CN109641960A - Pd-l1特异性抗体及使用其的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容通常涉及与程序性死亡配体1（PD‑L1）结合的抗体及其功能性结合片段。特别地，本公开的抗体和片段与人PD‑L1结合并且包含本文也公开的新的互补决定区（CDR）。最后，本公开涉及向患有癌症的对象施用本公开的抗体和片段，从而治疗或减缓癌症的进展或增殖。
Description
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交并且通过引用将其全部内容并入本文。在2017年6月19日创建的所述ASCII副本被命名为099263_0802_SL.txt并且其大小为43,085字节。
发明领域
本公开通常涉及结合至程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）的抗体及其功能结合片段。特别地，本公开的抗体和片段结合至人PD-L1并包含新的互补决定区（CDR）。最后，本公开涉及向患有癌症的对象施用所公开的抗体和片段，从而治疗或减缓癌症的进展或增殖。
背景
PD-L1（原名B7-H1）是B7家族成员，在许多类型的细胞（包括抗原递呈细胞（APC）和活化的T细胞）上表达（Yamazaki et al. (2002) J. Immunol. 169:5538）。PD-L1结合至PD-1（CD279）和B7-1。通过PD-L1结合T细胞表达的B7-1，以及通过B7-1结合T细胞表达的PD-L1，都导致T细胞抑制（Butte et al. (2007) Immunity 27: 111）。还有证据表明，与其他B7家族成员一样，PD-L1也能够向T细胞提供共刺激信号（Subudhi et al. (2004) J. Clin.Invest. 113 :694; Tamura et al. (2001) Blood 97: 1809）。此外，还显示PD-L1在细胞表面上的表达通过IFN-γ刺激而上调。
PD-1与其配体伴侣（ligand partner）PD-L1（B7-H1; CD274）和PD-L2（B7-DC;CD273）之间的相互作用，是参与调节T细胞活化的重要的负共刺激信号传递途径。PD-1可以在T细胞、B细胞、天然杀伤T细胞、活化的单核细胞和树突细胞（DC）上表达。PD-1通过活化的、而不是未受刺激的人CD4+和CD8+ T细胞、B细胞和骨髓细胞表达。Nishimura et al.,Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40(2006)。已经从活化的人T细胞中克隆了至少4种PD-1变异体，包括缺少（i）外显子2、（ii）外显子3、（iii）外显子2和3、或（iv）外显子2至4的转录物。Nielsen et al., Cell. Immunol235: 109-16 (2005)。
正常人体组织很少在其细胞表面上表达PD-L1蛋白，除了扁桃体、胎盘、以及肺和肝脏中的小部分巨噬细胞样细胞之外，这表明在正常生理条件下，PD-L1 mRNA处于严格的转录后调节之下。形成鲜明对比的是，如Chen＆Han, Anti - PD-1 /PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. J. CLIN. INVEST. 125, 3384-3391(2015)指出的，PD-L1蛋白在各种人类癌症的细胞表面上大量表达。
另一方面，PD-L2表达比PD-L1更受限制。例如，PD-L2在DC、巨噬细胞和骨髓来源的肥大细胞上可诱导地表达。
另外，一些研究显示，PD-L1的受体不依赖于PD-1。B7.1也被确定为PD-L1的结合伴侣。Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007)。化学交联研究表明，PD-L1和B7.1能够通过其IgV样结构域相互作用。B7.1：PD-L1相互作用能够诱导进入T细胞的抑制信号。通过B7.1在CD4+ T细胞上连接PD-L1，或通过PD-L1在CD4+ T细胞上连接B7.1，都产生抑制信号。当受到抗CD3加B7.1包被的珠子刺激时，缺乏CD28和CTLA-4的T细胞显示增殖和细胞因子产生减少。在缺乏B7.1的所有受体（即CD28、CTLA-4和PD-L1）的T细胞中，抗CD3加B7.1包被的珠子不再抑制T细胞增殖和细胞因子产生。这表明在不存在CD28和CTLA-4的情况下，B7.1通过PD-L1特异性地作用于T细胞。同样地，当在抗CD3加PD-L1包被的珠子的存在下进行刺激时，缺乏PD-1的T细胞显示增殖和细胞因子产生减少，证明PD-L1连接对T细胞上的B7.1的抑制作用。当T细胞缺乏PD-L1的所有已知受体（即，没有PD-1和B7.1）时，抗CD3加PD-L1包被的珠子不再损害T细胞增殖。因此，PD-L1能够通过B7.1或PD-1对T细胞发挥抑制作用。
在人疾病的情况下，已经在几种鼠和人癌症（包括人肺癌、卵巢癌和结肠癌以及各种骨髓瘤）中发现了PD-L1表达（Iwai et al. (2002) PNAS 99: 12293-7; Ohigashi etal. (2005) Clin Cancer Res 1 1 :2947-53）。有人已经表明，PD-L1通过增加抗原特异性T细胞克隆的凋亡而在肿瘤免疫中发挥作用（Dong et al. (2002) Nat Med 8:793-800）。还有人表明，PD-L1可以参与肠粘膜炎症，并且PD-L1的抑制会抑制与结肠炎相关的消耗病（wasting disease）（Kanai et al. (2003) J Immunol 171 :4156-63）。
因此，PD-L1的治疗靶向是一个具有强烈医学意义的领域。PD-L1信号传递的抑制已经被提出作为增强T细胞免疫以治疗癌症（例如肿瘤免疫）和感染（包括急性和慢性（例如持续）感染）的方法。然而，因为迄今为止只有一种靶向的抗PD-L1治疗剂已获得FDA的上市许可，因此存在显著的未满足的医疗需求。
概述
本公开提供了分离的抗体，特别是人抗体，其结合至PD-L1并显示出所需的治疗性质。这些性质包括高亲和力结合至PD-L1（特别是人PD-L1）。
一方面，本公开涉及结合至人程序性死亡配体1（PD-L1）的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段包含重链和轻链，所述重链包含：包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-3和7-9的CDRH1，其中氨基酸4-6不是SSY；包含SEQ ID NO：8的氨基酸9-17的CDRH2；以及包含SEQ ID NO：15的CDRH3；所述轻链包含：包含SEQ ID NO：20的CDRL1；包含SEQ ID NO：21的CDRL2；以及包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的CDRL3。
在一些实施方案中，CDRH1区包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列，并且在一些实施方案中，CDRH2区包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可变重链框架区1包含SEQ ID NO. 26或SEQ ID NO：27。在一些实施方案中，可变重链框架区2包含SEQ ID NO. 28，可变重链框架区3包含SEQ ID NO.29，和/或可变重链框架区4包含SEQ ID NO. 30。
在一些实施方案中，可变轻链框架区1包含SEQ ID NO. 31，可变轻链框架区2包含SEQ ID NO. 32，可变轻链框架区3包含SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO 77或SEQ ID NO. 78，和/或可变轻链框架区4包含SEQ ID NO. 34。
在一些实施方案中，可变重链序列包含选自SEQ ID NO: 36、37、38、39、40和41的氨基酸序列。在其他实施方案中，可变重链序列包含选自SEQ ID NO：51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可变轻链序列包含SEQ ID NO: 42。
在一些实施方案中，抗体或其功能片段表现出抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性，抗体或其功能片段表现出抗肿瘤活性，抗体或其功能片段抑制PD-L1至PD-1的结合，或者抗体或其功能片段阻止PD-1介导的T细胞活化抑制。
