CN109661272B - 用于制造微流体布置的方法和装置及微流体布置 - Google Patents

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Abstract

公开了用于制造微流体布置的方法和装置。在一个布置中，提供第一液体的连续主体与基底直接接触。提供第二液体与第一液体直接接触并且覆盖第一液体。第一液体仅与第二液体和基底直接接触。驱使第二液体穿过第一液体并且在基底的选定区域中与基底接触以将第一液体的连续主体分成第一液体的多个子体，这些子体被第二液体彼此分隔。第一液体与第二液体不混溶。表面张力稳定地保持第一液体的多个子体被第二液体彼此分隔。

Description

用于制造微流体布置的方法和装置及微流体布置
本发明涉及通过将第一液体的主体分成液体的多个子体来产生微流体布置，所述液体多个子体被第二液体彼此分隔并且通过表面张力稳定地保持。子体可用来提供含有待研究材料的隔离样品，诸如活细胞或其他生物材料。
微孔板广泛地用于涉及生物材料的研究。孔的微型化允许在同一板中提供大量的孔。例如，已知具有超过1000个孔的板，每个孔的体积在数十纳升的范围内。然而，由于本质特点需要提供将多个孔彼此分离的实心壁，因此难以进一步微型化。这些壁的厚度减少了孔的可用表面区域。例如，对于具有1536个孔的典型板来说，这些壁预期将占据用于当前设计的可用表面的约60％。对于更高的密度，壁的不可用的表面区域的占比将进一步增加。
微孔板微型化的另一个障碍是难以将液体添加到由物理壁限定的小孔中。为了将液体可靠地添加到孔中(即以避免在液体下方捕获空气的方式)，需要将尖端精确地推进到孔的底部，而尖端或附着尖端的任何液体不接触孔壁。如果在液体到达孔的底部之前与壁接触，则很可能与壁形成弯液面并将空气捕获在液体下方。这可能意味着液体不能到达孔的底部。
微孔板还缺乏灵活性，这是由于每个板的孔的尺寸和孔的数量是固定的。此外，生物和化学相容性可能受限于需要使用能够以有效方式形成对应于孔的结构的材料。例如，对于高密度板，可能需要使用诸如聚二甲硅氧烷(PDMS)的材料，然而未经处理的PDMS材料具有较差的生物和化学相容性，因为它会排出毒素并与有机溶剂反应。
专利申请EP1527888A2公开了一种可替代的方法，其中使用喷墨印刷来形成紧密间隔的生长介质液滴的阵列，用于培养和分析生物材料。该方法比传统的微孔板提供更大的灵活性，但需要复杂的设备来执行印刷。此外，在液滴已经形成之后向液滴中添加其他材料耗费时间，并且由于它们不进行镶嵌而存在未被生成物座滴润湿的显著覆盖区域。
本发明的目的在于提供产生微流体布置的替代方法，该方法至少部分地解决了如上讨论的一个或多个挑战。
根据本发明的一方面，提供了制造微流体布置的方法，包括：提供与基底直接接触的第一液体的连续主体；提供与第一液体直接接触并覆盖第一液体的第二液体，使得第一液体仅与第二液体和基底直接接触；以及驱使第二液体穿过第一液体并在基底的选定区域与基底接触，以将第一液体的连续主体分成第一液体的多个子体，所述第一液体的多个子体被第二液体彼此分隔，其中：第一液体与第二液体不混溶；以及表面张力稳定地保持第一液体的多个子体被第二液体彼此分隔。
该方法允许液体子体在基底上灵活地形成，而不预先提供任何机械或化学结构以限定子体的几何形状。子体的形状和尺寸由第二液体被迫接触的基底的选定区域的形状和尺寸限定。如下所述，选定区域的选择相对不受限制。可能产生极小的子体，例如约为100微米或更小的子体，使用标准微孔板制造技术难以或不可能以合理的成本制造。与使用具有物理壁的微孔板相比，子体还能够更接近彼此地定位。本公开的实施例的液体壁通常具有70-120微米的厚度，这允许微流体布置的超过90％的表面区域可用于容纳待操作的液体。此外，没有任何实心壁干涉向任何子体添加更多液体。
与通过喷墨印刷或类似的方法沉积的液滴阵列相比，该方法避免了对复杂印刷设备的需要，并且能够实现更高的空间填充效率(由于多个子体的形状不必为圆形的)。待研究的材料(例如细胞)和测试物质(例如药物)可通过在将第一液体分成子体之前将它们添加到第一液体的连续主体中而同时添加到多个子体中。能够在第一液体的条带中施加浓度梯度，并且能够将条带分成子体以快速且容易地产生含有不同浓度组成的样品。发明人还发现，对于不具有圆形覆盖区域(例如，基本上为正方形或矩形的子体)的子体，能够更有效地实现在子体形成后将流体沉积到子体中(更快地发生合并)。不希望受理论束缚，认为这种效果可能受到非圆形子体的降低的对称性和/或子体能够更平坦的事实影响。使用本公开的方法能够容易地形成非圆形的子体。
在实施例中，通过在基底的选定区域上移动分隔构件的末端穿过第一液体来执行驱使第二液体穿过第一液体；以及分隔构件的末端的至少一部分具有与第二液体接触的表面能量密度低于与第一液体接触的表面能量密度。
分隔构件的表面特性允许第二液体快速且有效地拖动穿过第一液体，从而允许可靠且高速地执行划分过程。移动分隔构件穿过第一液体的简单方法可使用相对便宜的硬件来实现。
在实施例中，第一液体的连续主体主要由表面张力横向约束。
以此种方式形成连续主体是满足需要的，这是由于这意味着第一液体不必在容器的整个表面上展开。这意味着可不依赖于容器的形状控制主体的形状，这获得更优化的空间填充。例如，连续的主体可设置为正方形或矩形的，这使得即使当容器本身并非正方形或矩形时，可在第一液体的损耗最小化的情况下形成正方形或矩形的多个子体的阵列。此外，连续主体和容器的侧壁之间的间隙可减少多个壁和用来形成连续主体或用来将连续主体划分为多个子体的任何元件之间的干涉的风险。多个离散的连续主体(例如，正方形的或矩形的)能够以此种方式形成。发明人进一步还发现，在层的厚度不被如上的第二液体分裂的情况下，当第一液体主要由表面张力而不是由容器的侧壁横向约束时，第一液体的深度可更大。
