CN109632676A - 一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，对于经过固定化发酵后的海藻酸钠微胶囊，使用无氧柠檬酸钠溶液在加热条件下使微胶囊溶解，取溶解液测定有机磷含量，用囊内有机磷量表征囊内菌量。由于菌体的含磷量相对稳定，因此可用有机磷量表征菌量。此外，本发明的海藻酸钠囊膜溶解方法可避免囊膜溶解时有机磷向无机磷的转化，不影响总磷及无机磷含量的测定。整个测定过程操作便捷、快速准确、易于实现。

Description

一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法
技术领域
本发明属于测定菌量测定技术领域，具体涉及一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法。
背景技术
菌量测定的方法很多，如：氨基葡萄糖法、麦角固醇法、称干重法、qPCR法等。对于细菌和真菌的快速测定，均有不足之处，如：麦角固醇法不适于细菌菌量的测定；氨基葡萄糖法测定时间长；称干重法仅适用于液态游离发酵；qPCR法成本较高。
对于海藻酸钠固定化细胞微胶囊而言，欲测定其囊膜内菌量，必先将膜溶解，而溶解囊膜的方法可能对菌量的测定造成干扰，因此需要构建合适的溶解囊膜和测定菌量的方法。
对于细胞而言，含磷化合物主要为：核酸、ATP、细胞膜中的磷脂双分子层，细菌的细胞壁还含有磷壁酸。总体而言，细胞的含磷量相对稳定，并随着菌量的增加而成比例增加。因此，利用有机磷表征菌量是一种合理的方法。
有机磷的直接测定较为困难，一般通过总磷量减去无机磷量进行间接测定。对无机磷进行测定时，必须避免有机磷和无机磷之间的转化。海藻酸钠微胶囊的囊膜溶解方法可以使用高温、强碱、金属离子螯合剂等方法，而强碱（pH＞11）或有氧高温条件下可引起有机磷向无机磷的转化，因此在对囊膜进行溶解时，应避免上述情况发生。
发明内容
针对现有技术不足，本发明根据海藻酸钠的理化性质及细胞的含磷量相对稳定的特点，提供一种快速测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法：将海藻酸钠微胶囊溶解，取溶解液进行有机磷的测定，用囊内有机磷量表征囊内菌量，整个操作过程具体包括以下步骤：
（1）各种试剂的配置：
①无氧柠檬酸钠溶液：准确称取0.2moL柠檬酸钠，用煮沸冷却后的去离子水定容至1L，100W超声20min再次排除氧气。
②27wt.%无氧硫酸溶液：在煮沸冷却后的去离子水中缓慢加入98wt%浓硫酸，使浓硫酸浓度稀释至27wt%，100W超声20min再次排除氧气。
③标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于100mL蒸馏水中，转移到容量瓶中并定容至500mL，临用时稀释20倍。
（2）海藻酸钠微胶囊的溶解：将海藻酸钠微胶囊放置于25~100倍体积的0.2mol/L的无氧柠檬酸钠溶液中沸水浴5min，使微胶囊裂解并完全溶于柠檬酸钠溶液。
（3）有机磷量=总磷量-无机磷量。磷元素含量与吸光值之间的标准曲线的绘制：分别移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的标准磷溶液，依次加入0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液，补水至5mL，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值，绘制后如图1所示。
（4）总磷的测定：取1mL步骤（2）裂解液加2.5mL 27wt%无氧硫酸和玻璃珠1颗，高温消化至溶液澄清，然后稀释至10mL，取1mL稀释液依次加0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液、2.9mL的去离子水，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值。
（5）无机磷的测定：1mL裂解液依次加0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液，2.9mL的去离子水，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值。
（6） 有机磷量与菌量的换算：用离心无沉淀液态培养基液态发酵微生物，用上述方法测定发酵液中的有机磷含量，同时对发酵液进行烘干称菌体干重，即菌量，绘制菌量与有机磷量的标准曲线，最后换算成菌量与吸光值之间的标准曲线。在获得微胶囊内有机磷含量的对应吸光值的基础上，即得囊内的菌量。
本发明的有益效果在于:
（1）由于菌体的代谢活动，会将培养基中的无机磷转化成有机磷，并且菌内有机磷成分（核酸、ATP、磷酸双分子层等）含量相对稳定，能够用有机磷准确定量表征菌量。
（2）微胶囊的囊膜溶解并不影响有机磷转化为无机磷，即不影响后续实验的测定；有机磷的测定方法为比色法，操作简单易行。
附图说明
图1 磷元素含量与吸光值之间的关系曲线。
图2 红曲霉菌量与有机磷含量之间的关系曲线。
图3 红曲霉菌量与吸光值之间的关系曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1 红曲霉微胶囊囊内菌量的测定
（1）各种试剂的配置：
①无氧柠檬酸钠溶液：准确称取0.2moL柠檬酸钠，用煮沸冷却后的去离子水定容至1L，100W超声20min再次排除氧气。
②27wt%无氧硫酸溶液：在煮沸冷却后的去离子水中缓慢加入98wt%浓硫酸，使浓硫酸浓度稀释至27wt%，100W超声20min再次排除氧气。
③标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，临用时稀释20倍。
（2）海藻酸钠微胶囊的溶解：将海藻酸钠微胶囊放置于75倍体积的0.2mol/L的无氧柠檬酸钠溶液中沸水浴5min，使微胶囊裂解并完全溶于柠檬酸钠溶液。
