CN109734754A - 一种复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法 - Google Patents
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Abstract
一种复合酶催化活化桑叶提制芦丁的方法，属于芦丁提取技术领域。本发明以桑叶为原料，经桑叶预处理、复合酶催化活化浸提、分离纯化、冷冻干燥的简单工艺而得到产品。本发明方法使用的复合酶在水浴35℃，催化活化60min，芦丁溶出质量可达15.388mg/L；经制备型高效液相色谱分离纯化、冷冻干燥制得高纯度芦丁产品，其提取量为0.7849mg/g，纯度为99%。本发明方法的原料来源广，具有桑叶利用充分，制备的芦丁产品提取率和纯度高、且生物活性完备，生产设备腐蚀小，有机溶剂使用量少，有利于环境保护等特点。本发明可广泛应用于从烟草固体废弃物中提取茄尼醇、烟碱以及果胶等天然产物，有效实现了废次烟草的资源化再利用。
Description
技术领域
本发明属于芦丁提取技术领域，具体涉及多种酶协同催化活化桑叶提取芦丁的方法。
背景技术
桑叶含水分75%，干物质25%，且含有多种维生素、矿物质、以及黄酮类化合物及生物碱等高附加值的天然活性成分，营养成分丰富而均匀。其中，黄酮类化合物，约占桑叶干重的1％～3％，主要为芦丁、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-三葡糖苷等化合物。经现代医学及营养学研究证明，该类活性物质具有良好的降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、抗丝虫病、抗肿瘤作用。随着研究不断深入，桑叶有望成为老年性疾病和慢性疾病的治疗药品及保健产品，且在美容护肤、畜牧等方面具有广阔的前景。芦丁为双糖苷，浅黄色针状结晶物，分子式C27H30O16·3H2O，具有较大极性，主要存于植物细胞质中，植物组织结构阻碍芦丁的溶出，影响提取效率，进而影响桑叶利用率。因此，研究复合酶催化活化提取芦丁的方法，具有可观的经济价值和现实意义。
现有提取芦丁的方法，如2016年9月21日公开的公开号为CN105943621的“一种桑叶提取物的制备方法及其质量控制方法”，公开的方法是：桑叶切丝，加水煎煮提取2次，煮沸，煎煮提取共3小时，合并两煎滤液，过350目筛网滤过，得初滤液；取初滤液，过孔径为0.02微米的微孔滤膜，得精滤液；取精滤液过孔径为0.0005微米的反渗透膜浓缩到含固率为16%，得浓缩初液；取浓缩初液，在60℃以下真空减压浓缩到相对密度为1.11的浸膏，将浸膏进行喷雾干燥，即得桑叶提取物。该方法的主要的缺点是：（1）该方法先后经切丝、两次水煎煮提取、两次膜过滤、喷雾干燥得产品，生产步骤共7步，涉及多个生产设备和生产工艺，增加了生产的技术控制和生产设备的场地占用，从而增加生产成本；（2）该方法采用直接水煎煮浸泡桑叶，煎煮时间长（需3小时），且沸腾温度不仅破坏桑叶中天然产物的生物活性，影响提取物的品质，且同时导致致桑叶中脂溶性成分随桑叶固渣流失，直接影响产品的提取量，从而降低桑资源开发的经济价值；（3）该方法需0.02微米的微孔滤膜得精滤液，以及0.0005微米的反渗透膜浓缩得含固率为16%的浓缩初液，膜的选择及更新，进而增加生产成本。
发明内容
本发明的目的是，针对现有桑叶活性成分提取方法的不足，提供一种复合酶催化活化桑叶提制芦丁的方法，具有提取条件操作步骤少且简单、温和高效、环境污染小、生产能耗和成本低，分离纯化过程简单，单体纯度高等特点。
本发明机理是：本发明以桑叶为原料，选用复合酶（漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶）作为催化活化桑叶组织组织的活化剂，通过漆酶降解桑叶中桎梏纤维素的木质素，增加纤维素酶对纤维素的水解作用，减少芦丁溶出阻力，在乙醇水溶液中，增大芦丁提取率。采用酶活化处理桑叶植物组织，避免高温及长时间加热等条件破坏芦丁生物活性，提高芦丁提取率及产品品质；同时，复合酶的协同催化作用可提高桑叶植物组织的水解能效，进而避免化学活化剂酸、碱预处理以及浸提芦丁的有机溶剂的使用量，减少生产安全隐患，有利于环境保护，实现桑资源的资源化再利用。
实现发明目的的技术方案是：一种复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，以桑叶粉末为原料，在几种酶协同作用的反正体系中，经酶解催化、过滤、离心、定容，并采用高效液相进行检测分析及制备色谱的分馏提纯。所述方法的具体步骤如下：