在实施例中，驱使第二液体穿过第一液体按顺序包括如下步骤：将第一液体的连续主体对称地分成两个相等体积的子体；以及将由之前的划分步骤形成的每个子体对称地重复分成另外两个相等体积的子体。
该方法使得精确且可靠地形成多个相等体积的子体。
在实施例中，在每个子体和基底之间的接触区域包括具有子体覆盖区域轮廓的子体覆盖区域；并且子体覆盖区域轮廓的至少一个子集相对彼此镶嵌成格纹(tessellate)。
与基于液滴的喷墨印刷的现有技术的方法相反，本公开的实施例使得以高效的方式生产彼此镶嵌成格纹的多个子体，从而达到高空间填充。
在实施例中，第二液体比第一液体密度大。
使用密度大于第一液体的第二液体，该方法出人意料地有效，尽管浮力可能预期为使第一液体升起远离与基底接触。允许使用密度更大的第二液体有益地使得能够用于第二液体的组成的范围变宽。此外，在第一液体不侧向展开覆盖基底的情况下，能够在每个子体中稳定的保持的第一液体的最大化的深度增加。
在实施例中，待研究的材料在第一液体的连续主体中提供，并且划分成子体产生多个隔离的样品，每个所述多个隔离的样品含有一部分待研究的材料。在实施例中，待研究的材料包括粘附性活细胞并且在将第一液体的连续主体分成子体之前允许至少一部分粘附性细胞粘附到基底上。在至少一部分粘附性活细胞已经粘附到基底上之后，将测试物质(例如药物)添加到第一液体的连续主体。在将测试物质已经添加到第一液体的连续主体之后，执行(连续主体的)划分成子体。
提供了方法论，该方法论使得粘附性活细胞在被允许粘附至基底并且随后划分成多个隔离的样品之后被全部处理。使用现有技术的方法这是不可能的，并且这节省相当多的时间和降低系统复杂性，尤其是在需要生成大量的隔离样品和最小化对细胞的破坏的情况。该方法论还确保在每个样品中的细胞暴露至非常类似的条件，当测试物质(例如药物)被人工添加至独立的孔或液滴以及由于喷墨印刷或液滴顺序的方法的不同样品的物理环境时这是很难确保的，人工添加可在处理之间造成显著的延迟。细胞可在无压力的情况下放置在表面上，该压力是通过将细胞穿过喷射类型的印刷系统的印刷喷嘴施加的。相比在细胞附着之前细胞被分为微小体积(例如，通过液滴印刷)的替代方法，在细胞被分割之前使得细胞粘附提供用于药物筛选的更经典的微孔板起始条件的更佳表现。发明人进一步还发现，相比于当在细胞粘附之前细胞被添加至或存在于相同体力的液滴时，根据本公开的实施例形成的多个子体中细胞存活率更高。
根据替代的方面，提供了用于制造微流体布置的装置，该装置包括：注射系统，该注射系统配置成通过穿过注射构件的末端喷射第一液体的同时在基底上移动注射构件以限定第一液体的连续主体的形状，来提供与基底直接接触的第一液体的连续主体；分隔系统，该分隔系统包括具有末端的分隔构件，该分隔系统配置成用于通过在基底的选定区域上移动分隔构件的末端穿过第一液体驱使第二液体(第二液体与第一液体不混溶，第二液体与第一液体直接接触并且覆盖第一液体从而第一液体仅与第二液体和基底直接接触)穿过第一液体并在基底的选定区域中与基底接触，从而将第一液体的连续主体分成第一液体的多个子体，这些子体被第二液体彼此分隔；以及控制器，该控制器配置成在第一液体的连续主体形成期间控制注射构件在基底上的移动以及配置成在将第一液体的连续主体分成第一液体的多个子体期间控制分隔构件在基底上的移动。
因此，提供装置，该装置能够执行根据本公开的方法。
在实施例中，注射构件和分隔构件提供为分离的两个构件，提供用于这两个构件的外表面的最优属性。在实施例中，分隔构件的末端的至少一部分具有与第二液体接触的表面能量密度低于与第一液体接触的表面能量密度。优选地，注射构件的末端的至少一部分具有与第一液体接触的表面能量密度低于与第二液体接触的表面能量密度。分隔构件的表面属性使得第二液体有效地跟随分隔构件的移动，从而有效地替换第一液体。注射构件的表面属性使得：即使在第二液体已经存在时形成第一液体的连续主体(例如，通过插入末端穿过第二液体以形成第一液体的连续主体)，使得第一液体的连续主体有效地形成。注射构件的表面属性还使得注射构件在第一液体已经形成后被用来改变基底上的第一液体的形状(例如，通过将末端跨基底拖动将第一液体展开到基底上的新区域内)。
通过示例的方式参考附图将描述本发明的实施例，在附图中对应的参考标记示出对应的部分，并且附图中：
图1为第二液体与第一液体直接接触并且覆盖第一液体的情况下基底上第一液体的连续主体的侧视示意图；
图2为图1中在使用分隔构件划分第一液体的连续主体期间的布置侧视示意图；
图3为图2中的布置的俯视示意图；
图4为示出进一步划分子体的后续步骤的侧视示意图；
图5为示出使用图3和图4中描绘的方法形成子体的测试示意图；
图6描绘了产生相等体积的子体的划分方案；
图7描绘了用于可控地提供不同体积的子体的划分方案；
图8描绘了第一液体的连续主体的划分，同时连续主体倒置；
图9描绘了在连续主体延伸至容器的侧壁的情况下第一液体的连续主体的划分；
图10描绘了划分方案，其中在第一步骤中将第一液体的连续主体分成平行的细长条带，其中随后将每个条带分成多个子体；
图11描绘了划分方案，其中将第一液体的连续主体划分以形成至少一个子体，该子体包括连接到至少一个储液池的流道；
图12和图13描绘了使用分隔构件以形成第一液体的连续主体，并且在分隔步骤，使用分隔构件以将第一液体的连续主体分成子体；