在一些实施方案中，抗体或其功能片段是低岩藻糖（low fucose）抗体或其功能片段，并且在一些实施方案中，抗体或其功能片段是去岩藻糖基化的（defucosylated）或非岩藻糖基化的（afucosylated）。
在另一方面，本公开涉及结合至人程序死亡配体1（PD-L1）的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段含有包含SEQ ID NO：35的重链。
在另一方面，本发明涉及结合至人程序死亡配体1（PD-L1）的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段包含重链和轻链，所述重链包含：包含SEQ ID NO: 16的CDRH1、包含SEQ ID NO: 17的CDRH2、以及包含SEQ ID NO: 18的氨基酸6-13的CDRH3，所述轻链包含：包含SEQ ID NO: 23的CDRL1、包含SEQ ID NO: 24的CDRL2、以及包含SEQ ID NO: 25的CDRL3。
在一些实施方案中，CDRH3包含SEQ ID NO: 18，以及在一些实施方案中，CDRH3包含SEQ ID NO: 19。
在一些实施方案中，可变重链框架区1包含SEQ ID NO. 49，可变重链框架区2包含SEQ ID NO. 28，可变重链框架区3包含SEQ ID NO. 50，和/或可变重链框架区域4包含SEQID NO. 30。
在一些实施方案中，可变轻链框架区1包含SEQ ID NO. 45，可变轻链框架区2包含SEQ ID NO. 46，可变轻链框架区3包含SEQ ID NO. 47，和/或可变轻链框架区4包含SEQ IDNO. 34。
在一些实施方案中，可变重链序列包含SEQ ID NO: 48或49，以及在一些实施方案中，可变轻链序列包含SEQ ID NO: 50。
在一些实施方案中，抗体或其功能片段表现出抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性，抗体或其功能片段表现出抗肿瘤活性，抗体或其功能片段抑制PD-L1至PD-1的结合，或者抗体或其功能片段阻止PD-1介导的T细胞活化抑制。
在一些实施方案中，抗体或其功能片段是低岩藻糖抗体或其功能片段，并且在一些实施方案中，抗体或其功能片段是去岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的。
一些实施方案涉及包含本公开的抗体或其功能片段的药物组合物。
另一方面，本公开涉及抑制对象中的癌症细胞增殖的方法，包含将本公开的抗体或其功能片段施用至患有癌症的对象。例如，在一些实施方案中，本公开涉及抑制对象中的肿瘤细胞增殖的方法，包含将结合人PD-L1的抗体或其功能片段施用至患有癌症的对象，所述抗体或其功能片段具有至少2.50×10-8 的KD、以及包含SEQ ID NO: 18的氨基酸6-13的CDRH3。同样地，在一些实施方案中，本公开涉及抑制对象中的癌症细胞增殖的方法，包含将结合人PD-L1的抗体或功能片段施用至患有癌症的对象，所述抗体或功能片段具有至少8.30×10-9的KD以及包含SEQ ID NO: 15的CDRH3。
在一些实施方案中，癌症是血液癌症、神经系统癌症、乳腺癌症、胃肠癌症、肾细胞癌、或泌尿生殖系统癌症。特别地，在一些实施方案中，胃肠癌症是结肠癌；泌尿生殖系统癌症是卵巢癌、前列腺癌或膀胱癌；血液癌症是淋巴瘤、非霍奇金（Non-Hodgkin's）淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、或多发性骨髓瘤；或肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌。
在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤、肺癌（例如非小细胞肺癌）、头颈癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、或血管癌。
在一些实施方案中，癌症是高度免疫原性癌或癌症是表达PD-L1的癌症。
在一些实施方案中，所述方法进一步包含向对象施用另外的治疗化合物的步骤。例如，在一些实施方案中，所述另外的治疗化合物是表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞、肿瘤靶向抗体、免疫应答增强方式（modality）、或小分子药物。
在一些实施方案中，免疫应答增强方式是抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗CD137抗体、或TLR激动剂。
在一些实施方案中，肿瘤靶向抗体是抗CAIX抗体。
在一些实施方案中，小分子药物是肿瘤靶向小分子药物，例如BTK抑制剂、EGFR抑制剂、PARP抑制剂、BET抑制剂、BRAF抑制剂、或PBKδ抑制剂。
前面的综合描述和以下的详细描述是示例性和说明性的，并且旨在提供对要求保护的本公开的进一步说明。从以下对附图的简要描述和本公开的详细描述中，本领域技术人员将容易明白其他目的、优点和新颖特征。
附图说明
图1显示了抗PD-L1抗体对PD-1与PD-L-1 +细胞结合的抑制百分比。使用FACS分析获得结果。
图2显示了示例性的抗PD-L1抗体（CTI-48）针对（A）人PD-L1、（B）鼠PD-L1和（C）猴（cyno）PD-L1的结合动力学。
图3显示了示例性抗的PD-L1抗体CTI-48对具有原代K细胞的PD-L1+淋巴瘤细胞表现出ADCC活性。
图4显示了用选择的抗PD-L1抗体在免疫封锁（immunoblockade）的报道分子（NFAT）生物测定中用PD-L1逆转T细胞抑制。
图5显示了CTI-48和临床对照mAb阻断PD-L1与B7.1的结合。
图6显示了所公开的抗体对IFN-γ生产的影响。将抗体以10 μg/mL的浓度给予进混合的淋巴细胞反应（MLR）培养物。将数据相对于载体对照进行标准化，并以组合的平均值±SEM（n=6）表示。当与适当的同种型对照（hIgG1）比较时，使用Dunnett多重比较事后检验的普通单因素方差分析（one-way ANOVA），* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001表示统计学显著性。该图显示了CTI-48和临床对照mAb的并列比较。
详细说明
除非另有说明，否则本公开的组合物和方法采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，例如，分子克隆：实验手册，第二版（Sambrook et al, 1989）、寡核苷酸合成（M. J. Gait, ed., 1984）、动物细胞培养（R. I. Freshney, ed., 1987）、酶学方法（Academic Press, Inc.）、分子生物学现行方案（F. M. Ausubel et al., eds 1987,并定期更新）、PCR：聚合酶链式反应（Mullis et al., ed., 1994）、分子克隆实用指南（Perbal Bernard V., 1988）、噬菌体展示：实验室手册（Barbas et al , 2001）。
I．定义
应理解，本方法不限于所述的特定实施方案，因为它们可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。本技术的范围仅受所附权利要求的限制。
如本文所用，某些术语可以具有以下定义的含义。如说明书和权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该/所述”包括单数和复数指示物，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一个细胞”包括单个细胞以及多个细胞，包括其混合物。
如本文所用，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由…组成”意味着排除对于所述组合物和方法具有任何重要意义的其他要素。“由…组成”是指排除要求保护的组合物和实质性方法步骤的其他组成部分的微量元素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本公开的范围内。因此，所述方法和组合的意图是能够包括另外的步骤和组分（包含）或者替代地包括不重要的步骤和组合物（基本上由…组成）或者替代地仅包括所述方法步骤或组合物（由…组成）。
如本文所用，“约”是指加或减10%。
如本文所用，“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。