（1）原料预处理
将采摘的新鲜桑叶用在50～70℃烘箱中烘4～6h，烘干的后的桑叶经粉碎机粉碎，过筛20～60目，装入密封袋，待用。
（2）复合酶催化活化浸提
第（1）步骤完成后，先按照第（1）步处理后的原料的质量(g)∶复合酶的质量(g)∶乙醇(mL)∶水(mL)之比为1∶0.1～0.15∶3～12∶17～25的比例，在第（1）步预处理后的原料中，加入复合酶及乙醇水溶液，搅拌均匀后，加入柠檬酸调整pH为3.5～5.5。再将调节pH值后的混合液放置于摇床中，在水浴温度为35～65℃下进行酶解活化40～110min后，将锥形瓶取出冷却至室温后，用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。收集的滤液即为桑叶粗提液，待用；收集的滤渣为桑叶残渣，收集后集中处置。然后将收集的浸出液转入100mL容量瓶并用蒸馏水定容后，转入离心管后，在转速2000～4000r/min下离心10～20min后得粗提离心液。最后取1mL粗提离心液于样品瓶中，在流动相乙腈（mL）﹕水（mL）=10﹕90～50﹕50，温度20～40℃，进样量5～20μL，流速为0.6～1mL/min条件下检测粗提液中芦丁质量。芦丁溶出质量为12～16mg/L。所述的酶为漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶，所述的复配酶的质量比为漆酶∶纤维素酶∶半纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶0.5～3∶0.5～4∶1～15。
（3）芦丁的分离纯化
第（2）步骤完成后，先将第（2）步收集的浸出离心粗提液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.4～0.6 Mpa、温度为80～100℃下，进行减压浓缩得桑叶浓缩液。然后用制备型高效液相色谱处理桑叶浓缩液进一步分离纯化，在流动相甲醇（mL）﹕水（mL）=10﹕90～50﹕50，进样量8～16mL，流速为15～30mL/min的条件下得到芦丁馏分。最后将芦丁馏分置于旋转蒸发器中，在真空压强为0.4～0.6 Mpa、温度为80～100℃下减压浓缩得浓缩液，即芦丁浓缩液。
（4）芦丁单体制备
第（3）步骤完成后，先将第（3）步所得芦丁浓缩液置于冰箱中冷冻后，转至真空冷冻干燥机中，干燥24～36h后，制得芦丁固体单体产品。芦丁提取量可达0.6～0.8mg/g，纯度高达96～99%。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果﹕
（1）本发明通过漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶等复合酶协同催化活化桑叶，实现酶解过程中桑叶中活性物质充分溶出，芦丁溶出质量可达15.388mg/L。且提取过程中仅使用少量无水乙醇，减少芦丁溶出传质阻力的同时，有利于环境的保护，促使芦丁浸取充分。
（2）本发明采用复合酶催化活化条件在35℃最佳，酶解时间仅为60min，操作简单，反应条件温和，且有机溶剂为乙醇，减少了生产过程中环境治理成本，提高生产安全性能，进一步降低生产成本。
（3）本发明采用桑叶为原料，易得，提取芦丁操作步骤简单、方法绿色环保。采用反相制备高效液相色谱技术（RP-HPLC）具有高柱效、高流速、高分离速度、操作简单等特点，可同时分离获得多种高纯度的天然产物。本发明方法可广泛应用于桑叶为原料提制异斛皮苷、绿原酸、隐绿原酸以及其他活性成分。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步说明：
实施例1
一种复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法的具体步骤如下：
（1）原料预处理
将采摘的新鲜桑叶用在60℃烘箱中烘5h，烘干的后的桑叶经粉碎机粉碎，过筛60目，装入密封袋，待用。
（2）复合酶酶解浸提及芦丁的检测
