CN109675111A - 一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法 - Google Patents

一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种胶原蛋白‑氧化石墨烯‑脂肪脱细胞基质微载体的制备方法。其方法具体如下：取人脂肪组织反复冻融后乳化得到脂肪，并离心去除上层油和下层水，取中间层采用PBS缓冲液、胰蛋白酶‑EDTA消化液、异丙醇、混合酶溶液进行脱细胞处理，再用α‑淀粉酶水溶液和醋酸匀浆得到脂肪脱细胞基质溶液，并与胶原蛋白‑氧化石墨烯溶液混合作为分散相通入微流控芯片，将含有span‑80的正癸醇作为连续相通入微流控芯片，获得包裹有正癸醇的脱细胞基质‑胶原蛋白‑氧化石墨烯液滴，并通过交联液交联得到所述微载体。本发明能够生产成分均一的脱细胞基质微载体，得到的微载体更利于细胞生长，可用于脂肪干细胞培养。

Description

一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备 方法
技术领域
本发明属于组织工程生物支架微载体，具体涉及一种应用微流控芯片的胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的构建方法，可增加脂肪干细胞的黏附，是一种新型微载体。
背景技术
软组织缺损是临床面临的常见难题。现有的皮瓣移植、脂肪填充、透明质酸填充等方法存在有创伤、填充物易吸收、炎症反应等缺点。组织工程的方法将种子细胞和生物支架材料结合后进行填充，可以很大程度避免这些问题，但目前常用的生物支架材料如壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸，不具备促进干细胞黏附、增殖、分化的能力。
脂肪脱细胞基质是脂肪组织去掉细胞后剩余部分，主要成分包括胶原蛋白和VEGF、GAG等多种生长因子，可促进脂肪干细胞黏附、增殖、成脂分化。但是脂肪脱细胞基质为絮状结构，难以制备为载体。微流控芯片可以在微观尺度上操作液体，利用液体剪切力可制备大小成分均一的液滴。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，该方法能够生产大小、成分均一的脱细胞基质微载体，可用于于脂肪干细胞培养。
本发明提供的技术方案为：所述一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)脂肪脱细胞基质制备：
a.取人脂肪组织置于-80℃条件下冰冻20～40分钟，然后取出，在室温下静置至完全解冻，如此反复冻融3～5个循环；
b.将步骤a中反复冻融后的脂肪离心后去除最上层油和最下层水，取中间一层并加入生理盐水洗涤后离心后去除缓冲液，用胰蛋白酶-EDTA消化液在37℃下浸泡16～24h后离心去除消化液，再加入异丙醇在37℃下浸泡48～60h后离心去除异丙醇，最后用生理盐水重复洗涤3～5次，每次加入生理盐水混匀洗涤后离心去除缓冲液；
c.将步骤b中浸泡洗涤后的脂肪加入混合酶溶液在37℃下浸泡16～24h后离心去除混合酶溶液，并加入生理盐水重复洗涤3～5次，每次加入生理盐水混匀洗涤并离心去除缓冲液；其中所述混合酶溶是由以下比例的物质配制而成：55mmol/L Na2HPO4、17mmol/LKH2PO4、4.9mmol/L MgSO4·7H2O、15000U DNase、12.5mg Rnase、2000UI I型脂肪酶；
d.将步骤c中混合酶浸泡洗涤后的脂肪再次加入异丙醇在37℃下浸泡6～10h后离心去除异丙醇，最后采用生理盐水混匀洗涤后离心去除缓冲液得到脂肪脱细胞基质；
(2)脂肪脱细胞基质溶液制备：将步骤(1)中制备的脂肪脱细胞基质采用重量体积比为0.3％的α-淀粉酶水溶液浸泡70～75h后，离心去除α-淀粉酶水溶液，再将脱细胞基质放入浓度为0.2mol/L的醋酸中，并匀浆，使脱细胞基质质量体积为0.1％～3％，得到脂肪脱细胞基质溶液；