如本文所用，术语“个体”、“患者”、或“对象”可以是个体生物、脊椎动物、哺乳动物（例如牛、犬、猫或马）或人。在优选的实施方案中，个体、患者、或对象是人。
如本文所用，“分离的抗体”意指基本上不含有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体（例如，特异性结合至PD-L1的分离的抗体基本上不含有不结合至PD-L1的抗体）。然而，特异性结合至PD-L1的表位的分离的抗体，可能与其他蛋白质（例如PD-L2或PD-1）以及来自不同物种的蛋白质具有交叉反应性。然而，抗体优选总是结合至人PD-L1的。另外，分离的抗体通常基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“人源化的抗体”是指包含衍生自除人以外的哺乳动物的抗体的CDR、以及人抗体的框架区（FR）和恒定区的抗体。由于人源化的抗体在人体内的抗原性较低，因此人源化的抗体可用作根据本发明的治疗剂中的有效成分。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，包括但不限于（a）从动物（例如小鼠）分离的抗体，该抗体是人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体或由其制备的杂交瘤；（b）从被转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体（例如，来自转染瘤）；（c）从重组、组合人抗体文库分离的抗体；以及（d）通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方式来制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有衍生自人种系和/或非种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在一些实施方案中，这些重组人抗原能够进行体外诱变（或者，当使用转基因人Ig序列的动物时，体内体细胞诱变），因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自人种系VH和VL序列和与之相关的序列，可能不是天然存在于体内人抗体种系库中。
如本文所用，术语“糖基化模式”定义为与蛋白质（更具体地与免疫球蛋白蛋白质）共价连接的碳水化合物单元的模式。
如本文所用，短语“治疗有效量”和“治疗水平”分别表示对象中的药物剂量或血浆浓度，其在需要这种治疗的对象中提供施用药物的特定药理学作用，即减少、改善或消除癌症、恶性疾病或癌症细胞增殖的症状或影响。要强调的是，药物的治疗有效量或治疗水平在治疗本文所述的病症/疾病方面并不总是有效的，即使这种剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量。治疗有效量可以根据施用途径和剂型、对象的年龄和体重、和/或对象的状况（包括癌症、恶性疾病、或癌症细胞增殖的类型和阶段等因素）而变化。
术语“高度免疫原性癌”是指已被T细胞或淋巴细胞浸润或已形成类似淋巴反应的癌症。在许多情况下，认为肿瘤免疫原性与突变率增加有关。通过这种方式，肿瘤具有的突变越多，则肿瘤抗原能够引发免疫应答的机会就越高。
本文所用的关于癌症、恶性疾病或癌症细胞增殖的术语“疗法”或“治疗”，是指减少、改善或消除癌症、恶性疾病或癌症细胞增殖的一种或多种症状或影响。
II．抗PD-L1抗体
除其他原因外，本文提供的抗PD-L1抗体可以被用于治疗癌症等。据信本公开的抗PD-L1抗体通过可归因于PD-L1的至少一种负的共刺激信号的拮抗来增强宿主免疫应答的共刺激。
本公开的抗PD-L1抗体及其功能片段将具有多种用于治疗癌症或恶性疾病的功能性质，包括但不限于具有抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性、具有抗肿瘤活性、抑制PD-L1与PD-1的结合、以及阻止PD-1介导的T细胞活化抑制。
此外，由于通过PD-L1的信号传导（包括阻断PD-L1与PD-1、B7.1或两者相互作用）的拮抗，本公开的抗体和功能片段将阻止PD-L1向T细胞和其他抗原呈递细胞发送负的共刺激信号，从而增强抗肿瘤免疫力和对抗癌症和恶性疾病的免疫防御。此外，本公开的抗PD-L1抗体和功能片段可以与另外的治疗化合物组合，所述另外的治疗化合物包括但不限于CAR T细胞（例如，表达抗CD19、抗CAIX、抗IL13Ra2、或抗PD-L1 CAR的经修饰的T细胞）、其他肿瘤靶向抗体（例如，抗CAIX抗体）、免疫应答增强方式（例如，抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗CD137抗体、或TLR激动剂）、以及小分子药物（例如，BTK抑制剂、EGFR抑制剂、BET抑制剂、PI3Kδ抑制剂、BRAF抑制剂、或PARP抑制剂）。
本公开的抗体可以是多克隆的、单克隆的、嵌合的、人的、部分或完全人源化的、和/或重组体。例如，在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是多克隆抗体或其结合PD-L1的功能片段。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是单克隆抗体或其结合PD-L1的功能片段。在一些实施方案中，抗体及其功能片段可以结合人、猴和/或鼠PD-L1。
多克隆抗体可以通过本领域已知的方法获得，例如通过用PD-L1抗原免疫选择的动物，从该动物收集血清并从该血清中分离和/或纯化抗体。单克隆抗体（mAb）可以通过本领域已知的方法获得，例如，通过将产生抗体的细胞与永生化细胞融合以获得杂交瘤，和/或通过使用组合抗体人库技术，从免疫动物的骨髓和脾细胞中提取的mRNA产生mAb。重组抗体可以通过本领域已知的方法获得，例如，使用噬菌体或酵母展示技术和/或表达或共表达抗体多肽。用于制备抗体的其他技术是本领域已知的，并且可以被用于获得本文所述方法中使用的抗体。
通常，抗体由四种多肽组成：两条相同拷贝数的重（H）链多肽和两条轻（L）链多肽。通常，每条重链含有一个N-末端可变区（VH）和三个C-末端恒定区（CH1、CH2和CH3），每条轻链含有一个N-末端可变区（VL）和一个C-末端恒定区（CL）。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。
如本文所用的，术语“PD-L1结合功能片段”或“功能片段”是指保留结合PD-L1的能力的抗PD-L1抗体的一个或多个片段。结合片段的实施例包括（i）Fab片段（由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段）、（ii）F（ab'）2片段（包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段）、（iii）Fd片段（包含VH和CH1结构域）、（iv）Fv片段（包含抗体单臂的VL和VH结构域）、（v）dAb片段（包含VH结构域）、以及（vi）分离的互补决定区（CDR）（例如VHCDR3）。其他实施例包括单链Fv（scFv）构建体。参见，例如Bird et al., Science, 242:423-26 (1988)、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :5879-83 (1988)。其他实施例包括PD-L1结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含（i）与免疫球蛋白铰链区多肽融合的PD-L1结合结构域多肽（例如重链可变区、轻链可变区、或通过接头肽与轻链可变区融合的重链可变区）、（ii）与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区、以及（iii）与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
可以通过用例如丝氨酸残基取代一个或多个半胱氨酸残基来修饰本公开的抗体的铰链区，以防止二聚化。参见，例如，美国专利申请公开2003/0118592、美国专利申请公开号US 2003/0133939。另外，在一些实施方案中，本公开的抗体可以包含其他突变，包括但不限于具有点突变S239D/I332E、S239D或I332E或其任何组合的IgG1的变体Fc部分、或者具有点突变S228P的IgG4的变体Fc部分。这种修饰可以改变本公开的抗体和功能性片段与Fc受体（FcR）的结合，并且在一些实施方案中，抗体可以被修饰以变得更稳定，而在一些实施方案中，抗体可以被修饰以增强ADCC功能。当确定残基的数目时，可以通过在抗体的序列与“标准”Kabat编号的序列的同源性的区域比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