第（1）步骤完成后，先按照第（1）步处理后的原料的质量(g)∶酶的质量(g)∶乙醇(ml)∶水(ml)之比为1∶0.15∶5∶20的比例，在第（1）步预处理后的原料中，加入复合酶及乙醇水溶液，搅拌均匀后。加入柠檬酸调整pH为4.0。再将调节pH值后的混合液放置于摇床中，在水浴温度为35℃下进行酶解活化60min后，将锥形瓶取出冷却至室温后，用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。收集的滤液即为桑叶粗提液，待用；收集的滤渣为桑叶残渣，收集后集中处置。然后，将收集的浸出液转入100mL容量瓶并用蒸馏水定容后，转入离心管后，在转速4000r/min下离心15min后得粗提离心液。最后取1mL粗提离心液于样品瓶中，在流动相乙腈（mL）﹕水（mL）=20﹕80，温度25℃，进样量10μL，流速为1mL/min的条件下检测粗提液中芦丁质量，芦丁溶出质量为 15.388mg/L所述的酶为漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶，所述的复配酶的质量比为漆酶∶纤维素酶∶半纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶0.5∶0.5∶13。
（3）芦丁的分离纯化
第（2）步骤完成后，先将第（2）步收集的浸出离心粗提液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.5 Mpa、温度为90℃下，进行减压浓缩得桑叶浓缩液。然后用制备型高效液相色谱处理桑叶浓缩液进一步分离纯化，在流动相甲醇（mL）﹕水（mL）=20﹕80，进样量10mL，流速为20mL/min，的条件下得到芦丁馏分。最后将芦丁馏分置于旋转蒸发器中，在真空压强为0.5 Mpa、温度为90℃下减压浓缩得浓缩液，即芦丁浓缩液。
（4）芦丁单体制备
第（3）步骤完成后，先将第（3）步所得芦丁浓缩液置于冰箱中冷冻后，转移至真空冷冻干燥机中，干燥36h后，制得芦丁固体单体产品。芦丁提取量可达0.7849mg/g，纯度高达99%。
实施例2
一种复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法的方法，同实施例1，其中：
第（1）步中，烘箱温度为50℃，烘干时间为6h，过筛20目。
第（2）步中，原料的质量(g)∶酶的质量(g)∶乙醇(mL)∶水(mL)之比为1∶0.15∶8∶18的比例，反应温度为38℃，pH为5.0，反应时间为80min。离心机转速为3000r/min，离心时间为20min。高效液相色谱流动相乙腈（mL）与水（mL）之比为25﹕75，温度为20℃，进样量5μL，流速0.8mL/min，芦丁溶出质量为15.122mg/L ,参与反应的酶为漆酶。
第（3）步中，真空压强为0.4Mpa、温度为80℃下；制备色谱流动相甲醇（mL）与水（mL）之比为25:75，进样量为15mL，流速25mL/min。
第（4）步中，干燥时间为30h。
实施例3
一种复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，同实施例1，其中：
第（1）步中，烘箱温度为70℃，烘干时间为4h，过筛60目。
第（2）步中，原料的质量(g)∶酶的质量(g)∶乙醇(mL)∶水(mL)之比为1∶0.15∶12∶25的比例，反应温度为60℃，pH为4.5，反应时间为100min。转速为2500r/min，离心时间为10min。乙腈（mL）与水（mL）之比为15﹕85，温度为30℃，进样量20μL，流速0.6mL/min，芦丁溶出质量为14.776mg/L ，参与反应的酶为纤维素酶。
第（3）步中，真空压强为0.6Mpa、温度为100℃下；制备色谱制备色谱甲醇（mL）与水（mL）之比为15:85，进样量为8mL，流速15mL/min。
第（4）步中，干燥时间为24h。
实验结果
用同样的方法探讨酶解反应的pH值对芦丁及其他黄酮类活性物质的浸提率
1.实施例1~3芦丁的浸提量及纯度
表1.实施例1~3芦丁浸提量的比较
| 名称 | 芦丁提取量（mg/g） | 纯度（%） |
| 实施例1 | 0.7849 | 99 |
| 实施例2 | 0.7345 | 98.3 |
| 实施例3 | 0.7691 | 98.5 |
2.新鲜桑叶60℃烘干5h，粉碎过60目筛，取2.0g桑叶粉加入0.3g复合酶，按照料液比1:5加入10mL的无水乙醇，按照料液比1:20加入蒸馏水40mL。反应温度45℃，反应时间为60min，体系的不同pH值为对芦丁及其他活性物质的影响提取的影响实验。
表2.酶解体系不同pH值对芦丁浸提量的比较
| pH值 | 芦丁提取量（mg/g） |
| 3.5 | 0.6782 |
| 4.0 | 0.7860 |
| 4.5 | 0.6602 |
| 5.0 | 0.6082 |
| 5.5 | 0.5391 |
表3.酶解体系不同pH值对其他活性物质浸提量的比较
| pH值 | 绿原酸提取量（mg/g） | 异槲皮苷提取量（mg/g） |
| 3.5 | 4.2106 | 0.1202 |
