CN109706208A - 一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，属于食品及肽或蛋白的制备技术领域。本发明制备牡丹籽仁粉后用超微气流粉碎分级机破壁，超声酶解后离心分层真空旋蒸干燥，得到牡丹籽油；滤渣超声碱提后，合并水层，真空浓缩后，喷雾干燥得牡丹蛋白肽粉。能够同时提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽，牡丹籽出油率达90%，牡丹蛋白肽回收率达86%。利用超声辅助水酶法制备牡丹籽油，方法安全、绿色环保、能耗低。蛋白肽制备中采用脉冲超声波处理，提高了酶解效率和产物活性。所制备的牡丹籽油不饱和脂肪酸含量相对较高，提取时间短，不存在溶剂残留，清除DPPH的值降低15％～38％。
Description
技术领域
本发明属于食品及肽或蛋白的制备技术领域，具体涉及一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法。
背景技术
牡丹籽粒具有抗炎、调节心血管系统、保肝、降血糖和调节免疫功能等作用，牡丹籽含油率(18-25％)高于大豆(17-18％)，并且牡丹籽油的脂肪酸组成优于大豆油。牡丹籽油于2011年3月由卫生部《卫生部关于批准元宝枫籽油和牡丹籽油作为新资源食品的公告》(2011年第9号)批准为新资源食品，含有100多种活性物质，富含不饱和脂肪酸(含80％左右)，主要为亚麻酸和亚油酸。牡丹籽油作为“α-亚麻酸”的主要来源，可促进婴幼儿以及青少年的脑神经和视神经发育，降低老年人“三高症”发病率。牡丹籽油中所含的α-亚麻酸为n-3系列(或ω-3系列)多烯不饱和脂肪酸是人体必需脂肪酸。中国营养学会2013版《中国居民膳食营养素参考摄入量》规定：α-亚麻酸每天摄入量1600-1800毫克。据调查，我国人群膳食普遍缺乏α-亚麻酸，平均每天摄入量仅为0.4克，不足世界卫生组织的推荐量每日1克的一半，不足中国要求的1/4。常见食用油中亚麻酸含量不高，因此，利用牡丹籽油与常见油源进行合理调配，开发具有高营养且能改善人体生理功能性产品，有着十分广阔的应用前景。现有技术的牡丹籽油的制备方法主要有溶剂萃取和超临界CO2萃取，溶剂提取法存在试剂残留的安全性问题，超临界CO2萃取存在成本过高问题。
肽的营养作用主要是蛋白质和L-氨基酸的作用，其中小分子肽在生命过程中所起的作用比氨基酸更加积极，从体内蛋白质合成分解代谢过程。作为蛋白质补充方式，对健康的人体而言，主要是从膳食的蛋白质中获得各种小分子肽和L-氨基酸，提供体内合成激素、酶、蛋白质。肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸要高。因此，肽营养已成为蛋白质营养研究的新热点，牡丹蛋白肽除了有其他肽的特点外，更具有增强人体免疫力、抗衰老、抗氧化、恢复疲劳等功能。牡丹蛋白肽是牡丹籽饼粕中的蛋白质经微生物发酵间接处理或蛋白酶直接作用后，再经过分离和精制等处理得到的低聚肽混合物。现有技术的牡丹蛋白肽普遍采用微生物发酵和/或蛋白酶进行制备，但是单独采用蛋白酶和微生物发酵较两者联合效果较差，并且微生物发酵耗时长，程序繁琐，而使用蛋白酶制备，如果要获得较高的收率需要多种类型的酶联合处理，成本较高。
近年来，牡丹籽食品深加工的应用越来越广泛，牡丹籽油和有效成分的提取方面研究较多，而利用超声波技术辅助水酶解法同时提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种从牡丹籽中同时提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，采用该方法制取的牡丹籽油色泽透明鲜亮，口感好，且保留了牡丹籽中的营养元素；同时综合利用工艺废液废渣制得的能使人体直接吸收，营养丰富的牡丹蛋白肽粉。有效的降低了能耗，提高了牡丹籽的综合利用率。
一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于，包括下述的步骤：
(1)制备牡丹籽仁粉：将牡丹籽破壳后收集牡丹籽仁，将牡丹籽仁粉碎，过40目筛，微波处理，得牡丹籽仁粉。
(2)破壁：将步骤(1)制得的牡丹籽仁粉用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间10～30min。
(3)超声酶解：将步骤(2)制得的破壁后的牡丹籽仁粉中加水，混合，再加入碱性蛋白酶，超声酶解0.5～2h；然后灭菌。
(4)制备牡丹籽油：将步骤(3)中酶解灭菌后的混合物过滤，所得滤渣备用；液相部分离心分离出水层、乳化层和油层，所得水层备用；乳化层盐析破乳后，离心两次合并清油，真空旋蒸干燥，得到牡丹籽油。
(5)超声碱提：将步骤(3)中制得的滤渣中加入水，调节pH值为7～10，超声0.5～2h；过滤，收集过滤清液。