在一些实施方案中，本公开的抗体的糖基化模式可以被修饰或改变。例如，在一些实施方案中，本公开的抗体及其功能片段可以是低岩藻糖抗体或它们可以是去糖基化的，或者抗体可以以完全缺乏岩藻糖（即非岩藻糖基化的）的方式表达或产生。修饰抗体或功能片段的岩藻糖含量可以通过本领域已知的各种方法完成，例如，在FUT8缺陷或具有FUT8的突变形式的细胞中表达抗体或功能片段。低岩藻糖或去糖基化的抗体和功能片段的ADCC活性增加。除了岩藻糖的改变之外，所公开的抗体和功能片段可以包含对其糖基化模式的其他功能修饰。例如，在位置297（例如N297A和N297Q）的修饰可以完全阻止Fc区的糖基化，从而消除Fc功能、ADCC和CDC。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是CTI-07、CTI-09、CTI-48、CTI-49、CTI-50、CTI-76、CTI-77、CTI-78、CTI-57或CTI-58或其功能片段。表1和2提供了所公开的抗PD-L1抗体及其功能片段的示例性CDR序列。
表1
表2
。
另外，本公开的抗体和功能片段还可以包含各种框架区。例如，在一些实施方案中，本公开的抗体和功能片段包含SEQ ID NO：26-34和/或43-47。在一些实施方案中，框架区的某些改变可能是特别有利的。例如，在抗体的一条重链的框架区的第一个位置用谷氨酸（E）取代谷氨酰胺（Q），能够提高制造的产品稳定性效率。因此，本公开的抗体和片段的一些实施方案将包含这种修饰。因此，在一些实施方案中，本公开的抗体或功能片段的重链将包含SEQ ID NO：36-41，而在其他实施方案中，本公开的抗体或功能片段的重链将包含SEQID NO：48-49或51-56。此外，在一些实施方案中，本公开的抗体或功能片段的重链将包含SEQ ID NO：71-72，或由包含SEQ ID NO：59-68的核酸序列编码的多肽。
在一些实施方案中，本公开的抗体或功能片段的轻链将包含SEQ ID NO：42或50。此外，在一些实施方案中，本公开的抗体或功能片段的轻链将包含由包含SEQ ID NO：69-70的核酸序列编码的多肽。
本领域普通技术人员将理解，可以对本公开的序列进行某些改变而不损害所公开的抗PD-L1抗体和功能片段的结合亲和力或功能。因此，在一些实施方案中，抗PD-L1抗体或功能片段将与本公开的序列共享约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。
在某些实施方案中，本公开提供了编码抗PD-L1抗体或其功能片段的分离的核酸序列，例如SEQ ID NO：59-70。
本公开的抗体及其功能片段可以通过序列或通过功能特征来定义。例如，本公开的抗体及其功能片段的KD值可以为：至少3.0×10-8、至少2.5×10-8、至少2.0×10-8、至少1.5×10-8、至少1.0×10-8、至少0.5×10-8、至少9.95×10-9、至少9.90×10-9、至少9.85×10-9、至少9.80×10-9、至少9.75×10-9、至少9.70×10-9、至少9.65×10-9、至少9.60×10-9、至少9.55×10-9、至少9.5×10-9、至少9.45×10-9、至少9.40×10-9、至少9.35×10-9、至少9.30×10-9、至少9.25×10-9、至少9.20×10-9、至少9.15×10-9、至少9.10×10-9、至少9.05×10-9、至少9.0×10-9、至少8.95×10-9、至少8.90×10-9、至少8.85×10-9、至少8.80×10-9、至少8.75×10-9、至少8.70×10-9、至少8.65×10-9、至少8.60×10-9、至少8.55×10-9、至少8.5×10-9、至少8.45×10-9、至少8.40×10-9、至少8.35×10-9、至少8.30×10-9、至少8.25×10-9、至少8.20×10-9、至少8.15×10-9、至少8.10×10-9、至少8.05×10-9、至少8.0×10-9、至少7.95×10-9、至少7.90×10-9、至少7.85×10-9、至少7.80×10-9、至少7.75×10-9、至少7.70×10-9、至少7.65×10-9、至少7.60×10-9、至少7.55×10-9、至少7.5×10-9、至少7.45×10-9、至少7.40×10-9、至少7.35×10-9、至少7.30×10-9、至少7.25×10-9、至少7.20×10-9、至少7.15×10-9、至少7.10×10-9、至少7.05×10-9、至少7.0×10-9、至少6.95×10-9、至少6.90×10-9、至少6.85×10-9、至少6.80×10-9、至少6.75×10-9、至少6.70×10-9、至少6.65×10-9、至少6.60×10-9、至少6.55×10-9、至少6.5×10-9、至少6.45×10-9、至少6.40×10-9、至少6.35×10-9、至少6.30×10-9、至少6.25×10-9、至少6.20×10-9、至少6.15×10-9、至少6.10×10-9、至少6.05×10-9、至少6.0×10-9、至少5.95×10-9、至少5.90×10-9、至少5.85×10-9、至少5.80×10-9、至少5.75×10-9、至少5.70×10-9、至少5.65×10-9、至少5.60×10-9、至少5.55×10-9、至少5.5×10-9、至少5.45×10-9、至少5.40×10-9、至少5.35×10-9、至少5.30×10-9、至少5.25×10-9、至少5.20×10-9、至少5.15×10-9、至少5.10×10-9、至少5.05×10-9、至少5.0×10-9、至少4.95×10-9、至少4.90×10-9、至少4.85×10-9、至少4.80×10-9、至少4.75×10-9、至少4.70×10-9、至少4.65×10-9、至少4.60×10-9、至少4.55×10-9、至少4.5×10-9、至少4.45×10-9、至少4.40×10-9、至少4.35×10-9、至少4.30×10-9、至少4.25×10-9、至少4.20×10-9、至少4.15×10-9、至少4.10×10-9、至少4.05×10-9、至少4.0×10-9、至少3.95×10-9、至少3.90×10-9、至少3.85×10-9、至少3.80×10-9、至少3.75×10-9、至少3.70×10-9、至少3.65×10-9、至少3.60×10-9、至少3.55×10-9、至少3.5×10-9、至少3.45×10-9、至少3.40×10-9、至少3.35×10-9、至少3.30×10-9、至少3.25×10-9、至少3.20×10-9、至少3.15×10-9、至少3.10×10-9、至少3.05×10-9、至少3.0×10-9、至少2.95×10-9、至少2.90×10-9、至少2.85×10-9、至少2.80×10-9、至少2.75×10-9、至少2.70×10-9、至少2.65×10-9、至少2.60×10-9、至少2.55×10-9、至少2.5×10-9、至少2.45×10-9、至少2.40×10-9、至少2.35×10-9、至少2.30×10-9、至少2.25×10-9、至少2.20×10-9、至少2.15×10-9、至少2.10×10-9、至少2.05×10-9、至少2.0×10-9、至少1.95×10-9、至少1.90×10-9、至少1.85×10-9、至少1.80×10-9、至少1.75×10-9、至少1.70×10-9、至少1.65×10-9、至少1.60×10-9、至少1.55×10-9、至少1.5×10-9、至少1.45×10-9、至少1.40×10-9、至少1.35×10-9、至少1.30×10-9、至少1.25×10-9、至少1.20×10-9、至少1.15×10-9、至少1.10×10-9、至少1.05×10-9、至少1.0×10-9、至少0.95×10-9、至少0.90×10-9、至少0.85×10-9、至少0.80×10-9、至少0.75×10-9、至少0.70×10-9、至少0.65×10-9、至少0.60×10-9、至少0.55×10-9、至少0.5×10-9、至少0.45×10-9、至少0.40×10-9、至少0.35×10-9、至少0.30×10-9、至少0.25×10-9、至少0.20×10-9、至少0.15×10-9、至少0.10×10-9、至少0.05×10-9、至少9.5×10-10、至少9.0×10-10、至少8.5×10-10、至少8.0×10-10、或其间的任何值。例如，本公开的抗体及其功能片段的KD值可以为8.2×10-10、2.31×10-09、8.24×10-09、3.25×10-09、3.46×10-09、1.91×10-09、7.97×10-08、2.41×10-08、9.5×10-10、或8.6×10-10。