图14和图15描绘了使用注射构件以形成第一液体的连续主体以及使用与注射构件分离的分隔构件以将第一液体的连续主体分成子体；
图16描绘了用于通过产生第一液体的多个连续主体并随后划分每个连续主体以产生多个子体来产生第一液体的子体组的方案，其中多个子体组相对于彼此的组成不同；
图17为描述了制造用于检测生物材料的微流体布置的方法的框架的流程图；
图18为描述了制造用于检测包括粘附性活细胞和测试物质的测试样品的微流体布置的方法的框架的流程图；
图19为描述了制造用于细胞群组生长的微流体布置的方法的框架的流程图；
图20描绘了用于制造流体布置的装置。
提供附图仅用于说明目的，并未按比例描绘，以允许清楚地呈现不同要素。特别地，提供基底的容器的宽度相对于第一和第二液体的深度在实践中将远大于附图中描绘的。
提供了方便且灵活地制造微流体布置的方法。
如图1中示意性所示，提供了第一液体1的连续主体。第一液体1与基底4直接接触。在实施例中，第一液体1包括水性溶液，但其他组成也是可能的。提供了与第一液体1直接接触的第二液体2。第二液体2与第一液体1不混溶。在实施例中，在第二液体2与第一液体1接触之前，第一液体1的连续主体在基底4上形成。在其他实施例中，在提供第二液体2之后(例如，通过穿过第二液体2注入第一液体1)，形成第一液体1的连续主体。在微流体布置用于测试生物材料样品的实施例中，第一液体1的连续主体通常在提供第二液体2之前形成。第二液体2覆盖第一液体1。因此，第一液体1被完全包围并且仅与第二液体2和基底4的组合直接接触。此时在该方法中，第一液体1不与除第二液体2和基底4之外的任何物体接触。通常，基底4是无刻纹的(既无机械的也无化学的)，至少在与第一液体1的连续主体接触(通常在连续主体下面)的区域中是无刻纹的。在实施例中，第一液体1的连续主体仅与基底4的基本上平坦的部分和第二液体2直接接触。
如图2至图5所示，在随后的步骤中，驱使第二液体2穿过第一液体1并在基底4的选定区域5中与基底4接触。因此，第二液体2取替第一液体1在选定区域5中接触基底4，而不是第一液体1在选定区域5中接触基底4。使第二液体2与在基底4的选定区域5中的基底4接触的效果是将第一液体1的连续主体分成多个子体，这些子体通过第二液体2彼此分隔。表面张力稳定地保持通过第二液体2彼此分隔的第一液体1的多个子体。
该方法允许第一液体4的子体在基底上灵活地形成，而不预先产生任何机械或化学结构以限定子体的几何形状。
第一液体1、第二液体2和基底4的具体组成没有特别限定。然而，期望第一液体1和第二液体2能够充分润湿基底4以使该方法有效地操作。在实施例中，选择第一液体1、第二液体2和基底4，使得第一液体1的液滴在空气中的基底4上的平衡接触角和第二液体2的液滴在空气中的基底4上的平衡接触角都将小于90度。在实施例中，第一液体1包括水性溶液。在该情况下，基底4可描述为亲水性的。在实施例中，第二液体2包括碳氟化合物，诸如FC40(以下将进一步描述)。在该情况下，基底4可描述为亲氟性的。在第一液体1为水性溶液且第二液体2为碳氟化合物的情况下，基底4可因此被描述为既是亲水性的也是亲氟性的。
在实施例中，通过在基底4的选定区域5上移动分隔构件6的末端穿过第一液体1来执行驱使第二液体2穿过第一液体1。末端取替第一液体1并允许第二液体2移动到先前由第一液体1占据的空间内。由此驱使第二液体2穿过第一液体1。在实施例中，通过将分隔构件6的末端的至少一部分配置成具有与第二液体2接触的表面能量密度低于与第一液体1接触的表面能量密度来促进该过程。以此种方式，在能量上更有利于第二液体流入在移动的末端后面的区域，从而有效地取替第一液体。优选地，基底4也被配置成使得能够有利地使第二液体2润湿基底4，从而在基底4的选定区域5与基底4保持接触，并将第一液体1稳定地保持在分隔的子体中。
图2至图5示出了这种类型的实施例。图2和图3描绘了在水平方向上分隔构件6的末端穿过第一液体1的移动，平行于与第一液体1接触(通常在第一液体1下方)的基底4的平面。在图2中，该移动进入页面。在图3中，该移动向下。在实施例中，在末端穿过第一液体1移动时，末端保持与基底4接触。末端可因此沿基底4的表面被拖动或拔出，类似于在一页纸上的铅笔。发明人已经发现，该方法实现第一液体1的不同子体之间的清洁划分。在其他实施例中，在末端在划分过程期间穿过第一液体的至少一部分的移动期间，能够保持末端和基底4之间的小间隔。在这样的实施例中，除了第一液体之外的液球(例如第二液体2)能够保持在末端处，以确保第一液体1被可靠地取替而远离基底4的选定区域5。当完成时，图2和图3的过程将导致图1的第一液体1的连续主体分成两个子体。使用多个分隔构件并行重复和/或执行该过程，以产生所需数量和尺寸的各个子体7(在图5中示意性地示出)。图4示意性示出了在图2和图3的步骤中产生的其中一个子体被分成另外两个子体。图5描绘了对于在图2和图3的步骤中产生的另一子体重复图4的步骤的结果。通过在正交方向上重复该过程，显然能够提供16个正方形子体7。在实践中，以此种方式能够提供数百或数千个子体7。发明人已经证明，例如，该方法能够常规地用于获得间距(pitch)小于100微米的正方形子体阵列。这比使用标准微孔板制造技术可能获得的要小得多。
在实施例中，选择一系列划分过程以控制形成的子体7的相对体积。在实施例中，如图2至图6所示，驱使第二液体2穿过第一液体1按顺序包括以下步骤：将第一液体1的连续主体对称地分成两个相等体积的子体；以及将由之前的划分步骤形成的每个子体对称地重复分成另外两个相等体积的子体。对称划分可包括沿被划分的主体或子体的镜像对称线的划分。图6描绘了示例性顺序。罗马数字描绘了分隔构件6的末端通过第一液体1在基底4的选定区域5上的一系列直线轨迹的顺序(在这种情况下为直线)。轨迹(i)至(iv)首先隔离第一液体1的正方形的初始连续主体。随后的轨迹(v)至(x)随后逐步地将连续主体和由此形成的子体对称地划分成相等体积，直至提供16个子体的阵列。每个阶段的对称划分确保每个子体具有相同体积(因此，A1＝B1＝…C4＝D4)。可产生任何数量的阵列。
