的0.5～1倍、MgSO₄·7H₂O的含量为正常MS

的1～1.5倍。

进一步的，该培养基中NH₄NO₃的含量为正常MS的0.25倍、KH₂PO₄的含量为正常MS

的1.5倍、KNO₃的含量为正常MS的1倍、MgSO₄·7H₂O的含量为正常MS的1.5倍。

进一步的，正常MS培养基中NH₄NO₃含量为1650mg/L、KH₂PO₄为170mg/L、KNO₃

含量为1900mg/L、CaCl₂·2H₂O为440mg/L、MgSO₄·7H₂O为370mg/L。

进一步的，该培养基不含氯化钙，所述的微量元素、有机成分和蔗糖均与正常MS培养

基相同。

上述任一项所述的降香黄檀组培苗继代增殖培养基的制备方法，包括以下步骤：按配方

称取大量元素、微量元素、有机成分，混合，加到已融化的琼脂和蔗糖中搅拌均匀，再

加入植物激素，调pH，灭菌冷却即得降香黄檀组培苗的继代增殖培养基。

进一步的，所述的植物激素为6-苄氨基腺嘌呤和/或塞苯隆。

进一步的，所述蔗糖含量为30g/L。

进一步的，所述琼脂含量为6g/L。

进一步的，所述的pH为5.5～6。

进一步的，所述的灭菌在120～126℃下灭菌15～20min。

本发明的有益效果是：

本发明对降香黄檀进行组织培养，得出一种适合降香黄檀组培苗继代增殖的配方，其中探索出大量元素的最佳配比，有利于提高降香黄檀组培苗的增殖效率，包括提高增殖倍数以及增殖苗高。只有在合适的大量元素配比下，营养成分符合降香黄檀组培苗增殖生长的需要，才能够均衡而平稳地供给降香黄檀组培苗的生长发育，并保证降香黄檀组培苗既有较高的增殖倍数又有较快的生长速度。

附图说明

图1是硝酸铵(NH₄NO₃)对降香黄檀增殖倍数的影响折线图。

图2是硝酸铵(NH₄NO₃)对降香黄檀增殖苗高的影响折线图。

图3是磷酸二氢钾(KH₂PO₄)对降香黄檀增殖倍数的影响折线图。

图4是磷酸二氢钾(KH₂PO₄)对降香黄檀增殖苗高的影响折线图

图5是硝酸钾(KNO₃)对降香黄檀增殖倍数的影响折线图。

图6是硝酸钾(KNO₃)对降香黄檀增殖苗高的影响折线图。

图7是硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)对降香黄檀增殖倍数的影响折线图。

图8是硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)对降香黄檀增殖苗高的影响折线图。

图9是氯化钙(CaCl₂·2H₂O)对降香黄檀增殖倍数的影响折线图。

图10是氯化钙(CaCl₂·2H₂O)对降香黄檀增殖苗高的影响折线图。

图11是不同浓度的氯化钙(CaCl₂·2H₂O)对降香黄檀组培苗增殖的影响图，其中图A氯化钙浓度为0，图B氯化钙浓度为0.5MS，图C氯化钙浓度为1MS(标准MS培养基浓度)。

具体实施方式

实施例1

(1)硝酸铵(NH₄NO₃)的浓度对降香黄檀组培苗增殖倍数及增殖苗高的影响

实验方法：设置四个培养基(具体的培养基大量元素的浓度如表1)，其中硝酸铵浓度不同，硝酸钾(KNO₃)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、微量元素、及有机成分均与MS标准培养基相同，将各成分混合，加入到已融化的琼脂(琼脂的含量为6g/L)和蔗糖(30g/L)中搅拌均匀，最后加入植物激素6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L以及TDZ(Thidiazuron，塞苯隆)0.02mg/L，调节pH至5.8，120℃灭菌15min，冷却即得到降香黄檀组培苗继代增殖培养基1A～1D。

其中各微量元素含量如下：KI 0.83mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L、Na₂MoO₄ 0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、Na₂EDTA·2H₂O 37.3mg/L。

各有机成分含量如下：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆素0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L。

