CN109628401A - 一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液的制备方法及诱导液的应用，属于生物模型建立技术领域。本发明所述诱导液包括硬脂酸的去脂牛血清白蛋白溶液，所述硬脂酸在所述诱导液中的浓度为50～200μmol/L。本发明通过硬脂酸诱导肝细胞脂肪样变，建模成功率高，条件要求低、方法简便、造模周期短、重复性好，为研究非酒精性脂肪肝病发生、发展提供了靶向工具，进一步了解肝病发生机制，为开发抗肝损伤药物提供新的作用靶点，为临床上非酒精性脂肪性肝病的防治提供新的思路和途径。

Description

一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物模型建立技术领域，具体涉及一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液及其制备方法和应用。
背景技术
随着全球肥胖人群的不断增多，非酒精性脂肪肝病已成为一种常见疾病，其发病呈现逐年上升趋势。目前全世界约20～30％的成年人可能患有非酒精性脂肪肝病，其中大部分处于单纯脂肪肝阶段，其早期不会出现严重的症状或肝功能损害，因此并未得到足够的重视。而单纯脂肪肝中又有约20％的人可能会在数年内进展为脂肪性肝炎患者甚至是肝硬化和肝癌。近年来，多项研究表明，非酒精性脂肪肝患者常与肥胖、高血糖、高血脂、高血压等疾病伴随发生，与2型糖尿病、代谢综合征以及心、脑血管疾病密切相关。非酒精性脂肪肝与2型糖尿病的共同发病机制是胰岛素抵抗，两者相互促进，相互恶化，已成为近年来临床治疗的新挑战。
目前，用于非酒精性脂肪变肝病的细胞模型常用高脂培养基(油酸、棕榈酸)、不含脂肪酸的高脂培养基(50％胎牛血清)、葡萄糖或胰岛素培养基诱导细胞内甘油三酯升高。目前非酒精性脂肪变肝病细胞模型通过上述诱导方式所建立的细胞模型均较稳定，重复性较好，但是方法复杂，对条件要求高，且建模周期长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液及其制备方法和应用，利用所述诱导液建模时，条件要求低，方法简便，造模周期短，建模成功率高，重复性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液，所述诱导液包括硬脂酸的去脂牛血清白蛋白溶液，所述硬脂酸在所述诱导液中的浓度为50～200μmol/L。
本发明提供了一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液的制备方法，包括以下步骤：
1)将硬脂酸与氢氧化钠溶液混合后进行皂化，得皂化液；所述硬脂酸与氢氧化钠溶液的质量体积比为1g：(170～185)mL；
2)将所述皂化液与质量浓度为35～43％的去脂牛血清白蛋白溶液等体积混合后，得诱导液母液；
3)用体积分数为7～12％的胎牛血清培养基对所述诱导液母液进行稀释，得诱导液。
优选的，步骤1)所述氢氧化钠溶液的浓度为0.08～0.15mol/L。
优选的，所述皂化反应的温度为95～110℃，所述皂化反应的时间为7～15min。
本发明还提供了上述诱导液或利用上述制备方法制备得到的诱导液在建立非酒精性脂肪肝病细胞模型中的应用。
优选的，所述建立非酒精性脂肪肝病细胞模型的方法，包括以下步骤：利用所述诱导液对HepG2细胞作用24～72h，得非酒精性脂肪肝病细胞模型。
优选的，所述HepG2细胞处于对数期。
本发明提供了一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液及其制备方法和应用，本发明所述诱导液的制备方法解决了硬脂酸难溶于培养基的问题，且硬脂酸母液可直接加入胎牛血清培养基稀释成不同浓度的硬脂酸工作液，不同浓度的硬脂酸工作液作用HepG2细胞24～72h即可得到具有时间依赖性和浓度依赖性的脂肪样变细胞模型，建模成功率高。
附图说明
图1为不同浓度硬脂酸(0、50、100、200uM)作用HepG2细胞24h，油红O染色图；
图2为用100μM硬脂酸作用HepG2细胞不同时间(24、48、72h)时，油红O染色图。
具体实施方式
本发明提供了一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液，所述诱导液包括硬脂酸的去脂牛血清白蛋白溶液，所述硬脂酸在所述诱导液中的浓度为50～200μmol/L。
本发明提供了一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液的制备方法，包括以下步骤：
1)将硬脂酸与氢氧化钠溶液混合后进行皂化，得皂化液；所述硬脂酸与氢氧化钠溶液的质量体积比为1g：(170～185)mL；
2)将所述皂化液与质量浓度为35～43％的去脂牛血清白蛋白溶液等体积混合后，得诱导液母液；
3)用体积分数为7～12％的胎牛血清培养基对所述诱导液母液进行稀释，得诱导液。
在本发明所述非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液的制备方法中，将硬脂酸与氢氧化钠溶液混合后进行皂化，得皂化液；所述硬脂酸与氢氧化钠溶液的质量体积比为1g：(170～185)mL。本发明所述硬脂酸与氢氧化钠溶液的质量体积比优选为1g：(172～180)mL，更优选为1g：(175～178)mL，最优选为1g：176mL。本发明所述氢氧化钠溶液的浓度优选为0.08～0.15mol/L，更优选为0.09～0.12mol/L，最优选为0.1mol/L。本发明所述皂化反应优选在水浴中进行，所述皂化反应的温度优选为95～110℃，更优选为98～105℃，最优选为100℃。本发明所述皂化反应的时间优选为7～15min，更优选为8～12min，最优选为10min。本发明所述皂化液优选为无色澄清液体。