图7描绘了用于可控地提供逐步增加体积的子体的替代划分方案。在这种情况中，再次提供轨迹(i)至(iv)以隔离第一液体1的正方形的初始连续主体。随后的轨迹(v)至(x)随后从左下角到右上角逐渐扫描，在每种情况下不对称地切割(除了最后的两次切割)连续主体或由此形成的子体。该过程的结果为第一液体逐渐地被向上和向右推动导致子体的相对体积向上和向右逐渐增加(即，深度逐渐增加)。这是由于第一液体1沿切割线形成弯曲边缘(非均匀深度)而使第一液体1远离切割线的净移动(net movement)而发生的。因此，对于每次切割将存在液体净移动到由切割形成的两个子体中的较大者中。
在实施例中，每个子体7和基底4之间的接触区域包括具有子体覆盖区域轮廓的子体覆盖区域。子体覆盖区域轮廓的至少一个子集每个至少包括一个直线部分。例如，这可通过使用直线切割形成子体来实现，诸如参考图2至图7如上所述。因此，以此种方式形成的子体7的阵列从根本上不同于涉及将液滴沉积到基底的表面上的替代技术(其中液滴将具有弯曲的轮廓)。因此可以实现更高水平的空间填充。在实施例中，子体覆盖区域轮廓的至少一个子集相对彼此镶嵌成格纹。例如，子体覆盖区域可包括正方形、矩形或平行四边形。通过执行诸如参照图2至图7以上所讨论的直线切割，能够有效地形成所有的这些四边形状。
在实施例中，第二液体2比第一液体1的密度大。发明人已经发现，尽管由第一液体1上方的密度更大的第二液体2在第一液体1上施加浮力，但由于第一液体1和基底4之间的表面张力效应，第一液体1出乎意料地稳定地保持与基底4接触。允许使用密度更大的第二液体2是有利的，这是由于其使第二液体2可能的组成的范围变宽了。例如，在第一液体1为水性溶液的情况下，可使用诸如FC40的碳氟化合物，该化合物提供足够高的渗透性以允许子体7中的细胞与周围的大气之间通过第二液体2的层发生至关重要的气体交换。FC40为密度为1.8555g/ml的透明全氟化液体，其广泛用于基于液滴的微流体。使用密度大于第一液体1的第二液体2的益处还在于其增加第一液体1的最大深度，该第一液体1能够稳定地保持在每个子体7中，而第一液体1不会在基底4上横向展开。这是由于第一液体1的重量倾向于驱使子体7向下并由此向外，并且该效应被浮力抵消。
在如上讨论的实施例中，微流体布置形成在基底4的上表面上。在其他实施例中，如图8所示，微流体布置可形成在表面4的下表面上。因此，可以在相对于图2的布置倒置的基底4的情况下执行第一液体1的连续主体的划分。在该情况下，表面张力可保持第一液体1与基底4接触。然后将基底和第一液体1浸入含有第二液体2的浴42中，同时使用分隔构件6将第一液体1的连续主体分成子体。可以从图8的布置开始执行参考图2至图5如上描述的后续步骤。例如，当微流体布置用于形成3D细胞培养球时，该方法可能是方便的。
在实施例中，第一液体1的连续主体主要通过表面张力横向约束。例如，第一液体1的连续主体可仅设置在基底4上的选定区域中，而不是一直延伸至侧壁(例如，基底4为包括侧壁的容器的底部表面，如图1所示)。因此，连续主体不会被侧壁横向约束。在第二液体1比第一液体1密度大时，该设置是特别理想的，这是由于其提供了更大的抵抗力，以防止由于来自第二液体2的对第一液体1向下的力而破坏第一液体1的连续主体的厚度均匀性。因此，发明人已经发现，当第一液体1主要通过表面张力横向约束时，第一液体1的深度可更大，相比事实并非如此的情况。提供增加第一液体1的深度是期望的，由于对于基底上的给定空间密度的子体，其允许更大的子体体积。例如，当子体用于培养细胞时，可以为细胞提供更大量的所需材料，使得细胞在需要采取进一步行动之前能够存活更长时间和/或在更均匀的条件下存活。
在其他实施例中，如图9示意性所示，可以允许第一液体的连续主体延伸至提供基底4的容器的侧壁。通过提供填充容器底部的第一液体1的相对深的层并随后移除(例如，通过移液)第一液体1以留下第一液体1的薄膜，可以此种方式方便地形成第一液体1的薄膜。除了第一液体1的连续主体延伸至侧壁，图9的布置对应于图2的布置。可从图9的布置开始执行参考图2至图5如上描述的后续步骤。
在实施例中，在将第一液体1的连续主体分成子体的初始步骤中，将第一液体1的连续主体分成多个细长条带40。在实施例中，这些细长条带40彼此平行。这样的设置的示例在图10中描绘。例如，该布置可通过沿一系列平行的水平轨迹移动分隔构件6以限定与第二液体2接触的选定区域5来形成。在随后的步骤中，将物质添加到一个或多个细长条带40的一个或多个局部区域(例如，侧向端部)。该物质沿每个细长条带40移动(例如，通过扩散和/或平流)，从而沿细长条带40产生浓度梯度。在随后的步骤中，将细长条带分成多个子体，从而快速且容易地在其中产生具有不同浓度的所选物质的子体组。在图10的特定示例中，通过沿图10中实线箭头标记的轨迹移动分隔构件6执行将细长条带40分成多个子体。