| 4.0 | 4.5021 | 0.1288 |
| 4.5 | 4.9830 | 0.1244 |
| 5.0 | 4.3716 | 0.1054 |
| 5.5 | 4.2120 | 0.1025 |
从上述实验知：本发明采用复合酶催化活化处理桑叶固体废弃物制备活性炭，当桑叶质量比为1：0.15的复合酶（漆酶∶纤维素酶∶半纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶0.5∶0.5∶13），加入桑叶质量比1∶35的20%的乙醇水溶液，在水浴近室温条件下35℃，酶解时间为60min，经制备型高效液相色谱分离纯化、冷冻干燥可制得芦丁产品。该方法芦丁溶出充分，芦丁溶出质量可达15.388mg/L；且酶代替酸碱活化剂，制备条件温和，操作简单，芦丁产品提取率和纯度高，芦丁提取量可达0.7849mg/g，纯度高达99%，且生物活性完备；本发明方法的原料廉价易得，操作简单，生产过程中酸碱及有机溶剂的使用量减少，避免对生产设备的腐蚀以及对环境造成的二次污染，有利于环境保护，降低生产成本。
Claims (8)
1.一种复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，其特征在于包括以下几个步骤：
（1）将桑叶烘干，粉碎过筛
（2）在第（1）步预处理后的原料中，加入复合酶及乙醇水溶液、柠檬酸调整pH后放于摇床中，酶解活化后，用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和滤渣，收集的滤液即为桑叶粗提液，将收集的浸出液转入100mL容量瓶并用蒸馏水定容后，转入离心管后，离心得粗提离心液，最后取1mL粗提离心液于样品瓶中，通过高效液相色谱检测粗提液中芦丁质量
（3）先将第（2）步收集的浸出离心粗提液放置于在旋转蒸发器中，进行减压浓缩得桑叶浓缩液，然后用制备型高效液相色谱处理桑叶浓缩液进一步分离纯化，得到芦丁馏分，最后将芦丁馏分置于旋转蒸发器中，减压浓缩得芦丁浓缩液
（4）将第（3）步所得芦丁浓缩液置于冰箱中冷冻后，转至真空冷冻干燥机中，干燥制得芦丁固体单体产品。
2.根据权利要求1所述复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，其特征在于步骤（1）中烘箱温度可以为50～70℃，时间可以为4～6h，筛的目数可以为20～60。
3.根据权利要求1所述复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，其特征在于步骤（2）中原料的质量(g)∶复合酶的质量(g)∶乙醇(mL)∶水(mL)之比为1∶0.1～0.15∶3～12∶17～25的比例，柠檬酸调整pH为3.5～5.5，水浴温度可以为35～65℃，酶解活化时间是40～110min，离心机转速2000～4000r/min，离心时间10～20min。
4.根据权利要求1所述复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，其特征在于步骤（2）中流动相乙腈（mL）﹕水（mL）=10﹕90～50﹕50，温度20～40℃，进样量5～20μL，流速为0.6～1mL/min。
5.根据权利要求1所述复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，其特征在于步骤（2）中所述的酶为漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶，所述的复配酶的质量比为漆酶∶纤维素酶∶半纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶0.5～3∶0.5～4∶1～15。
6.根据权利要求1所述复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，其特征在于步骤（3）中旋转蒸发器的真空压强为0.4～0.6 Mpa、温度为80～100℃。
7.根据权利要求1所述复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，其特征在于步骤（3）中制备色谱条件是，流动相甲醇（mL）﹕水（mL）=10﹕90～50﹕50，进样量8～16mL，流速为15～30mL/min。
8.根据权利要求1所述复合酶催化活化桑叶提制高纯度芦丁的方法，其特征在于步骤（4）中冷冻干燥时间可以为24～36h。
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