CN105753920A - 一种从荔枝果肉中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从荔枝果肉中提取α‐葡萄糖苷酶抑制剂的方法，以荔枝果肉冷冻干燥粉末为原料，经超声提取，固相萃取柱去糖，凝胶树脂梯度洗脱，旋转蒸发，半制备，最后得到一种对α‐葡萄糖苷酶具有较高抑制活性的单体，为槲皮素3‐O‐芸香糖‐(1→2)‐O‐鼠李糖苷。该物质是荔枝果肉中含量最高的黄酮糖苷类物质。本方法提取步骤简单，耗能较少。提取过程的有机溶剂可回收利用，不产生有机污染。提取过程中使用的固相萃取柱及凝胶树脂均可反复利用，节省成本。本发明对于荔枝资源的合理利用，以及提高荔枝产品附加值具有重大意义。

Description

一种从荔枝果肉中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法
技术领域
本发明属于生物技术天然活性物质提取领域，涉及一种从荔枝果肉中提取新型α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。
背景技术
糖尿病(diabetesmellitus)是一种以体内高血糖为主要特征的内分泌系统疾病，分为胰岛素依赖型(Type-1)和非胰岛素依赖型(Type-2)两种类型，其中2型糖尿病占糖尿病发病率的90％左右。近年来，随着人们生活水平的提高和生活工作方式的改变，糖尿病及其并发症发生率不断上升，预计2030年全球糖尿病患者数量将达到3.66亿，亚洲是增长最快的地区之一。在中国，2012年糖尿病患者已达到9840万，预计到2030年，这一数字将达到1.3亿。因此，积极采取多种措施预防或控制糖尿病及其并发症刻不容缓。
糖尿病的治疗主要靠注射胰岛素和口服降糖药来控制高血糖症状。然而，长期注射胰岛素或口服降糖药，会产生胰岛素抵抗和一些毒副作用，因此，具有降糖活性的毒副作用小的天然产物越来越受关注。减少和延缓肠道对糖类物质的分解和吸收是降低糖尿病人体内高血糖症状的一种有效手段。α-葡萄糖苷酶是一种作用于1,4-糖苷键的葡萄糖苷酶，它可以将低聚糖水解成葡萄糖。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂能够抑制小肠粘膜的α-葡萄糖苷酶活性，减缓多糖和蔗糖转化为葡萄糖的速度，在不造成营养物质吸收障碍的前提下有效控制糖尿病人餐后血糖的升高。我国人口饮食中碳水化合物含量较高，α-葡萄糖苷酶抑制剂能发挥更好的降糖效果。目前临床上所用的α-葡萄糖苷酶抑制剂(阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇)对人体消化道均有一定的副作用如胀气、腹痛等，因此，开发天然高效、毒副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制剂尤为重要。
荔枝(LitchichinensisSonn.)，无患子科荔枝属植物，原产我国南方地区，现在在亚洲、美洲、非洲和大洋洲等20多个国家均有种植，但无论从栽培面积还是产量来说，中国均为世界第一。研究荔枝果肉中物质的α-葡萄糖苷酶抑制活性，对于提高荔枝附加值和促进荔枝产业发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从荔枝果肉中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法,通过以下步骤实现：
a.将荔枝果肉液氮处理后使用冷冻干燥机除去果肉水分，将冷冻干燥后的荔枝果肉用磨样机打磨成粉末状；
b.以浓度为70％的甲醇溶液超声提取30min，料液比为1:8，使用高速离心机8000r/min离心10min，取上清液，此步骤重复3次，合并上清液；
c.上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味的浓缩液为止；
d.浓缩液过固相萃取柱，用5倍柱床体积的水洗去糖，5倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液45℃条件下旋蒸至粉末；
e.将得到的粉末溶于尽量少的水中，使用凝胶树脂进行梯度洗脱，凝胶树脂为SephadexLH-20，凝胶树脂装柱体积为80ml(8×400mm)或300ml(16×400mm)，梯度洗脱液分别为水、10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、30％甲醇溶液、40％甲醇溶液、50％甲醇溶液、60％甲醇溶液、100％甲醇溶液，梯度洗脱流速为1ml/min，梯度洗脱体积为3倍柱床体积；