(6)真空浓缩：将步骤(3)的水层和步骤(5)中的滤清液合并，真空旋转蒸发进行浓缩，得浓缩液。
(7)制备牡丹蛋白肽：将步骤(6)中制得的浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹蛋白肽粉。
优选的，步骤(1)中所述的微波处理在30～50℃的真空条件下用5～12kW功率的微波处理10～30min。
优选的，步骤(2)中所述的破壁时间为25min。
优选的，步骤(3)中所述的加水量为牡丹籽仁粉重量的5～10倍。
优选的，步骤(3)中所述的碱性蛋白酶添加量为牡丹籽仁粉重量的0.01％～0.03％。
优选的，步骤(3)中所述的超声条件为温度20～40℃，pH值7～10，超声频率20～40kHz。
优选的，步骤(3)中所述的蛋白酶为Alcalas 2.4L、Ns37071、胰酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任意一种或几种。
优选的，步骤(5)中所述的水的添加量为料液质量比为1：6～12。
优选的，步骤(5)中所述的超声条件为20～40℃，超声频率20～40kHz。
优选的，步骤(6)中所述的浓缩液中固液质量体积比为(3～4)：10，旋转蒸发的温度为40～60℃。
有益效果：
1、本发明的水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，能够同时提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽，本发明的牡丹籽油出油率达90％，牡丹蛋白肽回收率达86％，提高了资源利用率，方法简便易行。
2、本发明的水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，利用超声辅助水酶法制备牡丹籽油，具有安全、油品质高、绿色环保、能耗低等优点。所制备的牡丹籽油不饱和脂肪酸含量相对较高，且提取时间短，不存在溶剂残留等问题。牡丹籽油色泽透明鲜亮，口感好，最大限度的保留了牡丹籽中的营养元素。
3、本发明的水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，本发明在酶解开始后对酶解体系采用脉冲超声波处理，清除DPPH的值降低15％～38％，大大提高了酶解效率和产物的活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，包括以下步骤：
(1)制备牡丹籽仁粉：将牡丹籽破壳后收集牡丹籽仁，将牡丹籽仁粉碎，过40目筛，在50℃的真空条件下用8kW功率的微波处理30min，得牡丹籽仁粉。
(2)破壁：将步骤(1)制得的牡丹籽仁粉用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间25min。
(3)超声酶解：将步骤(2)制得的破壁后的牡丹籽仁粉中加水混合，加水量为牡丹籽仁粉重量的6倍，再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶添加量为牡丹籽仁粉重量的0.026％，所述的蛋白酶为Alcalas 2.4L。在温度30℃，pH值8，超声频率30kHz下超声酶解1h，然后灭菌。
(4)制备牡丹籽油：将步骤(3)中酶解灭菌后的混合物过滤，所得滤渣备用；液相部分离心分离出水层、乳化层和油层，所得水层备用；乳化层盐析破乳后，离心两次合并清油，真空旋蒸干燥，得到牡丹籽油。
(5)超声碱提：将步骤(3)中制得的滤渣中加入水，水的添加量为料液质量比为1：6，调节pH值为9，在40℃，超声频率30kHz下超声1h；过滤，收集过滤清液。
(6)真空浓缩：将步骤(3)的水层和步骤(5)中的滤清液合并，真空旋转蒸发(50℃下)进行浓缩，得固含量40(W/V)的浓缩液。
(7)制备牡丹蛋白肽：将步骤(6)中制得的浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹蛋白肽粉。
实施例2
一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，包括以下步骤：
(1)制备牡丹籽仁粉：将牡丹籽破壳后收集牡丹籽仁，将牡丹籽仁粉碎，过40目筛，在40℃的真空条件下用10kW功率的微波处理30min，得牡丹籽仁粉。
(2)破壁：将步骤(1)制得的牡丹籽仁粉用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间30min。
(3)超声酶解：将步骤(2)制得的破壁后的牡丹籽仁粉中加水混合，加水量为牡丹籽仁粉重量的7倍，再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶添加量为牡丹籽仁粉重量的0.03％，所述的蛋白酶为Ns37071。在温度35℃，pH值9，超声频率30kHz下超声酶解1.5h，然后灭菌。