同样地，本公开的抗体及其功能片段的IC50值可以为4.0×10-5μg/ml至9.5×10-7μg/ml或其间的任何值。例如，本公开的抗体及其功能片段的IC50值可以为9.19×10-7、4.156×10-5、9.985×10-7、1.037×10-6或3.463×10-6。
抗PD-L1抗体或其PD-L1结合功能片段可以被配制成适合通过预期施用途径施用于目标对象的药物组合物，如下面更详细地讨论的。
III.药物组合物和制剂
适用于本文所述方法的药物组合物可以包括治疗活性剂（例如抗PD-L1抗体或其功能片段）和药学上可接受的载体或稀释剂。
该组合物可以被配制用于静脉内的、皮下的、腹膜内的、肌肉内的、口腔的、鼻的、肺的、眼的、阴道的、或直肠的施用。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体或其功能片段被配制用于静脉内的、皮下的、腹膜内的或肌肉内的施用，例如在溶液、悬浮液、乳液、脂质体制剂等中。使用本领域已知的技术，可以将药物组合物配制成速释组合物、缓释组合物、迟释组合物等。
用于各种剂型的药学上可接受的载体是本领域已知的。例如，已知用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂；已知用于液体制剂的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂和舒缓剂。在一些实施方案中，药物组合物包括一种或多种另外的组分，例如一种或多种防腐剂、抗氧化剂、稳定剂等。
另外，本公开的药物组合物可以被配制成溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质（含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）），以及合适的其混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在一些实施方案中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇（如甘露醇、山梨糖醇）或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂（例如单硬脂酸盐和明胶），可以实现可注射组合物的延长吸收。
可以通过将所需量的活性化合物与上面列举的成分中的一种或组合合并到适当的溶剂中（如果需要），然后进行灭菌微滤，从而制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物合并到无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥（冻干），其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分。
本公开的药物组合物能与其他治疗剂组合施用。例如，组合疗法能包括药物组合物，其包含至少一种本公开的抗PD-L1抗体或其功能片段和至少一种或多种另外的治疗剂，所述另外的治疗剂包括但不限于CAR T细胞（例如，表达抗CD19、抗Her2、抗BCMA、抗CS-1、抗PSCA、抗CAIX，抗IL13R或抗PD-L1 CAR的经修饰的T细胞）、其他肿瘤靶向抗体（例如，抗CAIX抗体）、免疫应答增强方式（例如，抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗CD137抗体或TLR激动剂）和小分子药物（例如，BTK抑制剂、EGFR抑制剂、BET抑制剂、PBKδ抑制剂、BRAF抑制剂或PARP抑制剂）。本发明的药物组合物还能与放射疗法联合施用。
IV.治疗癌症的方法
本文提供了用本公开的抗PD-L1抗体治疗癌症、恶性疾病或癌症细胞增殖的方法。更具体地，本公开内容提供了增强T细胞功能和抗肿瘤免疫力的方法，包含施用治疗有效量的任何上述抗PD-L1抗体或组合物。
增强T细胞功能和抗肿瘤免疫力为治疗癌症、恶性疾病或癌症细胞增殖提供了广谱方法。因此，可以通过施用本公开的抗PD-L1抗体及其功能片段来治疗多种类型的癌症。例如，在一些实施方案中，癌症是血液癌症（例如，淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病或多发性骨髓瘤）、神经系统癌症、乳腺癌症、胃肠癌症（例如结肠癌）、肾细胞癌（例如透明细胞肾细胞癌）、或泌尿生殖系统癌症（例如卵巢癌）。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、肺癌（例如，非小细胞肺癌）、头颈癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、膀胱癌、或血管癌。
在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的癌症是高度免疫原性癌。并且在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的癌症是表达PD-L1的癌症。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应（例如，如肿瘤消退或缓解的治疗反应）。例如，在一些实施方案中，可以施用单次推注，而在一些实施方案中，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以按照情况所示的按比例减少或增加剂量。例如，在一些实施方案中，本公开的抗体或功能片段可以通过皮下或静脉内注射每周施用一次或两次。在一些实施方案中，本公开的抗体或功能片段可以通过皮下注射每月施用一次或两次。在一些实施方案中，本公开的抗体或功能片段可以每周施用一次、每隔一周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每隔一个月施用一次、每三个月施用一次、每四个月施用一次、每五个月施用一次、或每六个月施用一次。
示例性剂量可以根据所治疗个体的尺寸和健康状况以及所治疗的条件而变化。例如，在一些实施方案中，本公开的抗体或功能片段可以以1-100 mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，本公开的抗体和功能片段可以以以下剂量施用：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100mg/kg。
此外，本公开的治疗方法可以另外包含施用除抗PD-L1抗体或其功能片段之外的第二治疗化合物。例如，在一些实施方案中，另外的治疗化合物是CAR-T细胞、肿瘤靶向抗体、免疫应答增强方式、或小分子药物。
在一些实施方案中，本公开的方法可以利用具有各种功能特征的抗体及其功能片段。例如，本公开的方法能够包含的抗PD-L1抗体及其功能片段的KD为：至少3.0×10-8、至少2.5×10-8、至少2.0×10-8、至少1.5×10-8、至少1.0×10-8、至少0.5×10-8、至少9.95×10-9、至少9.90×10-9、至少9.85×10-9、至少9.80×10-9、至少9.75×10-9、至少9.70×10-9、至少9.65×10-9、至少9.60×10-9、至少9.55×10-9、至少9.5×10-9、至少9.45×10-9、至少9.40×10-9、至少9.35×10-9、至少9.30×10-9、至少9.25×10-9、至少9.20×10-9、至少9.15×10-9、至少9.10×10-9、至少9.05×10-9、至少9.0×10-9、至少8.95×10-9、至少8.90×10-9、至少8.85×10-9、至少8.80×10-9、至少8.75×10-9、至少8.70×10-9、至少8.65×10-9、至少8.60×10-9、至少8.55×10-9、至少8.5×10-9、至少8.45×10-9、至少8.40×10-9、至少8.35×10-9、至少8.30×10-9、至少8.25×10-9、至少8.20×10-9、至少8.15×10-9、至少8.10×10-9、至少8.05×10-9、至少8.0×10-9、至少7.95×10-9、至少7.90×10-9、至少7.85×10-9、至少7.80×10-9、至少7.75×10-9、至少7.70×10-9、至少7.65×10-9、至少7.60×10-9、至少7.55×10-9、至少7.5×10-9、至少