CN109700834A - 一种蛹虫草固体发酵物及其抗菌用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛹虫草固体发酵物的制备方法及其抗菌用途，该方法包括如下步骤：先将蛹虫草菌株转接至平板PDA培养基中，在26‑30℃培养箱中培养5‑7天进行活化；然后进行摇瓶液体发酵培养6‑10天，温度25‑30℃，转速100‑180rpm；最后在以大米为主要基质的培养基中进行固体发酵30‑45天，温度25‑30℃。培养结束后收集发酵物烘干，其虫草素含量达到7.0‑10.4mg/g，水提物具有抑制马拉色菌活性。
Description
技术领域
本发明属于食药用真菌领域，具体涉及一种蛹虫草固体发酵物的制备及其抗菌用途。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris)是一种药食同源的大型真菌，有补肺益肾、止血化痰的功效，现代药理学研究表明其在增强免疫、抗疲劳、延缓衰老等方面功效显著，近年已广泛应用于食品、保健品和药品中。蛹虫草富含多糖、虫草素、腺苷、虫草酸等多种化学成分，其中虫草素是其主要活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、调节人体内分泌和增强人体免疫功能等多种功效。目前虫草素多从蛹虫草子实体或发酵产物中提取，但是子实体中虫草素含量较低(低于0.5％)，价格昂贵，生产成本较高。固体发酵法生产虫草素，具有设备简单，原料易得，成本低且易于分离等优点。目前蛹虫草子实体作为新食品原料已广泛应用于功能食品的研发，而其固体发酵产物在食品中的应用较少。
近些年，随着人们生活水平的不断提高，对日化用品的需求越来越大，对品质的要求也是越来越高，未来洗发护发产品将向天然性、营养性、温和性和功能性等方面发展，以天然活性成分为主护发养发产品开发受到人们的青睐，市场空间巨大。针对这一需求，本发明提供了一种蛹虫草固体发酵物的制备方法，证明了其提取物对引发头皮屑问题的真菌——马拉色菌具有抑制作用，明确了此类原料用于去屑类洗发产品开发的用途。
发明内容
本发明目的在于提供虫草素的用途。
本发明目的在于提供虫草素的在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草固体发酵物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草固体发酵物的提取物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草固体发酵物的提取液在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草大米发酵物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草大米发酵物的提取物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草大米发酵物的提取液在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草麦子发酵物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草麦子发酵物的提取物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
本发明目的在于提供一种蛹虫草麦子发酵物的提取液在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
一种蛹虫草固体发酵物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
先将蛹虫草菌株转接至斜面培养基中，在26-30℃培养箱中培养5-7天进行活化；然后在种子培养基中进行摇瓶液体发酵培养6-10天，温度25-30℃，转速100-180rpm；最后在以大米为主要基质的培养基中进行固体发酵30-45天，温度25-30℃，菌丝长满后给予每天6-10小时光照；所得蛹虫草固体发酵物在60℃烘干，其虫草素含量达到7.0-10.4mg/g。本发明提供一种蛹虫草固体发酵物，其虫草素含量达到7.0-10.4mg/g，其热水提取物具有较好的抑制马拉色菌活性，其MIC值为12.5mg/mL(以生药量计)。
一种蛹虫草固体发酵物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用，其特征在于在制备药物、化妆品的应用,赋形剂或载体为常用的赋形剂或载体。
本发明提供的一种蛹虫草固体发酵物的制备方法，及其水提物抑制马拉色菌活性，包括如下步骤：
先将蛹虫草菌株转接至斜面培养基中，在26-30℃培养箱中培养5-7天进行活化；然后在种子培养基中进行摇瓶液体发酵培养6-10天，温度25-30℃，转速100-180rpm；最后在以麦子为主要基质的固体发酵培养基中进行固体发酵30-45天，温度25-30℃，菌丝长满后给予每天6-10小时光照。所得蛹虫草固体发酵物在60℃烘干，高效液相色谱法测定其虫草素含量达到7.0-10.4mg/g，其热水提取物和虫草素均具有较好的抑制马拉色菌活性，抑菌MIC值分别为12.5mg/mL(提取物以生药量计)和0.125mg/mL。
本发明涉及一种蛹虫草固体发酵物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用，其特征在于在制备药物、保健品、化妆品的应用,赋形剂或载体为常用的赋形剂或载体。
本发明涉及蛹虫草固体发酵物的制剂，制剂类型包括：软膏剂、油脂性基质软膏剂、水性基质软膏剂、喷雾剂、洗剂、乳剂等药物制剂及洗发露、沐浴液等。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
菌种：蛹虫草菌株。
斜面培养基为：39g马铃薯葡萄糖琼脂溶于1L去离子水中灭菌后即得。