每种培养基接种降香黄檀组培单芽母苗10瓶，每瓶接4株单芽母苗。培养一个月后，统计每种培养基中降香黄檀组培苗的每月增殖倍数(每月增殖倍数＝每月新增芽数/母芽数)和增殖新苗的月生长高度(培养一个月后，用直尺测量每株增殖新苗的高度，单位是cm)。

表1不同硝酸铵(KNO₃)浓度的培养基

结果表明：0.25MS(即412.5mg/L)的KNO₃(KNO₃的浓度为正常MS培养基的0.25倍，)最适合降香黄檀组培苗的增殖，增殖倍数最大，增殖倍数为1.1倍/月(图1)，增殖苗月生长速度最高，平均达到1.4cm/月(图2)；当KNO₃浓度大于0.25MS，随着KNO₃浓度的增加，降香黄檀组培苗的增殖倍数和增殖苗高都在下降，但是均略高于对照组(硝酸铵为0MS)。

(2)磷酸二氢钾(KH₂PO₄)的浓度对降香黄檀组培苗增殖倍数及增殖苗高的影响

实验方法：设置四个培养基(具体的培养基大量元素的浓度如表2)，其中磷酸二氢钾(KH₂PO₄)浓度不同，硝酸铵(NH₄NO₃)、硝酸钾(KNO₃)、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、微量元素及有机成分与标准MS培养基均相同，各成分混合，加入到已融化的琼脂和蔗糖(30g/L)中搅拌均匀，最后加入植物激素6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L以及TDZ(Thidiazuron，塞苯隆)0.02mg/L，调节pH至5.8，120℃灭菌20min，冷却即得到降香黄檀组培苗继代增殖培养基2A～2D。

每种培养基接种降香黄檀组培单芽母苗10瓶，每瓶接4株单芽母苗。培养一个月后，统计每种培养基中降香黄檀组培苗的每月增殖倍数(每月增殖倍数＝每月新增芽数/母芽数)和增殖新苗的月生长高度(培养一个月后，用直尺测量每株增殖新苗的高度，单位是cm)。

表2不同磷酸二氢钾(KH₂PO₄)浓度的培养基

结果表明：1.5MS(即255mg/L)的KH₂PO₄(KH₂PO₄的浓度为正常MS培养基的1.5倍)最适合降香黄檀组培苗的增殖，增殖倍数最大，增殖倍数为2.0/月(图3)，同时增殖苗高也是最高的，生长高度达到1.6cm/月(图4)；降香黄檀组培苗的增殖倍数和增殖苗生长高度与磷酸二氢钾浓度呈明显的正相关性(图3、图4)。

(3)硝酸钾(KNO₃)的浓度对降香黄檀组培苗增殖倍数及增殖苗高的影响

实验方法：设置四个培养基(具体的培养基大量元素的浓度如表3)，其中硝酸钾浓度不同，硝酸铵(NH₄NO₃)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、微量元素及有机成分与标准MS培养基均相同，各成分混合，加入到已融化的琼脂和蔗糖(30g/L)中搅拌均匀，最后加入植物激素6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L以及TDZ(Thidiazuron，塞苯隆)0.02mg/L，调节pH至5.8，124℃灭菌18min，冷却即得到降香黄檀组培苗继代增殖培养基3A～3D。

每种培养基接种降香黄檀组培单芽母苗10瓶，每瓶接4株单芽母苗。培养一个月后，统计每种培养基中降香黄檀组培苗的每月增殖倍数(每月增殖倍数＝每月新增芽数/母芽数)和增殖新苗的月生长高度(培养一个月后，用直尺测量每株增殖新苗的高度，单位是cm)。