7.45×10-9、至少7.40×10-9、至少7.35×10-9、至少7.30×10-9、至少7.25×10-9、至少7.20×10-9、至少7.15×10-9、至少7.10×10-9、至少7.05×10-9、至少7.0×10-9、至少6.95×10-9、至少6.90×10-9、至少6.85×10-9、至少6.80×10-9、至少6.75×10-9、至少6.70×10-9、至少6.65×10-9、至少6.60×10-9、至少6.55×10-9、至少6.5×10-9、至少6.45×10-9、至少6.40×10-9、至少6.35×10-9、至少6.30×10-9、至少6.25×10-9、至少6.20×10-9、至少6.15×10-9、至少6.10×10-9、至少6.05×10-9、至少6.0×10-9、至少5.95×10-9、至少5.90×10-9、至少5.85×10-9、至少5.80×10-9、至少5.75×10-9、至少5.70×10-9、至少5.65×10-9、至少5.60×10-9、至少5.55×10-9、至少5.5×10-9、至少5.45×10-9、至少5.40×10-9、至少5.35×10-9、至少5.30×10-9、至少5.25×10-9、至少5.20×10-9、至少5.15×10-9、至少5.10×10-9、至少5.05×10-9、至少5.0×10-9、至少4.95×10-9、至少4.90×10-9、至少4.85×10-9、至少4.80×10-9、至少4.75×10-9、至少4.70×10-9、至少4.65×10-9、至少4.60×10-9、至少4.55×10-9、至少4.5×10-9、至少4.45×10-9、至少4.40×10-9、至少4.35×10-9、至少4.30×10-9、至少4.25×10-9、至少4.20×10-9、至少4.15×10-9、至少4.10×10-9、至少4.05×10-9、至少4.0×10-9、至少3.95×10-9、至少3.90×10-9、至少3.85×10-9、至少3.80×10-9、至少3.75×10-9、至少3.70×10-9、至少3.65×10-9、至少3.60×10-9、至少3.55×10-9、至少3.5×10-9、至少3.45×10-9、至少3.40×10-9、至少3.35×10-9、至少3.30×10-9、至少3.25×10-9、至少3.20×10-9、至少3.15×10-9、至少3.10×10-9、至少3.05×10-9、至少3.0×10-9、至少2.95×10-9、至少2.90×10-9、至少2.85×10-9、至少2.80×10-9、至少2.75×10-9、至少2.70×10-9、至少2.65×10-9、至少2.60×10-9、至少2.55×10-9、至少2.5×10-9、至少2.45×10-9、至少2.40×10-9、至少2.35×10-9、至少2.30×10-9、至少2.25×10-9、至少2.20×10-9、至少2.15×10-9、至少2.10×10-9、至少2.05×10-9、至少2.0×10-9、至少1.95×10-9、至少1.90×10-9、至少1.85×10-9、至少1.80×10-9、至少1.75×10-9、至少1.70×10-9、至少1.65×10-9、至少1.60×10-9、至少1.55×10-9、至少1.5×10-9、至少1.45×10-9、至少1.40×10-9、至少1.35×10-9、至少1.30×10-9、至少1.25×10-9、至少1.20×10-9、至少1.15×10-9、至少1.10×10-9、至少1.05×10-9、至少1.0×10-9、至少0.95×10-9、至少0.90×10-9、至少0.85×10-9、至少0.80×10-9、至少0.75×10-9、至少0.70×10-9、至少0.65×10-9、至少0.60×10-9、至少0.55×10-9、至少0.5×10-9、至少0.45×10-9、至少0.40×10-9、至少0.35×10-9、至少0.30×10-9、至少0.25×10-9、至少0.20×10-9、至少0.15×10-9、至少0.10×10-9、至少0.05×10-9、至少9.5×10-10、至少9.0×10-10、至少8.5×10-10、至少8.0×10-10、或其间的任何值。例如，本公开的方法能够包含的抗PD-L1抗体及其功能片段的KD值为：8.2×10-10、2.31×10-09、8.24×10-09、3.25×10-09、3.46×10-09、1.91×10-09、7.97×10-08、2.41×10-08、9.5×10-10、或8.6×10-10。
同样地，本公开的方法能够包含的抗PD-L1抗体及其功能片段的IC50值可以为4.0×10-5 μg/ml至9.5×10-7 μg/ml或其间的任何值。例如，本公开的方法能够包含的抗PD-L1抗体及其功能片段的IC50值可以为9.19×10-7、4.156×10-5、9.985×10-7、1.037×10-6或3.463×10-6。
在一些实施方案中，免疫应答增强方式能够包含抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗CD137抗体、TLR激动剂或抗CD40抗体。
在一些实施方案中，肿瘤靶向抗体能够包含抗CAIX抗体、抗BCMA、抗CS-1、抗CD20（例如Ublituximab）、抗Her2、抗PCSA或抗FcRL5。
在一些实施方案中，小分子药物能够包含靶向肿瘤的小分子药物，或者例如BTK抑制剂（例如依鲁替尼（ibrutinib））、EGFR抑制剂（例如CK-101）、BET抑制剂（例如CK-103）、PARP抑制剂（例如奥拉帕尼（olaparib）或CK-102）、PDKδ抑制剂（例如TGR-1202）或BRAF抑制剂（例如维莫非尼（Vemurafenib））。
特定治疗方案可以根据其是否改善给定患者的结果来评估，这意味着复发的风险将降低或者给定癌症的无进展存活的可能性将增加。
因此，出于本公开的目的，如果获得了一种或多种有益的或期望的结果（包括期望的临床结果），则治疗了对象。例如，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有该疾病的人的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病的进展、和/或延长个体的存活。
此外，虽然本方法的对象通常是癌症患者，但患者的年龄不受限制。本公开的方法对治疗具有跨所有年龄组和群组的各种复发和预后结果的癌症、恶性疾病或癌症细胞增殖有用。因此，在一些实施方案中，所述对象可以是儿科的对象，而在其他实施方案中，所述对象可以是成年的对象。
给出的以下实施例用于说明本发明。然而，应该理解，本发明不限于这些实施例中描述的具体条件或细节。
实施例
实施例1-用本公开的抗PD-L1抗体治疗癌症患者
该实施例说明了在癌症的治疗中使用抗PD-L1抗体的方法。
给已知患有或疑似患有癌症的患者通过静脉内或皮下注射施用治疗有效量的包含抗PD-L1抗体的药物组合物。用以下与癌症相关的体征和症状的存在和/或严重程度来评估患者：包括但不限于疼痛、虚弱等，并且治疗患者直至一种或多种体征/症状减轻、改善或消除。任选地，可以从患者取样以监测治疗后的癌症进展。任选地，如果体征/症状持续和/或如果癌症进展或复发，则施用药物组合物的另一剂量。
实施例2-优化的抗体的生产
使用来自Pierce的EZ-Link Sulfo-HS- Biotinylation试剂盒对抗原进行生物素化。山羊抗人F（ab'）2 kappa-FITC（LC-FITC）、Extravidin-PE（EA-PE）和链霉亲和素-633（SA-633）分别从Southern Biotech、Sigma和Molecular Probes获得。链霉亲和素MicroBeads和MACS LC分离柱购买自Miltenyi Biotec。
亲和力成熟
使用三种成熟策略进行初始的克隆的结合优化：VH CDRH1/CDRH2的多样化、VH基因的PCR诱变和集中于CDRH3的VH诱变。
CTI-07谱系