种子培养基的组分为：葡萄糖40g/L，蛋白胨15g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/LMgSO4·7H2O 0.5g/L，pH自然。
固体发酵培养基的组分为：大米50g，豆饼粉3g，酵母粉1.5g，KH2PO4 2g/L，MgSO40.5g/L，50g水，自然pH。
实施例1：蛹虫草大米发酵物
将蛹虫草菌株先转接至斜面培养基上，置于26℃培养箱中培养8天，然后在温度为26℃，转速为150rpm条件下在种子培养基中进行摇瓶发酵7天，最后以10％接种量接种入固体发酵培养基中，温度28℃，培养40天。
发酵结束后，将发酵物在60℃鼓风干燥箱中烘干，测定其虫草素含量为7.3mg/g，得到蛹虫草大米发酵物。
蛹虫草大米发酵物的虫草素的测定方法为：
称取蛹虫草大米发酵物0.5g，加10mL水充分混匀后超声波提取30min，取上清液8000r/min离心5min后过滤做为待测液。以AQ-C18柱为分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为10％的甲醇和90％的超纯水混合溶剂洗脱，以紫外检测器在254nm波长下检测，进样量10μL。以虫草素标准品的浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标做标准曲线(y)，根据样品中对应组分峰面积计算蛹虫草发酵产物中虫草素的含量。
实施例2：蛹虫草麦子发酵物
按照实施例1的方法进行灵芝发酵，只是固体发酵培养基中以麦子替代大米，培养至40天得发酵物烘干时，其虫草素含量为9.9mg/g(测定方法同实施例1)，得到蛹虫草麦子发酵物。
实施例3：蛹虫草发酵物及虫草素抑制马拉色菌活性
(1)马拉色菌的培养：固体培养基：葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏0.1g/L、单硬脂酸甘油酯2.5g/L、吐温-80 2mg/L、橄榄油20g/L、琼脂14g/L，加蒸馏水溶解后进行高压灭菌，分装于无菌培养皿中冷却成固体备用。马拉色菌液体培养基：麦芽糖20g/L、酵母浸膏2g/L、葡萄糖20g/L，加蒸馏水溶解后按照250mL三角瓶装液量为100mL进行分装，高压灭菌后冷却至室温备用。在固体培养基上接种马拉色菌，35℃培养箱中培养3d，连续传代培养2次，第2次传代培养2d后，用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落，制成菌悬液，并调整其至1号麦氏比浊管浓度。经血细胞计数板计数其菌含量为1～2×106CFU/mL，用液体培养基稀释菌液10倍使其菌含量为1～2×105CFU/mL备用。
(2)样品液的准备：酮康唑标准品先用DMSO配成1mg/mL，再用马拉色液体培养基(培养基未加橄榄油)稀释到1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL和0.125μg/mL备用。精密称取10mg虫草素标品，加10mL无菌蒸馏水加热溶解，0.22μm膜过滤除菌，再用马拉色菌液体培养基(未加橄榄油)等倍稀释到0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL备用。分别称取蛹虫草大米发酵物和蛹虫草麦子发酵物各1g，加蒸馏水10mL，采用超声波提取1h，离心取上清液高压灭菌后，以培养基稀释至100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL备用，提取物浓度以生药量来计。
(3)抑菌试验：采用96孔酶标板，每孔加100μL稀释好的浓度为1～2×105CFU/mL的马拉色菌液，稀释后的样品液、虫草素、酮康唑每孔加100μL，每个样品3个孔的平行，同时设不加菌的空白对照组和不加药液的正常对照组，为满足马拉色菌生长所需，各处理组每孔均添加5μL橄榄油。35℃培养48h，取真菌完全受抑制(无生长)的最低药物浓度即为该药的最小抑菌浓度(MIC)值。
抑菌结果显示，虫草素对马拉色菌有很好的抑制作用，其MIC值为0.125mg/mL
蛹虫草大米发酵物提取液和蛹虫草麦子发酵物提取液对马拉色菌也有较好的抑制作用，按照生药量来计，浓度都为12.5mg/mL即可完全抑制马拉色菌的生长，其MIC值低于多种中药材，说明其抗菌活性好。
虫草素是蛹虫草大米发酵物中存在的成分，可以通过分离纯化的方式从大米发酵物中获得虫草素，但是虫草素纯品成本很高，用蛹虫草大米发酵物提取液、蛹虫草麦子发酵物提取液直接作为添加成分，可以有效降低成本，具有实际应用价值。
实施例7颗粒剂的制备
蛹虫草大米发酵物20g；泊洛沙姆1g；95％乙醇10ml；羟丙基纤维素1g；25％大米淀粉浆10ml；硬酸镁1g，80目筛制粒，60℃干燥，80目筛整粒，分装成袋。
实施例8颗粒剂的制备
蛹虫草大米发酵物的提取物5g；泊洛沙姆5g；95％乙醇10ml；羟丙基纤维素5g；25％大米淀粉浆40ml；硬酸镁5g，80目筛制粒，60℃干燥，80目筛整粒，分装成袋。
实施例9水性基质软膏剂的制备
蛹虫草大米发酵物的提取物5g；CMC-Na95g加入乙醇95％200ml，研磨使湿润，再加甘油200ml，研匀，加入苯甲酸钠水溶液25ml(含1g苯甲酸钠)，边加边研匀，溶胀得水溶性基质；加入蛹虫草大米发酵物的提取物5g，混匀，灌装，灭菌。
实施例10洗液的制备
蛹虫草大米发酵物的提取物5g；泊洛沙姆5g；95％乙醇5ml；甘油25g；纯净水60g，分装。
实施例11洗液的制备
蛹虫草大米发酵物的提取物5g；泊洛沙姆5g；95％乙醇5ml；甘油25g；纯净水60g，加入苯甲酸钠水溶液2ml(含0.1g苯甲酸钠)，分装。
实施例13蛹虫草大米发酵物的虫草素的测定方法