f.经HPLC检测后，将所含目标产物的洗脱部分45℃条件下旋蒸，得到干燥的荔枝粗提物粉末；所述目标产物为槲皮素3-O-芸香糖-(1→2)-O-鼠李糖苷(Q-R-R)；
g.粗提物粉末经Pre-HPLC进一步纯化，最终得到一种纯度较高的α-葡萄糖苷酶抑制剂；
h.通过紫外吸收光谱、液质、核磁共振(1H，13C，HMBC、HMQC、Tocsy、Noesy)确定该物质的化学结构。
所述步骤a的荔枝品种为‘妃子笑’。
所述步骤d中固相萃取柱型号为WatersOasisHLB20cc(1g)。
所述步骤d中上样及洗脱流速均为2ml/min。
所述步骤e中的凝胶树脂为SephadexLH-20。
所述步骤e中的凝胶树脂装柱体积为40ml(5×40mm)或300ml(16×400mm)。
所述步骤e中梯度洗脱液分别为水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、50％甲醇、60％甲醇、100％甲醇。
所述步骤e中梯度洗脱流速为1ml/min。
所述步骤e中梯度洗脱体积为3倍柱床体积。
所述步骤e中使用Pre-HPLC进一步纯化，最终得到一种纯度较高的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
所述步骤f中鉴定该物质为槲皮素3-O-芸香糖-(1→2)-O-鼠李糖苷(Q-R-R)。该物质为荔枝中首次报道，化合物结构式如下：
本发明的另一个目的是提供所述的槲皮素3-O-芸香糖-(1→2)-O-鼠李糖苷(Q-R-R)在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
本发明方法加工工艺简单，耗能较少，不涉及高温步骤及喷雾干燥仪等高能耗设备，提取过程的有机溶剂可回收利用，不产生有机污染。提取过程中使用的固相萃取柱及凝胶树脂均可反复利用，节省成本。所得的单体对α-葡萄糖苷酶抑制活性较高。本发明对于荔枝资源的合理利用，以及提高荔枝产品附加值具有重大意义。
附图说明
图1为高效液相色谱检测图谱，检测波长为280nm；其中图A为‘妃子笑’果肉粗提物高效液相检测图谱；图B为含有目标产物洗脱部分高效液相图谱；图C为经Pre-HPLC进一步分离纯化后得到的单体高效液相图谱。
图2为目标化合物的紫外吸收光谱。
图3为目标化合物的质谱图；其中图A为一级质谱图，图B为二级质谱图。
图4为目标化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
图5为实施例2目标化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
图6为实施例3目标化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一：
将冷冻干燥后的‘妃子笑’果肉粉末100g置于800ml70％甲醇溶液中超声提取30min，使用高速离心机8000r/min条件下离心10min。取上清液。此步骤重复3次，合并上清液。上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味，浓缩液过WatersOasisHLB20cc(1g)固相萃取小柱(2个)，每个小柱用100ml的水洗去糖，100ml的甲醇洗脱。甲醇洗脱液45℃条件下旋蒸，得棕色干燥粉末0.46g。将0.46g粉末溶于2ml水中，使用SephadexLH-20凝胶树脂进行梯度洗脱，柱床体积为80ml(8×400mm)。梯度洗脱液分别为水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、50％甲醇、60％甲醇、100％甲醇各240ml。HPLC检测后将含有目标产物的洗脱部分45℃条件下旋蒸，共得到粗提物37.5mg，经过Pre-HPLC进一步纯化，最终得到单体16mg(参见图1)。通过紫外吸收光谱(参见图2)、质谱(参见图3)、核磁共振(1H，13C，HMBC，参见表1；HMQC、Tocsy、Noesy)鉴定为槲皮素3-O-芸香糖-(1→2)-O-鼠李糖苷。在100μg/ml的浓度条件下，该物质对α-葡萄糖苷酶抑制活性高达94.63％(参见图4)，说明该物质是一种良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
表1
实施例二：