在实施例中，通过将第一液体1的连续主体分成多个子体能够形成更复杂的形状。在一个示例中，如图11所示，将第一液体1的连续主体划分，使得形成至少一个子体，所述子体至少包括连接到至少一个储液池32、34的流道36。流道36和储液池32、34可配置成使得在使用中能够驱动液体通过流道36到储液池32、34或能够驱动液体从储液池32、34通过通过流道36。当垂直于基底4观察时，流道36通常具有细长形式。储液池32、34通常为圆形的或至少具有大于流道36的宽度的横向尺寸。在所示的特定示例中，提供T形流道36，其将两个源储液池(source reservoir)32和34连接至槽储液池(sink reservoir)34。在使用中驱动流动，例如通过拉普拉斯压力、静水压力和/或将材料泵送到储液池32中，从源储液池32驱动流动至槽储液池34中。
在本公开的实施例中，通过从末端喷射出第一流体1的同时在基底4上移动末端以限定第一液体的连续主体的形状将第一流体沉积在基底4上，来形成第一流体1的连续主体。例如该方法可用于形成第一液体1的连续主体时，第一液体1主要通过表面张力(而不是壁)横向约束。图12至图15描绘了两种可能的实施方式。
如图12和图13所示，在实施例中，通过穿过分隔构件6的末端喷射出第一液体1的同时在基底上移动分隔构件6以限定第一液体1的连续主体的形状，来提供第一流体1的连续主体。因此，稍后用于将连续主体分成子体的同一构件(分隔构件6)也用于在第一位置形成连续主体。在图12中，描绘了为此目的配置的分隔构件6。分隔构件6包括内腔。第一液体1能够从储液池(未示出)通过分隔构件6的内腔泵送并离开分隔构件6的末端到基底4上。末端在基底4上移动，以限定第一液体1最终定位在基底4上的位置。图12示意性地描绘了在页面的平面上从左到右的这样的移动。表面张力限制第一液体1在基底4上横向展开。因此，第一液体1的连续主体能够形成为多种多样的形状和尺寸。图13描绘了随后使用分隔构件6划分使用图12中描绘的过程形成的连续主体。在所示的特定示例中，通过将分隔构件穿过第一液体1移动到页面的平面中执行该划分(如图2所示)。在该双重用途的情况下，当分隔构件6正在用于将第一液体1的连续主体分成第一液体1的子体时，期望避免在分隔构件6的末端附近存在任何第一液体1。如果末端附近存在任何的第一液体1，则划分过程可能受到影响，从而降低了可靠性。在实施例中，如图13所示，在使用分隔构件6将连续主体分成子体之前，通过将一部分第二液体2吸入分隔构件6的末端来减少或避免这种风险。第二液体2向上取替从之前的处理步骤可能保留在分隔构件6的内腔中的任何第一液体1。在使用分隔构件6的末端驱使第二液体2穿过第一液体1期间，第二液体2可保持在分隔构件6的末端中。
如图14至图15所示，在替代实施例中，通过穿过注射构件18(其与分隔构件6分离)的末端喷射出第一液体1的同时在基底4上移动注射构件18以限定第一液体1的连续主体的形状，来提供第一流体1的连续主体。因此，分别使用不同的构件(注射构件18和分隔构件6)来形成初始的连续主体，并且随后将连续主体分成子体。在该情况下，注射构件18的末端不必提供与第二液体接触的表面能量密度低于与第一液体接触的表面能量密度的表面。实际上，在一些实施例中，注射构件18配置成使得注射构件18的末端的至少一部分具有与第一液体接触的表面能量密度低于相对于与第二液体接触的表面能量密度。这是方便的，由于这使得注射构件18可以用于改变早先形成的第一液体1的连续主体或子体的形状，而不需要通过注射构件18注射任何其他第一液体。可将注射构件18与第一液体接触并且随后在基底上拖动(例如同时在基底4上方保持一小段距离)，以便以期望的方式延伸子体的连续主体。例如，注射构件18可用于将之前彼此分隔的两个子体连接在一起。注射构件18可用于将流道的部分连接在一起以改变在使用中配置的微流体布置的功能，以使液体被驱动通过流道流动。注射构件18可用于通过将第一液体1注入第二液体2的层来形成连续主体。如果第一液体1没有将注射构件18的末端润湿至足够的程度，则这将是难以或不可能实现。在实施例中，注射构件18被材料套筒包围，对于该材料套筒，与第二液体接触的表面能量密度低于与第一液体接触的表面能量密度。该套筒可在末端处留下小区域，对于该区域，与第一液体接触的表面能量密度低于与第二液体接触的表面能量密度。该布置有利地促使第一液体1的液滴以可控的方式在末端处形成，而不是倒退运行向上注射构件18。在实施例中，第一液体1包括水性溶液，第二液体2包括碳氟化合物(例如FC40)，分隔构件6包括PTFE并且注射构件18包括不锈钢。不锈钢提供良好的刚度，这允许精确注入第一液体1。
在图14至图15的特定示例中，注射构件18和分隔构件6安装在同一处理头20(见图20)上并且可在基底4上一致地移动。处理头20配置成使得注射构件18和分隔构件6能够选择性地伸出和缩回。因此，如图14所示，在通过从注射构件18的末端喷射出第一液体1而形成初始的连续主体期间，注射构件18可伸出并且分隔构件6缩回。当完成并且期望将连续主体分成子体时，注射构件18可缩回并且分隔构件6伸出。然后，分隔构件6的末端能够移动穿过第一流体1以将第一流体1的连续主体分成子体，如图15所示(其中分隔构件6的末端运动进入页面，如图13和图2)。
在实施例中，如图16中示意性所示，该方法通过从构件(例如如上描述的注射构件18或分隔构件6)的末端喷射出第一液体1并且在基底4上移动构件以限定第一液体1的每个连续主体的形状，适用于同一基底4上的不同位置处形成的第一液体1的多个连续主体。第一液体1的每个连续主体通过表面张力保持固定。该方法允许形成相对于彼此具有不同组成的第一液体1的多个初始连续主体。不同的连续主体可以具有不同的组成，这是由于第一液体1从构件喷射时第一流体1存在刻意的差异，或者在连续主体被划分以产生子体之前可以将不同的物质添加到不同的连续主体中。以这种方式，能够产生多个子体组，其中每组的子体经受相同的初始条件，但是不同组的子体经受不同的初始条件。例如，在第一液体1的每个初始连续主体中提供诸如活细胞的生物材料的情况下，不同的药物添加到两个或更多个初始连续主体中，然后将它们分成子体。在图16的特定示例中，提供了第一液体1的四个连续主体(由实线描绘的较大正方形)。这四个连续主体中的每一个都沿虚线被划分以形成四个正方形阵列中的单独的子体组8A-8D。在实施例中，通过形成含有活细胞的完全相同组成的四个连续主体提供了四个子体组8A-8D。然后，任选地在使活细胞粘附到基底4上之后，将不同的药物添加到完全相同组成的四个连续主体中的每一个中。将四个连续主体划分以形成四个子体组8A-8D，并且在稍后观察以评估不同药物对细胞的影响。