表3不同硝酸钾(KNO₃)浓度的培养基

结果表明：0.5MS的KNO₃(即950mg/L，KNO₃的浓度为正常MS培养基的0.5倍)最利于降香黄檀组培苗的增殖，增殖倍数最高，增殖倍数为1.6倍/月(图5)，当KNO₃的浓度升高至1MS，降香黄檀组培苗的增殖倍数稍有下降为1.5倍/月；进一步提高KNO₃的浓度至1.5MS，降香黄檀组培苗的增殖倍数骤降为1.2倍/月，可见降香黄檀组培苗的增殖倍数与硝酸钾的浓度在一定范围内呈负相关。但是增殖苗的生长高度却随着培养基中的硝酸钾浓度的升高而升高，1.5MS的培养基中增殖苗生长速度最快，平均为2cm/月(图6)。因此综合考虑增殖苗生长速度以及增殖倍数两个方面的因素，选择1MS的KNO₃浓度最适合降香黄檀组培苗的培养，既能保证降香黄檀组培苗较高的增殖倍数，又能兼顾增殖苗有较快的生长速度。

(4)硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)的浓度对降香黄檀组培苗增殖倍数及增殖苗高的影响

实验方法：设置四个培养基(具体的培养基大量元素的浓度如表4)，其中MgSO₄·7H₂O浓度不同，硝酸铵(NH₄NO₃)、硝酸钾(KNO₃)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、微量元素及有机成分均与标准MS培养基均相同，各成分混合，加入到已融化的琼脂和蔗糖(30g/L)中搅拌均匀，最后加入植物激素6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L以及TDZ(Thidiazuron，塞苯隆)0.02mg/L，调节pH至5.8，120～126℃灭菌15～20min，冷却即得到降香黄檀组培苗培养基4A～4D。

表4不同硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)浓度的培养基

每种培养基接种降香黄檀组培单芽母苗10瓶，每瓶接4株单芽母苗。培养一个月后，统计每种培养基中降香黄檀组培苗的每月增殖倍数(每月增殖倍数＝每月新增芽数/母芽数)和增殖新苗的月生长高度(培养一个月后，用直尺测量每株增殖新苗的高度，单位是cm)。

结果表明：1.5MS的MgSO₄·7H₂O(即555mg/L)(MgSO₄·7H₂O的浓度为正常MS培养基的1.5倍)最有利于降香黄檀组培苗的增殖，增殖倍数最高，增殖倍数为1.1倍/月(图7)；1.5MS的培养基中增殖苗的高度也是最高的，平均为1.1cm(图8)，故降香黄檀组培苗继代增殖培养基中的硫酸镁的浓度应选择1.5MS。

(5)氯化钙(CaCl₂·2H₂O)的浓度对降香黄檀组培苗增殖倍数及增殖苗高的影响

实验方法：设置三个培养基(具体的培养基大量元素的浓度如表5)，其中CaCl₂·2H₂O浓度不同，硝酸铵(NH₄NO₃)、硝酸钾(KNO₃)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)的浓度均相同，微量元素、有机成分的浓度均与标准MS培养基相同，各成分混合，加入到已融化的琼脂和蔗糖(30g/L)中，最后加入植物激素6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L以及TDZ(Thidiazuron，塞苯隆)0.02mg/L，搅拌均匀，调节pH至5.8，120～126℃灭菌15～20min，冷却即得到降香黄檀组培苗培养基5A～5C。每种培养基接种降香黄檀组培单芽母苗10瓶，每瓶接4株单芽母苗。培养一个月后，统计每种培养基中降香黄檀组培苗的每月增殖倍数(每月增殖倍数＝每月新增芽数/母芽数)和增殖新苗的月生长高度(培养一个月后，用直尺测量每株增殖新苗的高度，单位是cm)。

表5不同氯化钙(CaCl₂·2H₂O)浓度的培养基

结果表明：CaCl₂·2H₂O不利于降香黄檀组培苗的增殖及生长，因为相对于对照(氯化钙0MS)，添加一定浓度的CaCl₂·2H₂O后，降香黄檀组培苗的增殖倍数逐渐减少(图9)，增殖苗的高度也在下降(图10)，并开始出现叶片脱落的现象，尤其是当氯化钙的浓度上升到1MS时，增殖苗会出现叶片大量脱落的现象(图11的A～C)。因此在降香黄檀组培苗的增殖培养中，不需要添加CaCl₂·2H₂O。