(4)制备牡丹籽油：将步骤(3)中酶解灭菌后的混合物过滤，所得滤渣备用；液相部分离心分离出水层、乳化层和油层，所得水层备用；乳化层盐析破乳后，离心两次合并清油，真空旋蒸干燥，得到牡丹籽油。
(5)超声碱提：将步骤(3)中制得的滤渣中加入水，水的添加量为料液质量比为1：6，调节pH值为10，在40℃，超声频率20kHz下超声1h；过滤，收集过滤清液。
(6)真空浓缩：将步骤(3)的水层和步骤(5)中的滤清液合并，真空旋转蒸发(55℃下)进行浓缩，得固含量37(W/V)的浓缩液。
(7)制备牡丹蛋白肽：将步骤(6)中制得的浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹蛋白肽粉。
实施例3
一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，包括以下步骤：
(1)制备牡丹籽仁粉：将牡丹籽破壳后收集牡丹籽仁，将牡丹籽仁粉碎，过40目筛，在30℃的真空条件下用8kW功率的微波处理30min，得牡丹籽仁粉。
(2)破壁：将步骤(1)制得的牡丹籽仁粉用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间20min。
(3)超声酶解：将步骤(2)制得的破壁后的牡丹籽仁粉中加水混合，加水量为牡丹籽仁粉重量的8倍，再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶添加量为牡丹籽仁粉重量的0.03％，所述的蛋白酶为0.02％的Ns37071和0.01％胰酶。在温度20～40℃，pH值9，超声频率30kHz下超声酶解1.5h，然后灭菌。
(4)制备牡丹籽油：将步骤(3)中酶解灭菌后的混合物过滤，所得滤渣备用；液相部分离心分离出水层、乳化层和油层，所得水层备用；乳化层盐析破乳后，离心两次合并清油，真空旋蒸干燥，得到牡丹籽油。
(5)超声碱提：将步骤(3)中制得的滤渣中加入水，水的添加量为料液质量比为1：6，调节pH值为10，在40℃，超声频率20kHz下超声1.5h；过滤，收集过滤清液。
(6)真空浓缩：将步骤(3)的水层和步骤(5)中的滤清液合并，真空旋转蒸发(45℃下)进行浓缩，得固含量37(W/V)的浓缩液。
(7)制备牡丹蛋白肽：将步骤(6)中制得的浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹蛋白肽粉。
实施例4
一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，包括以下步骤：
(1)制备牡丹籽仁粉：将牡丹籽破壳后收集牡丹籽仁，将牡丹籽仁粉碎，过40目筛，在30℃的真空条件下用5kW功率的微波处理10min，得牡丹籽仁粉。
(2)破壁：将步骤(1)制得的牡丹籽仁粉用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间10min。
(3)超声酶解：将步骤(2)制得的破壁后的牡丹籽仁粉中加水混合，加水量为牡丹籽仁粉重量的5倍，再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶添加量为牡丹籽仁粉重量的0.03％，所述的蛋白酶为0.01％Alcalas 2.4L、0.01％复合蛋白酶、0.01％木瓜蛋白酶。在温度20℃，pH值7，超声频率20kHz下超声酶解0.5h，然后灭菌。
(4)制备牡丹籽油：将步骤(3)中酶解灭菌后的混合物过滤，所得滤渣备用；液相部分离心分离出水层、乳化层和油层，所得水层备用；乳化层盐析破乳后，离心两次合并清油，真空旋蒸干燥，得到牡丹籽油。
(5)超声碱提：将步骤(3)中制得的滤渣中加入水，水的添加量为料液质量比为1：9，调节pH值为7，在20℃，超声频率30kHz下超声0.5；过滤，收集过滤清液。
(6)真空浓缩：将步骤(3)的水层和步骤(5)中的滤清液合并，真空旋转蒸发(50℃下)进行浓缩，得固含量30(W/V)的浓缩液。
(7)制备牡丹蛋白肽：将步骤(6)中制得的浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹蛋白肽粉。
实施例5
一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，包括以下步骤：
(1)制备牡丹籽仁粉：将牡丹籽破壳后收集牡丹籽仁，将牡丹籽仁粉碎，过40目筛，在30℃的真空条件下用12kW功率的微波处理20min，得牡丹籽仁粉。
(2)破壁：将步骤(1)制得的牡丹籽仁粉用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间15min。