(3)制作毛细管微流控芯片：将内径100～400um和500～1000um的玻璃毛细管嵌套0.5～5cm，并将嵌套后的两根玻璃毛细管固定在载玻片上，其固定后内层毛细管两端及外层毛细管与内层毛细管嵌套一端均置于载玻片上，外层毛细管未嵌套一端伸出载玻片，并在内层毛细管未嵌套端以及外层毛细管与内层毛细管嵌套端分别倒扣加样枪枪头，加样枪头底部边缘与载玻片密封连接，且连接后其两个加样枪枪头倒扣区域分别形成一个与内层毛细管连通的第一密封腔和一个与外层毛细管连通的第二密封腔，制成微流控芯片；
(4)制备胶原蛋白-氧化石墨烯溶液：制备胶原蛋白-氧化石墨烯溶液：将胶原蛋白和氧化石墨烯加入0.1mol/L的醋酸溶液中配制含有浓度1％w/v～4％w/v胶原蛋白、0.01～0.4％w/v氧化石墨烯的混合溶液，用超声细胞破碎器以30％强度、超声时间1～3s、间歇时间1～3s进行超声混匀，得到均匀的胶原蛋白-氧化石墨烯溶液；
(5)将步骤(2)中的制备的脱细胞基质溶液与步骤(4)中配制的胶原蛋白-氧化石墨烯溶液按1:1～1:10的比例混合置于注射器中，用软管连接到微流控芯片上与内层毛细管相连的枪头开口端；将span-80与纯正癸醇混合后的溶液，其中span-80的质量体积比为5％，置于注射器中，用软管连接到微流控芯片上与外层毛细管相连的枪头开口端；并调节流速使得脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯混合溶液与正癸醇溶液流速比为1:1～1:20，获得包裹有正癸醇的脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯液滴；
(6)将NaCl2、EDC、NHS、Tween20加入0.05mol/L的Tris-HCl(pH 8.0)的溶液中，配制NaCl2的质量体积比为5％，EDC浓度为5mg/ml，NHS的浓度为2mg/ml，Tween20的体积分数为5％的交联溶液；将步骤(4)中获得的包裹有正癸醇的脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯液滴通入上述交联溶液中静置16～24h后，去除溶液收集微载体，并洗涤后得到胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中胰蛋白酶-EDTA消化液浸泡、异丙醇浸泡、混合酶溶液浸泡以及生理盐水洗涤时，每种浸泡液和洗涤液分别与脂肪的体积质量比为1:1。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中处理后得到脂肪脱细胞基质浸泡保存在温度为4℃、浓度为75％的酒精中。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中b步骤的脂肪是在室温、2000转/分钟下离心4～6min后吸去最上层油和最下层水吸去，取中间层加入生理盐水混匀洗涤30min后在1500～2500转/分钟的转速下离心，吸去缓冲液。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中b步骤中采用浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液浸泡，其浸泡后在500～2500转/分钟的条件下离心，吸去消化液；加入异丙醇浸泡后在1500～2500转/分钟的条件下离心，吸去异丙醇；每次加入生理盐水混匀洗涤30min后，在1500-2500转/分钟的条件下离心，吸去缓冲液。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中c步骤加入混合酶溶液浸泡完成后在1500～2500转/分钟的转速下离心吸去混合酶溶液；每次加入生理盐水混匀洗涤30min后，在1500～2500转/分钟的转速下离心吸去缓冲液。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中d步骤中异丙醇浸泡后在1500-2500转/分钟的条件下离心，吸去异丙醇，再加入生理盐水混匀洗涤30min后，在1500-2500转/分钟的条件下离心，吸去缓冲液。