根据上述不同大量元素的配比实验，得出本发明最优的降香黄檀组培苗继代增殖培养基的大量元素配比为：NH₄NO₃含量为0.25MS、KH₂PO₄含量为1.5MS、KNO₃含量为1MS、MgSO₄·7H₂O含量为1.5MS及CaCl₂·2H₂O含量为0MS；本发明降香黄檀组培苗继代增殖培养基的其他成分(如微量元素、有机成分及蔗糖)均与标准MS培养基一致。

标准MS培养基降香黄檀组培苗的大量元素配比为：硝酸铵(NH₄NO₃)1650mg/L、硝酸钾(KNO₃)1900mg/L、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)440mg/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)370mg/L、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)170mg/L。除了硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁及氯化钙不同，本发明继代增殖培养基的硝酸钾(采用浓度是1MS，与标准MS培养基的浓度一致)、微量元素、有机成分及蔗糖均和标准MS培养基的成分及其含量均相同。

使用本发明最优的降香黄檀组培苗继代增殖培养基和标准MS培养基分别加入植物激素6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L、TDZ(Thidiazuron，塞苯隆)0.02mg/L及琼脂6g/L混合而成2种培养基进行对比试验，在同样光照、水分等条件下，分别培养降香黄檀组培苗，一个月后，发现本发明组培苗月增殖倍数远远高于对照组(见表6)，增殖苗的月增殖倍数是对照组的1.7倍，增殖苗的月平均生长高度是对照组的1.5～1.7倍。证明本发明最优的降香黄檀组培苗继代增殖培养基有助于组培苗的增殖和生长。

表6增殖情况对比

综上所述，根据各种大量元素不同浓度配比试验的结果，标准MS培养基不适合降香黄檀组培苗的增殖及生长，需要对标准MS培养基进行大量元素配比的调整，通过筛选确定大量元素配比：NH₄NO₃含量为0.25MS、KH₂PO₄含量为1.5MS、KNO₃含量为1MS、MgSO₄·7H₂O含量为1.5MS并且除去标准MS培养基中的CaCl₂·2H₂O成分才有利于降香黄檀组织培养苗的生长以及繁殖。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种降香黄檀组培苗继代增殖培养基，其特征在于，该培养基包括大量元素、微量元素、有机成分、蔗糖、琼脂和植物激素；所述大量元素中NH₄NO₃的含量为正常MS的0.1～1倍、KH₂PO₄的含量为正常MS的0.5～1.5倍、KNO₃的含量为正常MS的0.5～1倍、MgSO₄·7H₂O的含量为正常MS的0.5～1.5倍。

2.根据权利要求1所述的降香黄檀组培苗继代增殖培养基，其特征在于，该培养基中NH₄NO₃的含量为正常MS的0.25～1倍、KH₂PO₄的含量为正常MS的1～1.5倍、KNO₃的含量为正常MS的0.5～1倍、MgSO₄·7H₂O的含量为正常MS的1～1.5倍。

3.根据权利要求1所述的降香黄檀组培苗继代增殖培养基，其特征在于，该培养基中NH₄NO₃的含量为正常MS的0.25倍、KH₂PO₄的含量为正常MS的1.5倍、KNO₃的含量为正常MS的1倍、MgSO₄·7H₂O的含量为正常MS的1.5倍。

4.根据权利要求1～3任一项所述的降香黄檀组培苗继代增殖培养基，其特征在于，正常MS的培养基中NH₄NO₃含量为1650mg/L、KH₂PO₄为170mg/L、KNO₃含量为1900mg/L、CaCl₂·2H₂O为440mg/L、MgSO₄·7H₂O为370mg/L。

5.根据权利要求4所述的降香黄檀组培苗继代增殖培养基，其特征在于，该培养基不含氯化钙，所述的微量元素、有机成分和蔗糖均与正常MS培养基相同。

6.权利要求1～5任一项所述的降香黄檀组培苗继代增殖培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按配方称取大量元素、微量元素、有机成分，混合，加到已融化的琼脂和蔗糖中搅拌均匀，再加入植物激素，调pH，灭菌冷却即得降香黄檀组培苗的继代增殖培养基。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的植物激素为6-苄氨基腺嘌呤和/或塞苯隆。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的pH为5.5～6。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的灭菌在120～126℃下灭菌15～20min。