(3)超声酶解：将步骤(2)制得的破壁后的牡丹籽仁粉中加水混合，加水量为牡丹籽仁粉重量的10倍，再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶添加量为牡丹籽仁粉重量的0.01％，所述的蛋白酶为为Alcalas 2.4L、Ns37071、胰酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任意一种。在温度40℃，pH值10，超声频率40kHz下超声酶解2h，然后灭菌。
(4)制备牡丹籽油：将步骤(3)中酶解灭菌后的混合物过滤，所得滤渣备用；液相部分离心分离出水层、乳化层和油层，所得水层备用；乳化层盐析破乳后，离心两次合并清油，真空旋蒸干燥，得到牡丹籽油。
(5)超声碱提：将步骤(3)中制得的滤渣中加入水，水的添加量为料液质量比为1：12，调节pH值为8，在30℃，超声频率40kHz下超声2；过滤，收集过滤清液。
(6)真空浓缩：将步骤(3)的水层和步骤(5)中的滤清液合并，真空旋转蒸发(50℃下)进行浓缩，得固含量30(W/V)的浓缩液。
(7)制备牡丹蛋白肽：将步骤(6)中制得的浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹蛋白肽粉。
对比例1
溶剂浸提法制备牡丹籽油：将牡丹籽粉用正己烷浸提12h，反应结束后，50℃时旋转蒸发器减压蒸发有机溶剂。将旋转蒸发后油样放到烘箱，90℃烘干残留溶剂，直至前后两次样品重量不变为止(±0.2％)，用分析天平称量油脂质量。
对比例2
超临界CO2萃取牡丹籽油：取500g牡丹籽粉末置于1L萃取釜中超临界CO2萃取，超临界CO2萃取条件为在CO2流量20L·h-1，萃取压力35MPa，萃取温度45℃，萃取时间2h，收集油脂，用分析天平称量油脂质量。
对比例3
操作步骤与实施例1相同，但在制备牡丹籽油后开始提取牡丹蛋白肽时不施加超声波处理，测定牡丹蛋白肽的得率和对DPPH的清除率。
对比例4
操作步骤与实施例2相同，但在制备牡丹籽油后开始提取牡丹蛋白肽时不施加超声波处理，测定牡丹蛋白肽的得率和对DPPH的清除率。
结果对照：
1、本发明的牡丹籽油出油率和牡丹蛋白肽回收率。
分别对上述实施例1～5和对比例1～2制得的牡丹籽油出油率进行测算，对实施例1～5和对比例3～4制得的牡丹蛋白肽回收率进行测算，具体结果见下表1。
表1牡丹籽油出油率、牡丹蛋白肽回收率
| 样品 | 牡丹籽油出油率(％) | 牡丹蛋白肽回收率(％) |
| 实施例1 | 90.8 | 85.8 |
| 实施例2 | 91.2 | 86.6 |
| 实施例3 | 91.4 | 87.3 |
| 实施例4 | 90.6 | 86.2 |
| 实施例5 | 90.2 | 85.7 |
| 对比例1 | 79.6 | / |
| 对比例2 | 83.7 | / |
| 对比例3 | / | 70.2 |
| 对比例4 | / | 62.8 |
结果表明，本发明的方法能够同时提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽，牡丹籽油出油率达90％，牡丹蛋白肽回收率达86％，提高了资源利用率。
2、本发明的牡丹籽油指标测试
分别对上述实施例1～5和对比例1～2制得的牡丹籽油的理化指标进行测试，测试性能指标和测试方法包括：酸值测定参照GB/T 5530-2005；过氧化值定参照GB/T 5538-2005；生育酚含量测定参照GB/T 26635-2011；脂肪酸测定参照GB/T 22223-2008；角鲨烯、甾醇含量测定采用气相色谱法。具体测试结果见下表2。
表1牡丹籽油理化指标测试结果
检测结果表明：本发明的水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法制备的牡丹籽油，不饱和脂肪酸含量高于80％，生育酚、角鲨烯和甾醇总量均高于对比例，有助于降低反式脂肪酸含量，改善动脉硬化、血栓形成、调节血脂水平。亚麻酸含量高，口感好、风味浓郁。
3、本发明牡丹籽油对大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响
取雄性大鼠80只，随机分为8组，除空白对照组外，其余各组每天给予高脂饲料：2％胆固醇，15％猪油，0.5％胆酸钠，0.2％丙基硫氧嘧啶，80％基础饲料。除空白对照组自5由饮水外，对比例组给予等量生理盐水，其余各组灌胃给药，每日1次，按照表1分组，给药，连续给药15d。用药后禁食12h，测定血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，结果见表3。
表3本发明牡丹籽油对高脂血症大鼠血脂指标的影响结果