在实施例中，制造的微流体布置包括用于研究感兴趣的材料的多个隔离的样品。该方法的框架在图17中示意性地描绘。在步骤S1中，形成第一液体1的连续主体并布置成包含待研究的材料。在划分连续主体以提供子体之前，将待研究的材料提供在第一液体1的连续主体中。在通过从末端喷射出第一液体1的同时在基底4上移动末端来形成连续主体的情况下，待研究的材料可在第一液体1中提供，同时从末端喷射出第一液体1或可随后添加第一液体1。在步骤S2中，添加第二液体。在步骤S3中，将连续主体分成多个子体。将连续主体分成子体的过程产生多个隔离的样品，每个样品包括一部分待研究的材料，且不需将待研究的材料分别添加到每个样品中，这将是十分耗费时间的，尤其是在产生大量的子体和/或子体非常小的情况下。
在实施例中，待研究的材料包括生物材料。在实施例中，生物材料包括粘附性活细胞。本公开的实施例的方法在该上下文中是特别有利的，由于其允许粘附的活细胞在它们被允许粘附到基底4上之后被全体处理，并且随后被分成多个隔离的样品。使用现有技术的方法是不可能达成这点的，并且该方法节省相当多的时间、降低系统复杂性，尤其是需要产生大量的隔离的样品时。
图18描绘了适用于处理粘附性活细胞的方法的框架。在步骤S11中，形成第一液体1的连续主体并布置为包含粘附性活细胞。在通过从末端喷射出第一液体1的同时在基底4上移动末端来形成连续主体的情况下，粘附性活细胞可在第一液体1中提供，同时从末端喷射出第一液体1或在随后添加第一液体1。在步骤S12中，允许至少一部分粘附性活细胞(任选地大部分粘附性活细胞)粘附到基底4上(例如，这可通过在适当的培养条件下将细胞放置过夜来实现)。当细胞粘附到基底4上达到所需程度时，可以任选地倒出第一液体1，在这种情况下第一液体1可包括合适的生长介质，以留下第一液体1的薄膜，然后进入步骤13。在步骤S13中，将测试物质(例如药物)添加到包含粘附性活细胞的第一液体1的连续主体(其可以是上述倒出之后的薄膜)中。在该阶段可任选地倒出过量的测试物质，以留下第一液体1的薄膜(含有粘附性细胞、生长介质的残余物以及测试物质)。在步骤S14中，添加第二液体2。在步骤S15中，将第一液体1的连续主体分成多个子体。将连续主体分成子体的过程产生多个隔离的样品，每个样品都含有粘附性活细胞和在细胞粘附之后加入的测试物质，而不需要将测试物质单独添加到每个样品中。
图19描绘了适用于形成包含活细胞的隔离的样品的另一种方法的框架。在步骤S21中，形成第一液体1的连续主体并布置成包含活细胞，任选地粘附性活细胞。步骤S21可与如上讨论的步骤S11完全相同。步骤S21还可包括对应于如上讨论的步骤S12和步骤S13中任一个或这两个步骤，使得可以允许粘附性活细胞粘附到基底4和/或可以将测试物质(例如药物)施加到粘附性活细胞。在步骤S22中，添加第二液体2。在步骤S23中，将连续主体分成多个子体。在步骤S24中，移除第二液体2(例如，通过倒出或注射)。也可在该阶段移除第一液体1。然后添加生长介质以覆盖基底4。发明人已经发现，当第一液体1的子体最初形成在第二液体2之下时，将第一液体1的子体的划分线继续充当细胞移动的阻碍，即使第一液体1和第二液体2已经被移除并被生长介质取替时)。不希望受理论束缚的情况下，应当相信的是，基底4的表面被改性和/或留下第一液体1和/或第二液体2的残余物并引起该效果。该结果便利地允许细胞群在彼此分离的区域中培养，从而允许对个体细胞群的多种研究有效地并行进行。例如，在子体最初仅包括单个细胞的情况下，所得到的细胞群将全部源自于相同的单个细胞。
在实施例中，上述方法适用于实施单细胞研究。例如，这可通过在第一液体1的初始的连续主体中提供一定浓度的活细胞来进行，所述活细胞足够低以使得通过划分连续主体而产生的每个子体的平均占有率小于一个活细胞。以此种方式，可以产生包含一个且仅包含一个细胞的子体。该方法比在产生孔(例如，在微孔板中)中需要将细胞单独沉积到隔离的孔中的替代方法快得多。
图20描绘了用于制造微流体布置的装置30。在所示的特定示例中，装置30被配置成执行参考图14和图15如上描述的方法，但是可以被修改以执行根据公开的任何其他实施例的方法。例如，可修改装置30以使用单个分隔构件6，既用于形成第一液体1的初始的连续主体1，又用于将连续主体1分成子体。可替代地或附加地，可使用其他装置元件或简单地通过用第一液体1填充容器的底部(即使第一液体1扩展到容器的侧壁)来形成第一液体1的初始的连续主体。
图20的装置30包括注射系统。注射系统通过穿过注射构件18的末端喷射出第一液体1的同时在基底4上移动注射构件18以限定第一液体1的连续主体的形状，来提供与基底4直接接触的第一流体1的连续主体。注射系统包括注射构件18和泵送系统12。在使用中，泵送系统12将包括容纳第一液体1的储液池、用于将第一液体1从储液池输送至注射构件18的内腔的流道、以及用于将第一液体泵送通过内腔并且离开注射构件18的末端的机构。在实施例中，注射系统可进一步配置成可控地抽取第一液体1，例如通过注射构件18吸入液体来可控地移除多余的第一液体。