本发明较优的技术方案：所述步骤(2)中脂肪脱细胞基质加入α-淀粉酶溶液浸泡后，在1500-2500转/分钟的条件下离心，吸去α-淀粉酶溶液；在醋酸中匀浆脱细胞基质，最后制备的可溶性脱细胞基质在4℃条件下保存。
本发明较优的技术方案：所述步骤(3)中嵌套后的两根玻璃毛细管沿与载玻片长轴平行方向采用环氧胶粘在载玻片上；所述加样枪枪头采用10ul的加样枪枪头，其底部边缘通过环氧胶与载玻片密封粘接。
本发明较优的技术方案：所述步骤(6)中通入混合液静置后采用套有80目滤网的枪头吸去混合溶液，收集微载体，并用浓度75％的酒精洗涤3～5次，获得胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体。
本发明中的胶原蛋白是组织工程制备微载体时常用的可降解材料，但其力学强度不足、降解快，且应用微流控芯片制备胶原蛋白微载体目前缺乏报道；氧化石墨烯具有良好的力学性能，但仍缺乏促进脂肪干细胞黏附、成脂分化的功能。
本发明制备的胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体，能够生产成分均一的脱细胞基质微载体，其大小可通过调节微流控芯片毛细管的管径、或液体的流速控制，将胶原蛋白-氧化石墨烯微载体与脂肪脱细胞基质结合，得到的微载体更利于细胞生长，可用于脂肪干细胞培养。
附图说明
图1是本发明中微流控芯片的结构示意图；
图2是实施例中制备的脂肪脱细胞基质的大体观察图；
图3是实施例中制备的可溶性脱细胞基质大体观察图；
图4是实施例中制备的胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体在共聚焦显微镜的荧光图；
图5是对照组胶原蛋白微载体种植细胞7天后进行FDA/PI活死细胞染色后在共聚焦显微镜的荧光图；
图6是胶原蛋白-氧化石墨烯-脱细胞基质微载体种植细胞7天后进行FDA/PI活死细胞染色后在光镜下的状态图；
图7是在胶原蛋白微载体上种脂肪干细胞第3天的光镜下显示的细胞生长状态图；
图8是在胶原蛋白-氧化石墨烯-脱细胞基质微载体上种脂肪干细胞第3天的光镜下显示的细胞生长状态图。
图中：1—载玻片，2—内层毛细管，3—外层毛细管，4—加样枪枪头，5—橡胶软管。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
以下实施例中的毛细管微流控芯片是按照以下方法制备而成：将内径100um和内径500um的玻璃毛细管嵌套3cm左右，然后通过环氧胶粘接载玻片1上，其固定后内层毛细管2两端及外层毛细管3与内层毛细管2嵌套一端均置于载玻片1上，外层毛细管3未嵌套一端伸出载玻片1，并在内层毛细管2未嵌套端以及外层毛细管3与内层毛细管2嵌套端分别倒扣10ul加样枪枪头4，加样抢枪头4底部边缘与载玻片1通过环氧胶密封粘接，且连接后其两个加样枪枪头4倒扣区域分别形成两个密封腔体，其中一个密封腔体与内层毛细管2开口端连通，另一个密封腔体与外层毛细管3的开口端密封连通，制成微流控芯片，其具体结构如图1所示。
实施例提供的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其具体步骤如下：
(1)制备脂肪脱细胞基质：
a.抽脂得到人脂肪组织，并置于-80℃条件下冰冻30分钟，然后取出，在室温下静置至完全解冻，如此反复冻融3个循环；
b.将步骤a中的脂肪在室温、2000转/分钟的条件下离心5min，然后将最上层油和最下层水吸去，取中间一层，加入生理盐水，混匀洗涤30min，并在2000转/分钟的条件下离心，吸去缓冲液，然后用胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25％)在37℃下浸泡16h，2000转/分钟离心，吸去消化液，再加入异丙醇在37℃下浸泡480h，2000转/分钟离心，吸去异丙醇，最后加入生理盐水，混匀洗涤30min，2000转/分钟离心，吸去缓冲液，重复洗涤3次；其中，所述胰蛋白酶-EDTA消化液、异丙醇和生理盐水的用量至少为1ml溶液/1g脂肪；