结果表明，对照组血清TC、TG、LDL-C值明显升高，HDL-C明显下降。与对照组比较，本发明的牡丹籽油能明显降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量，显著降低血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，显著升高血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，使总胆固醇与高密度脂蛋白比值显著下降。
4、本发明制备的牡丹蛋白肽的抗氧化能力的测定
采用DPPH法测定实施例1～3中的产品抗氧化能力，具体方法如下：精确称取不同浓度的样品2ml置于试管中，再加入2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液，摇匀，室温放置30分钟，测定A517,即为样品A样品(用2mL乙醇与2mL样品溶液混匀后调零，以排除试样本身颜色的影响)，向2mL乙醇中加入2mLDPPH溶液，测定A517，即为A对照，根据以下的公式计算样品的清除率：清除率η％＝(A对照—A样品)/A对照×100％
表4牡丹蛋白肽对DPPH自由基的清除率
注：以上的5％、10％、15％是指的各样品的质量浓度；
结果表明，本发明通过测实施例中的产品清除DPPH自由基能力，发现各样品对于DPPH自由基的清除能力都较强。高浓度组对于DPPH自由基清除率达到了88％左右。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (10)
1.一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于，包括下述的步骤：
（1）制备牡丹籽仁粉：将牡丹籽破壳后收集牡丹籽仁，将牡丹籽仁粉碎，过40目筛，微波处理，得牡丹籽仁粉；
（2）破壁：将步骤（1）制得的牡丹籽仁粉用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间10～30 min；
（3）超声酶解：将步骤（2）制得的破壁后的牡丹籽仁粉中加水，混合，再加入碱性蛋白酶，超声酶解0.5～2 h；然后灭菌；
（4）制备牡丹籽油：将步骤（3）中酶解灭菌后的混合物过滤，所得滤渣备用；液相部分离心分离出水层、乳化层和油层，所得水层备用；乳化层盐析破乳后，离心两次合并清油，真空旋蒸干燥，得到牡丹籽油；
（5）超声碱提：将步骤（3）中制得的滤渣中加入水，调节pH值为7～10，超声0.5～2 h；过滤，收集过滤清液；
（6）真空浓缩：将步骤（3）的水层和步骤（5）中的滤清液合并，真空旋转蒸发进行浓缩，得浓缩液；
（7）制备牡丹蛋白肽：将步骤（6）中制得的浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹蛋白肽粉。
2.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的微波处理在30～50℃的真空条件下用5～12 kW功率的微波处理10～30min。
3.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的破壁时间为25 min。
4.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的加水量为牡丹籽仁粉重量的5～10倍。
5.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的碱性蛋白酶添加量为牡丹籽仁粉重量的0.01%～0.03%。
6.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的超声条件为温度20～40℃，pH 值7～10，超声频率20～40 kHz。
7.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的蛋白酶为Alcalas 2.4L、Ns37071、胰酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任意一种或几种。
8.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的水的添加量为料液质量比为1：6～12。
9.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的超声条件为20～40℃，超声频率20～40 kHz。
10.如权利要求1所述的一种水酶解法提取牡丹籽油和牡丹蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（6）中所述的浓缩液中固液质量体积比为（3～4）：10。
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