在实施例中，装置30配置成在注射构件18的末端和基底4之间保留小然而有限的间隔，同时在基底4上移动注射构件18以形成第一液体1的连续主体。当微流体布置用于基于细胞的研究时这是尤其重要的，其中注射构件18在基底4上与基底4接触拖动，可能导致表面的刮擦或其他改变，这将影响微流体布置。任何这样的改变可对光学接入和/或细胞相容性产生负面影响。在实施例中，这通过在基座中可滑动地安装注射构件18来实现，使得与基底4接触的力将使注射构件18在基座内滑动。通过检测注射构件18相对于基座的滑动来检测注射构件18和基底4之间的接触。当检测到接触时，在注射构件18在基底4上移动以形成第一液体1的连续主体(在该移动期间不接触基底4)之前，注射构件18被拉回少许(例如20-150微米)。相比于诸如在3D打印中使用的电容/感应方法或光学传感技术的替代方法，该控制末端和基底4之间间隔的方法可经济有效地实施。该方法也不需提供导电表面。
图20的装置30还包括分隔系统。分隔系统包括具有末端的分隔构件6。分隔系统配置成通过在基底4的选定区域5上移动分隔构件6的末端穿过第一液体1驱使第二液体2穿过第一液体1并且与基底4在基底4的选定区域5中接触，从而将第一液体1的连续主体划分为第一液体1的多个子体，这些子体被第二液体2彼此分开，其中第二液体2与第一液体1不混溶并且提供与第一液体直接接触且覆盖第一液体1，使得第一液体1仅与第二液体2和基底4接触。可如上所述在第一液体1的连续主体形成之前或之后(通常在之后)提供第二液体2。在实施例中，装置30包括施加系统，用于施加或移除第二液体2(例如包括用于保持第二液体的储液池、可位于基底4上方的输出/吸入喷嘴、以及用于可控地将第二液体通过输出/吸入喷嘴从基底泵出或吸取到储液池/从储液池泵出或吸取到基底的泵出/吸取机构)。在其他实施例中，手动施加第二液体2。
图20的装置30还包括控制器10。控制器10在第一液体1的连续主体形成期间控制注射构件18在基底4上的移动。控制器10还在将第一液体1的连续主体分成第一液体1的多个子体期间控制分隔构件6在基底4上的移动。在实施例中，装置30包括支撑注射构件18和分隔构件6的处理头20。处理头20配置成使得注射构件18和分隔构件6可选择地伸出和缩回。在实施例中，该伸出和缩回由控制器10控制，其中合适的驱动机构安装在处理头20上。提供台架系统(gantry system)14以允许处理头20按需要移动。在所示的特定实施例中，示出了在页面中的左-右移动，然而将领会的是，该移动还可包括进出页面方向的移动以及朝向和远离基底4的移动(如果由处理头20本身提供的注射构件18和分隔构件6的移动不足以提供注射构件18和/或分隔构件6的所需的向上和向下的位移)。

Claims (24)

1.用于制造微流体布置的方法，包括：
提供与基底(4)直接接触的第一液体(1)的连续主体；
提供与所述第一液体(1)直接接触并覆盖所述第一液体的第二液体(2)，使得所述第一液体(1)仅与所述第二液体(2)和所述基底(4)直接接触；以及
驱使所述第二液体(2)穿过所述第一液体(1)并在所述基底(4)的选定区域与所述基底(4)接触，以将所述第一液体(1)的连续主体分成所述第一液体(1)的多个子体(7)，所述第一液体(1)的多个子体(7)被所述第二液体(2)彼此分隔，其中：
所述第一液体(1)与所述第二液体(2)不混溶；以及
表面张力稳定地保持所述第一液体(1)的所述多个子体(7)被所述第二液体(2)彼此分隔；
通过在所述基底(4)的选定区域上移动分隔构件(6)的末端穿过所述第一液体(1)来执行驱使所述第二液体(2)穿过所述第一液体(1)；以及
所述分隔构件(6)的末端的至少一部分具有与所述第二液体(2)接触时低于与所述第一液体(1)接触时的表面能。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
在驱使所述第二液体(2)穿过所述第一液体(1)之前，通过穿过所述分隔构件(6)的末端喷射出所述第一液体(1)的同时在所述基底(4)上移动所述分隔构件(6)以限定所述第一液体(1)的连续主体的形状，来提供所述第一液体(1)的连续主体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在使用所述分隔构件(6)的末端驱使所述第二液体(2)穿过所述第一液体(1)期间，将所述第二液体(2)的一部分吸入所述分隔构件(6)的末端并且保持在所述分隔构件(6)的末端中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中：
通过穿过注射构件的末端喷射出所述第一液体(1)的同时在所述基底(4)上移动所述注射构件以限定所述第一液体(1)的连续主体的形状，来提供所述第一液体(1)的连续主体，所述注射构件与所述分隔构件分离。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将所述第二液体与所述第一液体接触之前，所述第一液体的连续主体形成在所述基底上。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一液体的连续主体主要通过表面张力横向约束。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一液体(1)的连续主体仅与所述基底(4)的基本上平坦的部分和所述第二液体(2)直接接触。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中驱使所述第二液体(2)穿过所述第一液体(1)按顺序包括以下步骤：