将冷冻干燥后的‘妃子笑’果肉粉末500g置于4000ml70％甲醇溶液中超声提取30min，使用高速离心机8000r/min条件下离心10min。取上清液。此步骤重复3次，合并上清液。上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味，浓缩液过WatersOasisHLB20cc(1g)固相萃取小柱(10个)，每个小柱用100ml的水洗去糖，100ml的甲醇洗脱。甲醇洗脱液45℃条件下旋蒸，得棕色干燥粉末2.29g。将1.5g粉末溶于5ml水中，使用SephadexLH-20凝胶树脂进行梯度洗脱，柱床体积为300ml(16×400mm)。梯度洗脱液分别为水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、50％甲醇、60％甲醇、100％甲醇各900ml。HPLC检测后将含有目标产物的洗脱部分45℃条件下旋蒸，共得到粗提物147.5mg，经过Pre-HPLC进一步纯化，最终得到单体67.6mg。在100μg/ml的浓度条件下，该物质对α-葡萄糖苷酶抑制活性高达93.94％(参见图5)，说明该物质是一种良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
实施例三：
将冷冻干燥后的‘妃子笑’果肉粉末500g置于4000ml70％甲醇溶液中超声提取30min，使用高速离心机8000r/min条件下离心10min。取上清液。此步骤重复3次，合并上清液。上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味，浓缩液过WatersOasisHLB20cc(1g)固相萃取小柱(10个)，每个小柱用100ml的水洗去糖，100ml的甲醇洗脱。甲醇洗脱液45℃条件下旋蒸，得棕色干燥粉末2.53g。将2.5g粉末溶于10ml水中，使用SephadexLH-20凝胶树脂进行梯度洗脱，柱床体积为300ml(16×400mm)。梯度洗脱液分别为水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、50％甲醇、60％甲醇、100％甲醇各900ml。HPLC检测后将含有目标产物的洗脱部分45℃条件下旋蒸，共得到粗提物155.3mg，经过Pre-HPLC进一步纯化，最终得到单体88mg。在100μg/ml的浓度条件下，该物质对α-葡萄糖苷酶抑制活性高达92.44％(参见图6)，说明该物质是一种良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

Claims (5)

1.一种从荔枝果肉中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
a.将荔枝果肉液氮处理后使用冷冻干燥机除去果肉水分，将冷冻干燥后的荔枝果肉用磨样机打磨成粉末状；
b.以浓度为70％的甲醇溶液超声提取30min，料液比为1:8，使用高速离心机8000r/min离心10min，取上清液，此步骤重复3次，合并上清液；
c.上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味的浓缩液为止；
d..浓缩液过固相萃取柱，用5倍柱床体积的水洗去糖，5倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液45℃条件下旋蒸至粉末；
e.将得到的粉末溶于尽量少的水中，使用凝胶树脂进行梯度洗脱，梯度洗脱液分别为水、10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、30％甲醇溶液、40％甲醇溶液、50％甲醇溶液、60％甲醇溶液、100％甲醇溶液，梯度洗脱流速为1ml/min，梯度洗脱体积为3倍柱床体积；
f.经HPLC检测后，将所含目标产物的洗脱部分45℃条件下旋蒸，得到干燥的荔枝粗提物粉末,经Pre-HPLC进一步纯化，最终得到α-葡萄糖苷酶抑制剂：槲皮素3-O-芸香糖-(1→2)-O-鼠李糖苷(Q-R-R)。
2.根据权利要求1所述的一种从荔枝果肉中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤a所述的荔枝的品种为‘妃子笑’。
3.根据权利要求1所述的一种从荔枝果肉中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤d中的固相萃取柱型号为WatersOasisHLB20cc，上样及洗脱流速均为2ml/min。
4.根据权利要求1所述的一种从荔枝果肉中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤e中的凝胶树脂为SephadexLH-20，凝胶树脂装柱体积为40ml或300ml。
5.根据权利要求1-4任一方法提取的槲皮素3-O-芸香糖-(1→2)-O-鼠李糖苷(Q-R-R)在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
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