得皂化液后，本发明将所述皂化液与质量浓度为35～43％的去脂牛血清白蛋白溶液等体积混合后，得诱导液母液。本发明所述去脂牛血清白蛋白溶液中去脂牛血清白蛋白的质量分数优选为38～42％，更优选为40％。本发明所述混合后优选还包括室温冷却。本发明对所述去脂牛血清白蛋白溶液的制备方法并没有特殊限定，优选利用本领域的常规去脂牛血清白蛋白溶液即可。
得诱导液母液后，本发明用体积分数为7～12％的的胎牛血清培养基对所述诱导液母液进行稀释，得诱导液。本发明所述胎牛血清培养基中脂牛血清的体积分数优选为8～11％，更优选为10％。本发明对所述胎牛血清培养基的制备方法并没有特殊限定，优选利用本领域的常规的胎牛血清培养基即可。
本发明还提供了利用上述诱导液或利用上述制备方法制备得到的诱导液在建立非酒精性脂肪肝病细胞模型中的应用。本发明所述建立非酒精性脂肪肝病细胞模型的方法，包括以下步骤：利用所述诱导液对HepG2细胞作用24～72h，得非酒精性脂肪肝病细胞模型。本发明所述HepG2细胞优选处于对数期。本发明所述非酒精性脂肪肝病细胞模型为时间依赖性和浓度依赖性的脂肪肝病细胞模型。
下面结合实施例对本发明提供的一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液的制备方法及诱导液的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)制备40％去脂牛血清白蛋白：PBS溶液预热至55℃，量取1.2g去脂牛血清白蛋白，置于15mL离心管，加入2mL PBS溶液，不要震荡或者混匀，直接放于高速离心机8000rpm离心20min，即可完全溶解，用PBS定容至3mL。得到3mL质量浓度为40％的去脂牛血清白蛋白溶液，外观呈棕黄色澄清样；
2)配制20mM硬脂酸溶液：取0.04g氢氧化钠，溶解于10mL去离子水，配成0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL，取3mL。称取0.017g硬脂酸加入3mL氢氧化钠溶液中，置于100℃水浴进行充分皂化10分钟，最终至无色透明澄清，得到20mM硬脂酸钠皂化液。
3)将保温的硬脂酸溶液迅速地加入质量浓度为40％血清白蛋白溶液，得到6mL10mM硬脂酸溶液。适当摇匀，置于低于55℃条件下助溶30min(实际操作也可不助溶)。室温冷却后观察性状，为棕黄色澄清样，与原去脂白蛋白溶液性状无差异，无任何固体或者絮状杂质，性状稳定。
实施例2
将10mM硬脂酸溶液按50、100、200倍，用体积分数为10％的胎牛血清培养基稀释成浓度为200μM、100μM、50μM的硬脂酸工作液，分别对生长处于对数期的HepG2细胞作用24h，以上实验重复3次，行油红O染色，结果如图1所示，可见200μM、100μM、50μM的硬脂酸工作液均可以建模成功。
实施例3
将10mM硬脂酸溶液按100倍，用体积分数为10％的胎牛血清培养基稀释成浓度为100μM的硬脂酸工作液，生长处于对数期的HepG2给予100μM的硬脂酸分别作用0、1、2、3天，以上实验重复3次后，行油红O染色，结果如图2所示，在作用0d时，已经建模成功。
本发明提供了一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液的制备方法及诱导液的应用，能通过硬脂酸诱导肝细胞脂肪样变，通过油红O染色确定模型建立成功，为研究非酒精性脂肪性肝病发生、发展的潜在分子机制提供了靶向工具，可以进一步了解肝病的发生机制，为开发抗肝损伤药物提供新的作用靶点，为临床上非酒精性脂肪性肝病的防治提供新的思路和途径。同时非酒精性脂肪肝病细胞模型建模的成功率高，并且条件要求低、方法简便、造模周期短、重复性好，有明显脂肪样变，足以供给非酒精性脂肪肝病实验的需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液，其特征在于，所述诱导液包括硬脂酸的去脂牛血清白蛋白溶液，所述硬脂酸在所述诱导液中的浓度为50～200μmol/L。
2.一种非酒精性脂肪肝病细胞模型诱导液的制备方法，包括以下步骤：
1)将硬脂酸与氢氧化钠溶液混合后进行皂化，得皂化液；所述硬脂酸与氢氧化钠溶液的质量体积比为1g：(170～185)mL；
2)将所述皂化液与质量浓度为35～43％的去脂牛血清白蛋白溶液等体积混合后，得诱导液母液；
3)用体积分数为7～12％的胎牛血清培养基对所述诱导液母液进行稀释，得诱导液。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1)所述氢氧化钠溶液的浓度为0.08～0.15mol/L。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述皂化反应的温度为95～110℃，所述皂化反应的时间为7～15min。
5.权利要求1所述诱导液或利用权利要求2～4任一项所述制备方法制备得到的诱导液在建立非酒精性脂肪肝病细胞模型中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述建立非酒精性脂肪肝病细胞模型的方法，包括以下步骤：利用所述诱导液对HepG2细胞作用24～72h，得非酒精性脂肪肝病细胞模型。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述HepG2细胞处于对数期。
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