c.将步骤b中浸泡洗涤后的脂肪加入混合酶溶液在37℃下浸泡16h，2000转/分钟离心，吸去混合酶溶液，并加入生理盐水重复洗涤3次，每次加入生理盐水混匀洗涤30min，2000转/分钟离心，吸去缓冲液；其中所述混合酶溶是由以下比例的物质配制而成：55mmol/L Na2HPO4、17mmol/L KH2PO4、4.9mmol/L MgSO4·7H2O、15000U DNase、12.5mgRnase2000UI I型脂肪酶，所述混合酶溶液和每次洗涤的生理盐水的用量为至少为1ml溶液/1g脂肪；
d.将步骤c中混合酶浸泡洗涤后的脂肪再次加入异丙醇在37℃下浸泡8h，2000转/分钟离心，吸去异丙醇，最后采用生理盐水混匀洗涤30min，2000转/分钟离心，吸去缓冲液得到脂肪脱细胞基质，所述异丙醇和生理盐水的用量至少为1ml溶液/1g脂肪；得到的脂肪脱细胞基质其外观状态如图2所示，并将得到的脂肪脱细胞基质浸泡保存在4℃、75％酒精中；
(2)可溶性脱细胞基质制备：将步骤(1)中制备的脂肪脱细胞基质采用重量体积比为0.3％的α-淀粉酶水溶液浸泡5h后，2000转/分钟离心，吸去α-淀粉酶水溶液，再将脱细胞基质放入浓度为0.2mol/L的醋酸并匀浆，其中脱细胞基质质量体积为0.1％～3％；所得到的可溶性脱细胞基质外观状态如图3所示，并将其在温度为4℃的条件下进行保存；
(3)制备胶原蛋白-氧化石墨烯溶液：制备胶原蛋白-氧化石墨烯溶液：将胶原蛋白和氧化石墨烯加入0.1mol/L的醋酸溶液中配制含有浓度1％w/v～4％w/v胶原蛋白、0.01～0.4％w/v氧化石墨烯的混合溶液，用超声细胞破碎器以30％强度、超声时间1～3s、间歇时间1～3s进行超声混匀，得到均匀的胶原蛋白-氧化石墨烯溶液；
(4)将步骤(1)中的制备的可溶性脱细胞基质与浓度2％w/v的胶原蛋白-氧化石墨烯溶液等体积混合置于注射器中，用橡胶软管5连接到微流控芯片上与内层毛细管2相连的取样枪枪头开口端；将含有5％w/v span-80的正癸醇置于注射器中，用橡胶软管5连接到微流控芯片上与外层毛细管3相连的取样枪枪头开口端；调节流速使得脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯混合溶液与正癸醇溶液流速比为1:10，并获得包裹有正癸醇的脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯液滴；
(5)将NaCl2、EDC、NHS、Tween20加入0.05mol/L的Tris-HCl(pH 8.0)的溶液中，配制NaCl2的质量体积比为5％，EDC浓度为5mg/ml，NHS的浓度为2mg/ml，Tween20的体积分数为5％的交联溶液；将步骤(4)中获得的包裹有正癸醇的脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯液滴通入上述交联液中静置16～24h后，然后用套有80目滤网的枪头吸去混合溶液，收集微载体，再在75％酒精中洗涤3～5次，获得胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体。
将实施例中制备的胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体在光学显微镜下观察，其显示图如图4所示。
对比试验：直接将浓度2％w/v的胶原蛋白置于注射器中，用橡胶软管5连接到微流控芯片上与内层毛细管2相连的取样枪枪头开口端；将含有5％w/v span-80的正癸醇置于注射器中，用橡胶软管5连接到微流控芯片上与外层毛细管3相连的取样枪枪头开口端；调节流速使得胶原蛋白混合溶液与正癸醇溶液流速比为1:10，获得包裹有正癸醇的胶原蛋白液滴；并将包裹有正癸醇的胶原蛋白液滴通入含有NaCl2、EDC、NHS、Tween20与0.05mol/LTris-HCl(pH 8.0)混合后得到的溶液，其中NaCl2的质量体积比为5％，EDC的浓度为5mg/ml,NHS的浓度为2mg/ml,Tween20的体积分数为5％。静置16～24h后，然后用套有80目滤网的枪头吸去混合溶液，收集微载体，再在75％酒精中洗涤3～5次，获得胶原蛋白微载体。