优化的第一个循环集中于从文库中选择改进的结合物，其中使用本领域已知的技术通过诱变PCR使CTI-07 VH基因多样化。第1轮：通过在酵母表面上呈现全长CTI-07 IgG的VH突变形式来进行选择。将这些文库与100 nM生物素化的PD-L1温育，然后通过抗-LC FITC试剂（IgG表达）和SA-633（检测抗原结合）和活细胞通过碘化丙啶染色来检测IgG表达。通过FACS来选择表达抗原结合/IgG最多的细胞。第2轮：根据第1轮进行选择，但使用10 nM生物素化的PD-L1以区分抗原结合。第3轮：按照第1轮和第2轮进行文库表达。第3轮使用多特异性试剂（PSR）的应用以从选择输出中去除非特异性抗体（Y. Xu et.al., "Addressing Polyspecificity of Antibodies Selected from an in vitro Yeast PresentationSystem: a FACS-based, High-Throughput Selection and Analytical Tool." PEDS26.10 (2013): 663-70.）。将这些文库与1:10稀释的生物素化PSR试剂温育，通过抗LCFITC试剂（IgG表达）来检测IgG表达，并通过EA-PE（检测抗原结合）和活细胞通过碘化丙啶染色来检测PSR结合。分选IgG阳性、PSR阴性、PI阴性细胞的前1-2％并进行第4轮。第4轮：根据第2轮进行选择，但使用1 nM生物素化的PD-L1来区分抗原结合。将最高/最好的（top）克隆进行铺板，并测序以确定独特的IgG序列。递交独特的IgG序列以用于抗体产生、纯化和表征。
优化的第二个循环集中于从文库中选择改进的结合物，其中VH基因通过诱变PCR而多样化，同时还利用兼并CDRH3寡核苷酸来增加CDRH3内的诱变率。使用本领域熟知的技术进行该扩增技术。第1轮：通过在酵母表面上呈现全长亲本IgG的VH突变形式来进行选择。将这些文库与10 nM生物素化的PD-L1温育，然后通过抗-LC FITC试剂（IgG表达）和SA-633（检测抗原结合）和活细胞通过碘化丙啶染色来检测IgG表达。通过FACS来选择表达抗原结合/IgG最多的细胞。第2轮：根据第1轮进行选择，但使用2 nM生物素化的PD-L1以区分抗原结合。将最好的克隆进行铺板，并测序以确定独特的IgG序列。递交独特的IgG序列以用于抗体产生、纯化和表征。
CTI-09谱系
CTI-09优化使用了CDRH1和CDRH2杂化的应用：通过PCR扩增CTI-09的CDRH3，然后重组到具有1×108的多样性的CDRH1和CDRH2变体的预先制备的载体文库中。第1轮：通过在酵母表面上呈现全长CTI-09 IgG的VH突变形式来进行选择。将这些文库与100 nM生物素化的PD-L1温育。通过Miltenyi MACS系统通过磁分离来选择抗原阳性细胞。简言之，将与b-PD-L1温育的文库与链霉亲和素磁珠温育。在MACS LS柱上捕获酵母/珠复合物，未标记的细胞进入废弃物。然后将b-PD-L1结合细胞洗脱到培养基中以进行选择过程的第2轮的繁殖。第2轮：通过在酵母表面上呈现全长CTI-07 IgG的VH突变形式来进行选择。将这些文库与20 nM生物素化的PD-L1温育，然后通过抗-LC FITC试剂（IgG表达）和SA-633（检测抗原结合）和活细胞通过碘化丙啶染色来检测IgG表达。通过FACS来选择表达抗原结合/IgG最多的细胞。第3轮：按照第1轮和第2轮进行文库表达。第3轮使用了多特异性试剂（PSR）的应用，以从选择输出中去除非特异性抗体（Y. Xu et.al., "Addressing Polyspecificity ofAntibodies Selected from an in vitro Yeast Presentation System: a FACS-based,High- Throughput Selection and Analytical Tool." PEDS 26.10 (2013): 663-70.）。将这些文库与1:10稀释的生物素化PSR试剂温育，通过抗LC FITC试剂（IgG表达）来检测IgG表达，并通过EA-PE（检测抗原结合）和活细胞通过碘化丙啶染色来检测PSR结合。分选IgG阳性、PSR阴性、PI阴性细胞的前1-2％并进行第4轮。第4轮：将所诱导的第3轮输出物与20 nMb-PD-L1温育。沉淀细胞并洗涤以去除任何剩余的b-PD-L1。将该细胞沉淀重悬于1uM未标记的PD-L1中。最好的抗原结合物通过它们随时间保留b-PD-L1抗原的能力来区分。将最好的克隆进行铺板，并测序以确定独特的IgG序列。递交独特的IgG序列以用于抗体产生、纯化和表征。
抗体生产和纯化
使酵母克隆生长至饱和，然后在30℃下振荡诱导48小时。诱导之后，沉淀酵母细胞，收获上清液用于纯化。使用蛋白质A柱纯化IgG，并用pH 2.0的乙酸洗脱。通过木瓜蛋白酶消化来产生Fab片段，并通过KappaSelect（GE Healthcare LifeSciences）进行纯化。
实施例3-具有PD-L1抗体的竞争性FACS
用PD-L1表达载体转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，随后选择用于蛋白质的表达（PD-L1+细胞）。CHO细胞与1 μg/ml生物素标记的PD-1温育1小时。
在与生物素标记的PD-1温育之后，将抗PD-L1抗体以从10 μl/ml开始的4倍稀释添加至上清液，并孵育1小时。洗涤细胞，然后与链霉亲和素-PE接触。通过流式细胞术来分析链霉亲和素-PE染色，以确定抗PD-L1抗体对PD-1结合的抑制百分比。
表3
。
计算几种抗体的IC50值，包括临床对照mAb（由SEQ ID NO：73代表的VH结构域和SEQID NO：74代表的VL结构域定义）、CTI-09、CTI-48、CTI-50和CTI-58，并且可以在表3中找到。图1显示了这项研究的结果。
实施例4-抗体结合动力学、特异性和选择性
Octet数据分析用于确定亲和力测量以评估抗体结合动力学。在动力学缓冲液中以20ug/mL（默认浓度）制备2 mL上样样品。将至少200 uL等分至黑色96孔板中。样品的浓度范围基于相互作用的估计的KD（如果可用）。通常，连续稀释在0.1 KD至10 KD的范围内。使用动力学缓冲液作为样品稀释剂，将7点稀释液制成样品柱。样品柱的最后一个孔在之后数据分析中用作参考，应仅含有动力学缓冲液。
将生物传感器在动力学缓冲液（lx PBS、0.1% BSA、0.02% Tween20、0.05% 叠氮化钠）中在室温下水合10分钟。
表4
。
一种示例性抗PD-L1抗体（CTI-48）的动力学值可以在表4中找到，并且实验结果显示在图2中。
实施例5-抗体结合亲和力
通常如前所述进行ForteBio亲和力测量（参见，例如，Estep et al., 2013）。简而言之，通过将IgG在线加载到AHQ传感器上来进行ForteBio亲和力测量。将传感器在测定缓冲液中离线平衡30分钟，然后在线监测60秒以进行基线建立。将装载有IgG的传感器暴露于100 nM抗原5分钟，然后将它们转移到测定缓冲液中5分钟以进行解离速率测量。使用1：1结合模型来分析动力学。
表5
。
几种示例性抗体的结合值显示在表5中。
实施例6-抗PD-L1抗体的ADCC活性
进行报道分子生物测定从而确定本公开的抗PD-L1抗体的抗体依赖性细胞介导细胞毒性（ADCC）。该测定使用SUDHL-1淋巴瘤细胞和供体PBMC。以1或3 ug/ml的浓度测试各种抗体。
对于图3中的示例性抗-PD-L1抗体（CTI-48）显示了该研究的结果，其由与本公开的抗体孵育4小时后的细胞毒性百分比表示。
实施例7-免疫封锁报道分子测定
在96孔板中使用PD1/PD-L1封锁测定试剂盒（Promega，CS187111）进行免疫封锁测定。在分析中发生三个主要事件。事件1：当通过TCR/TCR激活剂相互作用使工程化的JurkatPD-1效应细胞和aAPC（人工抗原递呈细胞）PD-L1细胞参与时，发生TCR介导的NFAT活化。事件2：当没有封锁抗体存在时，PDAT信号的抑制通过PD-1：PD-L1连接。事件3：通过添加抗PD-1或抗PD-L1封锁抗体回收NFAT信号。
在测定前一天，通过向22.5 mL F-12中加入2.5 mL FBS，在50 mL锥形管中制备25mL细胞回收培养基（10％FBS F-12）用于解冻和使用的PD-L1细胞。从冷冻储存器中取出一小瓶解冻和使用的PD-L1细胞（CS187103）并在干冰上转移到工作台。将病毒在37℃水浴中解冻，直至细胞解冻（约3-4分钟）。通过上下吸移以将细胞悬浮液在小瓶中温和混合，并将所有细胞（0.5 mL）转移至含有14.5 mL细胞回收培养基的标记为“PD-L1细胞”的管中，然后温和倒置。将细胞悬浮液转移至无菌试剂储蓄库。立即使用多通道移液管，每孔加入100 μl细胞回收培养基至测定板的外部孔。将板在CO2培养箱中于37℃温育过夜。
在测定当天，制备新鲜的测定缓冲液（RPMI 1640 + 1% FBS），并在测定缓冲液中对于每种测试抗体以2X的最终浓度制备七点三倍连续的稀释液。从测定板上的所有孔中取出95 μl培养基，并将40 μl测试抗体的连续的稀释液加入到含有PD-L1细胞的孔中。将每孔80 μl测定缓冲液加入每个板的外部孔中。