称取蛹虫草大米发酵物0.5g，加10mL水充分混匀后超声波提取30min，取上清液8000r/min离心5min后过滤做为待测液。以AQ-C18柱为分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为10％的甲醇和90％的超纯水混合溶剂洗脱，以紫外检测器在254nm波长下检测，进样量10μL。以虫草素标准品的浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标做标准曲线(y)，根据样品中对应组分峰面积计算蛹虫草大米发酵物的虫草素的含量。
实施例14颗粒剂的虫草素的测定方法
颗粒剂：蛹虫草大米发酵物20g；泊洛沙姆1g；95％乙醇10ml；羟丙基纤维素1g；25％大米淀粉浆10ml；硬酸镁1g，80目筛制粒，60℃干燥，80目筛整粒，分装成袋。
颗粒剂的虫草素的测定方法为：
称取颗粒剂0.5g，加10mL水充分混匀后超声波提取30min，取上清液8000r/min离心5min后过滤做为待测液。以AQ-C18柱为分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为10％的甲醇和90％的超纯水混合溶剂洗脱，以紫外检测器在254nm波长下检测，进样量10μL。以虫草素标准品的浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标做标准曲线(y)，根据样品中对应组分峰面积计算颗粒剂虫草素的含量。
实施例15颗粒剂的虫草素的测定方法
颗粒剂：蛹虫草大米发酵物的提取物5g；泊洛沙姆5g；95％乙醇10ml；羟丙基纤维素5g；25％大米淀粉浆40ml；硬酸镁5g，80目筛制粒，60℃干燥，80目筛整粒，分装成袋。
颗粒剂的虫草素的测定方法为：
称取颗粒剂0.5g，加10mL水充分混匀后超声波提取30min，取上清液8000r/min离心5min后过滤做为待测液。以AQ-C18柱为分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为10％的甲醇和90％的超纯水混合溶剂洗脱，以紫外检测器在254nm波长下检测，进样量10μL。以虫草素标准品的浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标做标准曲线(y)，根据样品中对应组分峰面积计算颗粒剂虫草素的含量。
实施例16水性基质软膏剂的虫草素的测定方法
称取实施例9的水性基质软膏剂5g，加10mL水充分混匀后超声波提取30min，取上清液8000r/min离心5min后过滤做为待测液。以AQ-C18柱为分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为10％的甲醇和90％的超纯水混合溶剂洗脱，以紫外检测器在254nm波长下检测，进样量10μL。以虫草素标准品的浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标做标准曲线(y)，根据样品中对应组分峰面积计算水性基质软膏剂的虫草素的含量。
实施例17洗液的虫草素的测定方法
称取实施例10的洗液5ml，加10mL水充分混匀后超声波提取30min，取上清液8000r/min离心5min后过滤做为待测液。以AQ-C18柱为分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为10％的甲醇和90％的超纯水混合溶剂洗脱，以紫外检测器在254nm波长下检测，进样量10μL。以虫草素标准品的浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标做标准曲线(y)，根据样品中对应组分峰面积计算洗液虫草素的含量。
Claims (9)
1.虫草素的在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
2.一种蛹虫草固体发酵物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
3.一种蛹虫草固体发酵物的提取物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
4.一种蛹虫草固体发酵物的提取液在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用。
5.一种蛹虫草固体发酵物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
先将蛹虫草菌株转接至斜面培养基中，在26-30℃培养箱中培养5-7天进行活化；然后在种子培养基中进行摇瓶液体发酵培养6-10天，温度25-30℃，转速100-180rpm；最后在以大米为主要基质的培养基中进行固体发酵30-45天，温度25-30℃，菌丝长满后给予每天6-10小时光照；所得蛹虫草固体发酵物在60℃烘干，其虫草素含量达到7.0-10.4mg/g。
6.根据权利要求1的虫草素在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用，其特征在于在制备药物、化妆品的应用,赋形剂或载体为常用的赋形剂或载体。
7.根据权利要求2的蛹虫草固体发酵物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用，其特征在于在制备药物、化妆品的应用,赋形剂或载体为常用的赋形剂或载体。
8.根据权利要求2的蛹虫草固体发酵物的提取物在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用，其特征在于在制备药物、化妆品的应用,赋形剂或载体为常用的赋形剂或载体。
9.根据权利要求2的蛹虫草固体发酵物的提取液在制备抑制马拉色菌的组合物上的应用，其特征在于在制备药物、化妆品的应用,赋形剂或载体为常用的赋形剂或载体。
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