分别将实施例中制备的胶原蛋白-氧化石墨烯-脱细胞基质微载体和对比例中制备胶原蛋白微载体后种脂肪间充质干细胞，然后将每20ul已种植细胞的微载体置于24孔板中1孔，加入1ml培养基，在37℃、5％CO2培养箱种培养，每天更换培养基。
在细胞培养的第3天，通过光镜观察其基质载体的细胞生长情况，分别如图7和图8所示，图7是在胶原蛋白微载体上种脂肪干细胞第3天的细胞生长情况，图中箭头显示为黏附的细胞，细胞数量较少且呈球形，证明胶原蛋白微载体虽可黏附细胞，但细胞生长状态欠佳。图8是在胶原蛋白-氧化石墨烯-脱细胞基质微载体上种脂肪干细胞第3天的生长情况，箭头显示为黏附的细胞，细胞数量较胶原蛋白微载体更多，且有许多细胞铺展为梭形，证明其更适于脂肪干细胞黏附、增殖。
在细胞培养的第7天进行FDA/PI活死细胞染色，其染色后的光镜照片分别如图5和图6所示，其中图5是对照组胶原蛋白微载体种细胞7天后进行FDA/PI活死细胞染色后在光镜下的状态图；图6是胶原蛋白-氧化石墨烯-脱细胞基质微载体种细胞7天后进行FDA/PI活死细胞染色后在光镜下的状态图。图中，绿色为活细胞，红色为死细胞，图5中微载体表面虽然有大量细胞黏附，但存活不多，图6中可见细胞存活较胶原蛋白微载体更多，且在微载体上铺展更好。从两个图的对比可以看出，加入脱细胞基质后细胞存活较胶原蛋白微载体更多，且在微载体上铺展更好。

Claims (10)

1.一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)脂肪脱细胞基质制备：
a.取人脂肪组织置于-80℃条件下冰冻20～40分钟，然后取出，在室温下静置至完全解冻，如此反复冻融3～5个循环；
b.将步骤a中反复冻融后的脂肪离心后去除最上层油和最下层水，取中间一层并加入生理盐水洗涤后离心后去除缓冲液，用胰蛋白酶-EDTA消化液在37℃下浸泡16～24h后离心去除消化液，再加入异丙醇在37℃下浸泡48～60h后离心去除异丙醇，最后用生理盐水重复洗涤3～5次，每次加入生理盐水混匀洗涤后离心去除缓冲液；
c.将步骤b中浸泡洗涤后的脂肪加入混合酶溶液在37℃下浸泡16～24h后离心去除混合酶溶液，并加入生理盐水重复洗涤3～5次，每次加入生理盐水混匀洗涤并离心去除缓冲液；其中所述混合酶溶是由以下比例的物质配制而成：55mmol/L Na2HPO4、17mmol/LKH2PO4、4.9mmol/L MgSO4·7H2O、15000U DNase、12.5mg Rnase、2000UII型脂肪酶；
d.将步骤c中混合酶浸泡洗涤后的脂肪再次加入异丙醇在37℃下浸泡6～10h后离心去除异丙醇，最后采用生理盐水混匀洗涤后离心去除缓冲液得到脂肪脱细胞基质；
(2)脂肪脱细胞基质溶液制备：将步骤(1)中制备的脂肪脱细胞基质采用重量体积比为0.3％的α-淀粉酶水溶液浸泡70～75h后，离心去除α-淀粉酶水溶液，再将脱细胞基质放入浓度为0.2mol/L的醋酸溶液中，并匀浆，使脱细胞基质质量体积为0.1％～3％，得到脂肪脱细胞基质溶液；
(3)制作毛细管微流控芯片：将内径100～400um和500～1000um的玻璃毛细管嵌套0.5～5cm，并将嵌套后的两根玻璃毛细管固定在载玻片上，其固定后内层毛细管两端及外层毛细管与内层毛细管嵌套一端均置于载玻片上，外层毛细管未嵌套一端伸出载玻片，并在内层毛细管未嵌套端以及外层毛细管与内层毛细管嵌套端分别倒扣加样枪枪头，加样枪头底部边缘与载玻片密封连接，且连接后其两个加样枪枪头倒扣区域分别形成一个与内层毛细管连通的第一密封腔和一个与外层毛细管连通的第二密封腔，制成微流控芯片；
(4)制备胶原蛋白-氧化石墨烯溶液：将胶原蛋白和氧化石墨烯加入0.1mol/L的醋酸溶液中配制含有浓度1％w/v～4％w/v胶原蛋白、0.01～0.4％w/v氧化石墨烯的混合溶液，用超声细胞破碎器以30％强度、超声时间1～3s、间歇时间1～3s进行超声混匀，得到均匀的胶原蛋白-氧化石墨烯溶液；