将解冻和使用的PD-1效应细胞（CS187105）转移到测定板中，并将板在37℃下、在CO2培养箱中温育6小时。诱导6小时后，将测定板从CO2培养箱中取出并在环境温度下平衡5-10分钟。向每个测试孔中加入80 μl的Bio-GloTM试剂，并将板在环境温度下再孵育5-10分钟。在POLARstar Omega读板仪中以0.5秒积分测量发光。
测试了以下抗体：CTI-2、临床对照mAb、CTI-09、CTI-48、CTI-50、CTI-07和CTI-58，终浓度为10 μg/mL、3.33 μg/mL、1.11 μg/mL、0.37 μg/mL、0.123 μg/mL、0.041 μg/mL和0.014 μg/mL。
包括临床对照mAb、CTI-48和CTI-49的示例性抗体的结果显示在下表6中。
表6
。
实施例8-PD-L1/B7.1抑制剂筛选测定
使用市售的可用的测定试剂盒，筛选和分析本公开的抗体的相互作用以及PD-L1/B7.1相互作用。该试剂盒以96孔形式存在，具有生物素标记的B7-1（CD80）、纯化的PD-L1、链霉亲和素标记的HRP、以及用于100个结合反应的测定缓冲液。该试剂盒用于通过链霉亲和素-HRP检测生物素标记的B7.1。
首先，将PD-L1涂覆在96孔板上。接下来，向每个孔中加入本公开的抗体之一、阳性对照、底物对照或空白，并在温育后加入B7.1-生物素。最后，用链霉亲和素-HRP处理平板，然后加入HRP底物以产生化学发光，然后可以使用化学发光读数器测量。
测试了以下抗体在30 μg/mL、10 μg/mL、3.33 μg/mL、1.11 μg/mL、0.37 μg/mL和0.123 μg/mL的浓度之下对PD-L1和B7.1的结合的抑制作用：CTI-1、CTI-2、CTI-33、CTI-48和CTI-55。
示例性结果表明，本公开的抗体的结合抑制的IC50在0.1816和0.5056 μg/mL之间。例如，计算得CTI-48的IC50为0.1816 μg/mL。CTI-48和临床对照mAb的活性的比较显示在图5中。
实施例9-抗体对IFN-γ生产的影响
将抗体给予进混合的淋巴细胞反应（MLR）培养物，从而确定本公开的抗体对IFN-γ生产的影响。在用浓度为10 μg/mL的抗体进行4天MLR培养后，测定IFN-γ生产的倍数变化。示例性结果，包括适当的同种型对照（hIgG1）的结果。如图6所示，CTI-48诱导了对临床对照mAb的可比较的反应，并且测试的抗体中的许多引起IFN-γ生产的统计学上的显著增加，包括CTI-33和CTI-55比对照水平增加约10倍。
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说明书中提及的所有专利和出版物表示本公开所属领域的普通技术人员的水平。所有专利和出版物通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物被特别地和单独地通过引用并入。
此外，本领域技术人员容易理解，本公开非常适合于实现所述目的并获得所提到的目标的和优点，以及其中固有的目的和优点。本领域技术人员将想到其中的修改和其他用途。这些修改包含在本公开的精神内，并且由权利要求的范围限定，权利要求书阐述了本公开的非限制性实施方案。
Claims (24)
1. 一种结合至人程序性死亡配体1（PD-L1）的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段包含：
重链，其包含：包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-3和7-9的CDRH1，其中氨基酸4-6不是SSY；包含SEQ ID NO：8的氨基酸9-17的CDRH2；以及包含SEQ ID NO：15的CDRH3；以及
轻链，其包含：包含SEQ ID NO：20的CDRL1；包含SEQ ID NO：21的CDRL2；以及包含SEQID NO：22、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的CDRL3。
2. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中CDRH1区包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中CDRH2区包含选自SEQ ID NOS：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变重链框架区1包含SEQ ID NO.26。
5. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变重链框架区1包含SEQ ID NO.27。
6. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变重链框架区2包含SEQ ID NO.28。
7. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变重链框架区3包含SEQ ID NO.29。
8. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变重链框架区4包含SEQ ID NO.30。
9. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变轻链框架区1包含SEQ ID NO.31。
10. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变轻链框架区2包含SEQ ID NO.32。
11. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变轻链框架区3包含SEQ ID NO.33、SEQ ID NO. 77、或SEQ ID NO. 78。
12. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变轻链框架区4包含SEQ ID NO.34。
13. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变重链序列包含选自SEQ IDNO：36、37、38、39、40和41的氨基酸序列。
14. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变重链序列包含选自SEQ IDNO：51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。
15. 根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中可变轻链序列包含SEQ ID NO：42。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体或其功能片段。
17. 一种结合至人程序性死亡配体1（PD-L1）的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段含有包含SEQ ID NO：35的重链。
18. 一种抑制对象中的癌症细胞增殖的方法，包含向患有癌症的对象施用结合人PD-L1的抗体或功能片段，所述抗体或功能片段具有至少为8.30×10-9的KD以及包含SEQ IDNO：15的CDRH3。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述癌症是血液癌症、神经系统癌症、乳腺癌症、胃肠癌症、肾细胞癌、或泌尿生殖系统癌症。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法进一步包含向所述对象施用另外的治疗化合物的步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述另外的治疗化合物是CAR-T细胞、肿瘤靶向抗体、免疫应答增强方式、或小分子药物。
22. 一种抑制对象中的肿瘤细胞增殖的方法，包含向患有癌症的对象施用结合人PD-L1的抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段具有至少为2.50×10-8的KD以及包含SEQID NO：18的氨基酸6-13的CDRH3。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法进一步包含向所述对象施用另外的治疗化合物的步骤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述另外的治疗化合是CAR-T细胞、肿瘤靶向抗体、免疫应答增强方式、或小分子药物。
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