（3）有机磷量=总磷量-无机磷量。磷元素与吸光值之间的标准曲线的绘制：分别移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的标准磷溶液，依次加入0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液，补水至5mL，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值。
（4）总磷的测定：取1mL步骤（2）裂解液加2.5mL 27wt%无氧硫酸和玻璃珠1颗，高温消化至溶液澄清，然后稀释至10mL，取1mL稀释液依次加0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液，2.9mL的去离子水，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值。
（5）无机磷的测定：1mL步骤（2）裂解液依次加0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液，2.9mL的去离子水，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值。
（6）有机磷量与菌量的换算：用察式液态培养基摇瓶发酵红曲霉，用上述方法测定发酵液中的有机磷含量，同时对发酵液进行烘干称菌体干重，即菌量，绘制菌量与有机磷量的标准曲线，如图2，最后换算成菌量与吸光值之间的标准曲线，如图3。在获得微胶囊内有机磷含量的对应吸光值的基础上，即得囊内的菌量。其中，察式培养基的配置方法如下：硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，加水溶解定容至1L，121℃灭菌20min。
为了说明柠檬酸钠溶液热解微胶囊并不影响有机磷含量的测定，做了如下验证实验，结果如表1所述：
发酵液-处理组：对红曲霉发酵液进行柠檬酸钠热解后测定有机磷量
发酵液-对照组：对红曲霉发酵液直接测定有机磷量
上述两组实验的结果说明囊膜的溶解过程并没有发生有机磷向无机磷的转化。同时还对空心海藻酸钠微胶囊进行了磷含量的测定，实验结果说明海藻酸钠空心微胶囊本身不含磷，并不影响实验的测定。
表1 各实验组磷含量（n=3）
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：将海藻酸钠微胶囊溶解，取溶解液进行有机磷的测定，根据囊内有机磷量换算囊内菌量。
2.根据权利要求1所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：海藻酸钠微胶囊溶解方法为将海藻酸钠微胶囊放置于25~100倍体积的0.2mol/L的无氧柠檬酸钠溶液中沸水浴5min，使微胶囊裂解并完全溶于柠檬酸钠溶液，即得溶解液。
3.根据权利要求2所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：无氧柠檬酸钠溶液为准确称取0.2moL柠檬酸钠，用煮沸冷却后的去离子水定容至1L，100W超声20min再次排除氧气。
4.根据权利要求1所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：有机磷的测定方法为基于比色法对磷元素含量进行测定，有机磷量=总磷量-无机磷量。
5.根据权利要求4所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：总磷量的测定方法，取1mL溶解液或待测液加2.5mL 27wt.%无氧硫酸溶液和玻璃珠1颗，高温消化至溶液澄清，然后稀释至10mL，取1mL稀释液依次加0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液，2.9mL的去离子水，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值。
6.根据权利要求4所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：无机磷量的测定方法，1mL溶解液或待测液依次加0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液，2.9mL的去离子水，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值。
7.根据权利要求4所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：磷元素含量的标准曲线的绘制方法如下：分别移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的标准磷溶液，依次加入0.5mL的6mol/L硫酸溶液、0.5mL的25g/L钼酸铵溶液、0.1mL10%的抗坏血酸溶液，补水至5mL，50℃水浴15min后测定660nm处的吸光值。
8.根据权利要求5所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：无氧硫酸溶液是在煮沸冷却后的去离子水中缓慢加入98wt.%浓硫酸，使浓硫酸浓度稀释至27wt.%，100W超声20min再次排除氧气。
9.根据权利要求7所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：标准磷溶液，将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于100mL蒸馏水中，转移到容量瓶中并定容至500mL，临用时稀释20倍。
10.根据权利要求1所述的一种测定海藻酸钠微胶囊内菌量的方法，其特征在于：有机磷量换算囊内菌量方法，用离心无沉淀液态培养基液态发酵微生物，测定发酵液中的有机磷含量，同时对发酵液进行烘干称菌体干重，即菌量，绘制菌量与有机磷量的标准曲线，最后换算成菌量与吸光值之间的标准曲线，在获得微胶囊内有机磷含量的对应吸光值的基础上，即得囊内的菌量。
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