(5)将步骤(2)中的制备的脱细胞基质溶液与步骤(4)中配制的胶原蛋白-氧化石墨烯溶液按1:1～1:10的比例混合置于注射器中，用软管连接到微流控芯片上与内层毛细管相连的枪头开口端；将span-80与纯正癸醇混合后的溶液，其中span-80的质量体积比为5％，置于注射器中，用软管连接到微流控芯片上与外层毛细管相连的枪头开口端；并调节流速使得脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯混合溶液与正癸醇溶液流速比为1:1～1:20，获得包裹有正癸醇的脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯液滴；
(6)将NaCl2、EDC、NHS、Tween20加入0.05mol/L的Tris-HCl(pH 8.0)的溶液中，配制NaCl2的质量体积比为5％，EDC浓度为5mg/ml，NHS的浓度为2mg/ml，Tween20的体积分数为5％的交联液；将步骤(4)中获得的包裹有正癸醇的脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯液滴通入上述交联液中静置16～24h后，去除溶液收集微载体，并洗涤后得到胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体。
2.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中胰蛋白酶-EDTA消化液浸泡、异丙醇浸泡、混合酶溶液浸泡以及生理盐水洗涤时，每种浸泡液和洗涤液分别与脂肪的体积质量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中处理后得到脂肪脱细胞基质浸泡保存在温度为4℃、浓度为75％的酒精中。
4.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中b步骤的脂肪是在室温、2000转/分钟下离心4～6min后吸去最上层油和最下层水吸去，取中间层加入生理盐水混匀洗涤30min后在1500～2500转/分钟的转速下离心，吸去缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中b步骤中采用浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液浸泡，其浸泡后在500～2500转/分钟的条件下离心，吸去消化液；加入异丙醇浸泡后在1500～2500转/分钟的条件下离心，吸去异丙醇；每次加入生理盐水混匀洗涤30min后，在1500-2500转/分钟的条件下离心，吸去缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中c步骤加入混合酶溶液浸泡完成后在1500～2500转/分钟的转速下离心吸去混合酶溶液；每次加入生理盐水混匀洗涤30min后，在1500～2500转/分钟的转速下离心吸去缓冲液。
7.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中d步骤中异丙醇浸泡后在1500-2500转/分钟的条件下离心，吸去异丙醇，再加入生理盐水混匀洗涤30min后，在1500-2500转/分钟的条件下离心，吸去缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中脂肪脱细胞基质加入α-淀粉酶溶液浸泡后，在1500-2500转/分钟的条件下离心，吸去α-淀粉酶溶液；在醋酸中匀浆脱细胞基质，最后制备的可溶性脱细胞基质在4℃条件下保存。
9.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中嵌套后的两根玻璃毛细管沿与载玻片长轴平行方向采用环氧胶粘在载玻片上；所述加样枪枪头采用10ul的加样枪枪头，其底部边缘通过环氧胶与载玻片密封粘接。
10.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中通入混合液静置后采用套有80目滤网的枪头吸去混合溶液，收集微载体，并用浓度75％的酒精洗涤3～5次，获得胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体。
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