将所述第一液体(1)的连续主体对称地分成两个相等体积的子体(7)；以及
将由之前的划分步骤形成的每个子体(7)对称地重复分成另外两个相等体积的子体(7)。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中：
在每个子体和所述基底之间的接触区域包括具有子体覆盖区域轮廓的子体覆盖区域；以及
所述子体覆盖区域的至少一个子集中的每个至少包括一个直线部分。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中：
在每个子体和所述基底之间的接触区域包括具有子体覆盖区域轮廓的子体覆盖区域；以及
所述子体覆盖区域轮廓的至少一个子集相对彼此镶嵌成格纹。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第二液体(2)比所述第一液体(1)密度大。
12.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中选择所述第一液体(1)、所述第二液体(2)和所述基底(4)，使得所述第一液体(1)的液滴在空气中的所述基底(4)上的平衡接触角和所述第二液体(2)在空气中的所述基底(4)上的平衡接触角均小于90度。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中：
通过从构件的末端喷射出所述第一液体(1)并在所述基底(4)上移动构件以限定所述第一液体(1)的每个连续主体的形状，在同一基底(4)上的不同位置处形成所述第一液体(1)的多个连续主体；
每个连续主体最初由所述第二液体(2)覆盖并通过表面张力保持固定；以及
通过驱使所述第二液体(2)穿过所述第一液体(1)并在所述基底(4)的选定区域中与所述基底(4)接触，随后将所述第一液体(1)的每个连续主体分成多个子体(7)，所述多个子体(7)被所述第二液体(2)彼此分隔。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中：
待研究的材料在所述第一液体(1)的连续主体中提供；以及
划分成子体(7)产生多个隔离的样品，每个所述多个隔离的样品含有一部分待研究的材料。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述待研究的材料包括生物材料。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物材料包括粘附性活细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在将所述第一液体(1)的连续主体分成子体(7)之前，允许至少一部分粘附性活细胞粘附到所述基底(4)上。
18.根据权利要求17所述的方法，其中：
在至少一部分粘附性活细胞已经粘附到所述基底(4)上之后，将测试物质添加到所述第一液体(1)的连续主体中；以及
在将所述测试物质已经添加到所述第一液体(1)的连续主体之后，执行划分成子体(7)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述测试物质包括药物。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中在划分成子体(7)之后，用生长介质代替所述第二液体(2)。
21.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含一定浓度下的活细胞，使得每个子体(7)的平均占有率小于一个活细胞。
22.使用任一前述权利要求的方法制造的微流体布置。
23.用于制造微流体布置的装置，包括：
注射系统，所述注射系统配置成通过穿过注射构件的末端喷射出第一液体(1)的同时在基底(4)上移动所述注射构件以限定所述第一液体(1)的连续主体的形状，来提供与基底(4)直接接触的第一液体(1)的连续主体；
分隔系统，所述分隔系统包括具有末端的分隔构件(6)，所述分隔系统配置成用于通过在所述基底(4)的选定区域上移动所述分隔构件(6)的末端穿过第一液体(1)来驱使第二液体(2)穿过所述第一液体(1)并在所述基底(4)的选定区域中与所述基底(4)接触，从而将所述第一液体(1)的连续主体分成所述第一液体(1)的多个子体(7)，所述多个子体(7)被所述第二液体(2)彼此分隔，所述第二液体(2)与所述第一液体(1)不混溶，所述第二液体(2)提供为与所述第一液体(1)直接接触并且覆盖所述第一液体(1)，使得所述第一液体(1)仅与所述第二液体(2)和所述基底(4)直接接触；以及
控制器，所述控制器配置成在所述第一液体(1)的连续主体形成期间控制所述注射构件在所述基底上(4)的移动，以及在将所述第一液体(1)的连续主体分成所述第一液体(1)的多个子体(7)期间控制所述分隔构件(6)在所述基底上(4)的移动；
其中所述分隔构件(6)的末端的至少一部分具有与所述第二液体(2)接触时低于与所述第一液体(1)接触时的表面能。
24.根据权利要求23所述的装置，还包括所述基底(4)、所述第一液体(1)的连续主体和所述第二液体(2)，并且所述第二液体(2)与所述第一液体(1)直接接触并覆盖所述第一液体(1)。
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